瓊脂糖凝膠電泳的操作步驟

1、瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。對于分子 量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進 行電泳分離。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝 膠低，但它制備容易，分離范圍廣，尤其適于分離大片段 DNA。普通瓊脂糖凝 膠分離DNA的范圍為0.2-20kb,利用脈沖電泳，可分離高達10A7bp的DNA片段。操作流程準備干凈的配膠板和電泳槽注意DNA酶污染的儀器可能會降解DNA，造成條帶信號弱、模糊甚至缺失 的現(xiàn)象。選擇電泳方法一般的核酸檢測只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；如果需要分辨率高的電 泳，特別是只有幾個 bp 的差別

2、應該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳；用普通電泳不合 適的巨大DNA鏈應該使用脈沖凝膠電泳。注意巨大的 DNA鏈用普通電泳可能跑 不出膠孔導致缺帶。正確選擇凝膠濃度對于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.52%之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進行小 片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質量好的瓊脂糖是解決辦法。注意 高濃度的膠可能使分子大小相近的 DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。適合的電泳緩沖液常用的緩沖液有TAE和TBE而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時 使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，PH值上升，緩沖性能下降，可能使 DNA電

3、泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則 的DNA帶遷移的現(xiàn)象。電泳的合適電壓和溫度電泳時電壓不應該超過20V/cm，電泳溫度應該低于30C，對于巨大的DNA 電泳，溫度應該低于15C。注意如果電泳時電壓和溫度過高，可能導致出現(xiàn)條 帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導致小片段跑出膠 而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象DNA樣品的純度和狀態(tài)是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象DNA樣品的純度和狀態(tài)注意樣品中含鹽量太高和含雜質蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。 乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對 DN

4、A樣品加熱，用20mM NaCI緩沖液稀釋可以防止DNA變性。DNA的上樣正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的 DNA上樣量可能導致 DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚至缺失。TIANGEN公司 DNA分子量標準每次上樣6ul即可得到清晰均勻的條帶。Marker 的選擇DNA電泳一定要使用 DNAMarker或已知大小的正對照 DNA來估計DNA片 段大小。 Marker 應該選擇在目標片段大小附近 ladder 較密的，這樣對目標片段 大小的估計才比較準確。TIANGEN公司的DNA Marker條帶清晰，亮度均勻，質 量穩(wěn)定，是您實驗的首選。需要注意的是 Mar

5、ker的電泳同樣也要符合DNA電 泳的操作標準。如果選擇 入DNA/HindII或者入DNA/EcoR勺酶切Marker，需要預 先65C加熱5min，冰上冷卻后使用。從而避免 HindHI或EcoRI酶切造成的粘性 接頭導致的片段連接不規(guī)則或條帶信號弱等現(xiàn)象。凝膠的染色和觀察實驗室常用的核酸染色劑是溴化乙啶（EB）,染色效果好，操作方便，但 是穩(wěn)定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green GelRed雖然毒性小，但價格昂貴。TIANGEN公司的GeneGreen相比則是性價比高的低毒替代染料， 其靈敏度比傳統(tǒng)EB染料高10倍以上。注意觀察凝膠時應根據(jù)染料不同使用合 適的光源和激發(fā)波

6、長，如果激發(fā)波長不對，條帶則不易觀察，出現(xiàn)條帶模糊的 現(xiàn)象。步驟如下：1制備1%瓊脂糖凝膠（大膠用70ml,小膠用50ml）:稱取0.7 g（0.5 g）瓊脂糖置于錐形瓶中，加入70 ml（50ml）1 x TAE倒扣小燒杯.微波爐加 熱煮沸 3 次至瓊脂糖全部融化 ,搖勻,即成1.0%瓊脂糖凝膠液 .2. 膠板制備 :取電泳槽內的有機玻璃內槽 （制膠槽）洗干凈 ,晾干,放入制膠玻璃板 .取透明膠 帶將玻璃板與內槽兩端邊緣封好 ,形成模子 .將內槽置于水平位置 ,并在固定位置放 好梳子將冷卻到65C左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內槽玻璃板上，使膠液緩慢展開 ,直到整個玻璃板表面形成均勻膠層

7、.室溫下靜置直至凝膠完全凝固 ,垂直 輕拔梳子 ,取下膠帶 ,將凝膠及內槽放入電泳槽中 .添加1 X TA電泳緩沖液至沒過膠板1-2 mm為止.3. 加樣:在點樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋 倍數(shù)應不小于1X用10ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內，每加完 一個樣品 ,應更換一個加樣頭 ,以防污染 ,加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面 .（注意:加樣前要先記下加樣的順序 ）.4. 電泳:加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，電壓60-100V樣品由負極(黑色)向正極 (紅色)方向移動 .電壓升高 ,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低 .當溴酚藍移動到距離 膠板下沿約1cm處時，停止電泳