Transwell試驗(yàn)方法

1、精品文檔Tran swell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)與移動實(shí)驗(yàn)、試劑和耗材1)細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)基：KYSE150細(xì)胞、含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基及無血清 RPMI1640培養(yǎng)基。2)10PBS (pH7.0):Na2HPO4 12H2O ( MW 358.4 )2.87gKH2PO4 ( MW 136.09 )0.2gNaCl (MW 58.44 )8.0gKCl ( MW 74.55 )0.2g去離子水至 100 ml高壓滅菌后，室溫保存。使用液為1XPBS(用無菌水進(jìn)行1: 9稀釋)。3) 冰乙酸：甲醛(1:3)4) Transwell 小室(BD, Bioscience)5) Matrig

2、el 基質(zhì)膠(BD, Bioscience，50ug/ml):商品化，保存-20 。6) 各種規(guī)格的槍頭、1.5ml離心管及10ml玻璃離心管：高溫滅菌后備用，其中準(zhǔn)備一些槍頭與1.5ml的離心管于-20oC預(yù)冷，備用。7) 5810R臺式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)，TC10全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Bio-Rad)8) 細(xì)胞計(jì)數(shù)板、6孔板二、實(shí)驗(yàn)步驟(一) 侵襲實(shí)驗(yàn)1. 潤化：在無菌臺上取出Transwell小室，置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，小室內(nèi)和放小室的孔內(nèi)均用加少量無血 清培養(yǎng)基，潤化 5-15min。2. 細(xì)胞準(zhǔn)備：在做實(shí)驗(yàn)前12h，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗三次，每瓶細(xì)胞加入 5ml無血清培

3、養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng) 24h。3. 細(xì)胞的接種：1) 棄去無血清培養(yǎng)基，常規(guī)胰酶消化細(xì)胞，若室溫過低可置于37C培養(yǎng)箱中消化，消化時間不宜過長，控制在1min以內(nèi)。2) 加入4C預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基(建議 6孔板2ml，培養(yǎng)瓶5ml )，輕輕吹打均勻后，收集至 10ml玻璃 離心管中(帶螺口蓋子)，水平轉(zhuǎn)子4C、700rpm/min，離心5min ；3) 棄除上清，適量無血清洗滌細(xì)胞并離心；4) 棄除上清，加入適量無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞(根據(jù)細(xì)胞消化前滿度進(jìn)行初步稀釋，建議初步稀釋至細(xì)胞密度大于1.5 105/ml)，輕輕吹打均勻后，取10ul細(xì)胞懸液用于Bio-Rad TC10細(xì)胞計(jì)數(shù)；亦可取15ul

4、 細(xì)胞懸液與等體積臺盼藍(lán)染液混合后取10ul用于Bio-Rad TC10活細(xì)胞計(jì)數(shù)；5) 計(jì)數(shù)后，取無血清培養(yǎng)基重懸一定體積的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整至1.25 05/ml;6) 將一定數(shù)量Transwell小室放入BD公司24孔板，取上述細(xì)胞懸液 400 1(含5X104細(xì)胞)逐滴加入小 室；取500卩含10%血清的培養(yǎng)基沿小室側(cè)壁與孔壁的空隙處加入到孔中，并保證小室膜與培養(yǎng)液之間無氣泡。7) 將接種好的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱，37C、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)24h，此過程不宜晃動細(xì)胞板。4. 細(xì)胞染色及拍照：1) 棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，將小室取岀，棄去孔中培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，將小室內(nèi)PBS吸干凈，此過

5、程要求快速完成，避免讓小室的膜過于干燥，將小室置于已加入500ul固定液的培養(yǎng)孔中，在上室中加入200ul 固定液，固定5-10分鐘左右。此過程要將保證培養(yǎng)板蓋有蓋子，以防揮發(fā)。2) 棄去孔中固定液，PBS漂洗3次，將小室內(nèi)PBS吸干凈，將小室置于已加入 500ul蘇木素染液的培養(yǎng) 孔中，上室中加入 200ul固定液，染色10-15min。3) 將小室轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)孔中，水洗至適當(dāng)顏色，用棉簽擦拭去小室內(nèi)部未穿過上室膜面的細(xì)胞。4) 往小室內(nèi)加入100ul PBS，倒置顯微鏡觀察穿過去的細(xì)胞，200 X光鏡下計(jì)數(shù)10個視野的侵襲細(xì)胞數(shù)，取其平均值，以侵襲細(xì)胞的相對數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。5

6、) 若顏色偏淺，可以置于染色液中重復(fù)染色，水洗至適當(dāng)顏色后即可。（二）移動實(shí)驗(yàn)1. 小室潤化：在無菌臺上取出Transwell小室，置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，小室內(nèi)和放小室的孔內(nèi)均用加少量 無血清培養(yǎng)基，潤化 5-15min，備用。2. 細(xì)胞準(zhǔn)備：常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，用 PBS（已滅菌）或無血清培養(yǎng)基洗滌3次后，加入常規(guī)量無血清培養(yǎng)基饑餓12h。3. 接種Transwell小室1）棄去無血清培養(yǎng)基，常規(guī)胰酶消化細(xì)胞，若室溫過低可置于37C培養(yǎng)箱中消化，消化時間不宜過長，控制在1分鐘以內(nèi)。2）加入4C預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基（建議 6孔板2ml，培養(yǎng)瓶5ml ），輕輕吹打均勻后，收集至 10ml玻璃 離心管中（帶

7、螺口蓋子），水平轉(zhuǎn)子4C、700rpm/min，離心五 min ；3）棄除上清，加入適量無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞（根據(jù)細(xì)胞消化前滿度進(jìn)行初步稀釋，建議初步稀釋細(xì)胞密度大于1.5 x105/ml），輕輕吹打均勻后，取10ul細(xì)胞懸液用于Bio-Rad TC10細(xì)胞計(jì)數(shù)；亦可取15ul 細(xì)胞懸液與等體積臺盼藍(lán)染液混合后取10ul用于Bio-Rad TC10活細(xì)胞計(jì)數(shù)；4）計(jì)數(shù)后，取無血清培養(yǎng)基重懸一定體積的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整至1.25 X05/ml;5）將一定數(shù)量Transwell小室放入BD公司24孔板，取上述細(xì)胞懸液 400卩逐滴加入小室；取 500卩含 10%血清的培養(yǎng)基沿小室側(cè)壁與孔壁的空隙處加入到孔中，并保證小室膜與培養(yǎng)液之間無氣泡。6）將接種好的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱，37C、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)24h，此過程不宜晃動細(xì)胞板。4. 細(xì)胞染色（Giemsa試劑盒）及拍照：（三）Transwell小室重復(fù)利用處理方法1. 拍照結(jié)束后，將小室直接放入 6孔板/24孔板中，小室上下均加入適量胰酶，使膜浸泡在胰酶中，室溫放置過夜（約6h以上）;2. 將小室取出，用75%乙醇浸泡5min （可將小室全部沒入乙醇中），重復(fù)三次，以除去蘇木素染色；3. 無菌水漂洗幾次以除去殘留物質(zhì)，甩干水后，置于室