葉酸代謝能力基因檢測操作流程

1、實驗流程一、操作步驟適用儀器： 普通 PCR儀樣本要求： EDTA抗凝劑的靜脈全血 （100l ），室溫保存不超過 7 天， 2 8保存不超過 1個月，- 20保存不超過 3個月，反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次；DNA的濃度應(yīng)不低于 5ng/ l ， A260/ A 280 應(yīng)在 之間。有血塊的樣本需經(jīng)勻漿處理或用組織研磨儀研磨處理后再進行全血DNA的提取。檢驗方法：（試劑盒中的檢本測卡、陽性 / 陰性對照卡上標識解釋如下： M表示突變型， WT表示野 生型， C 表示質(zhì)控線， T 表示檢測線。）A： 樣本 DNA的制備試劑盒準備工作：1、清洗液 BW-I：用 50 ml 量筒分別移取 35 ml

2、 無水乙醇（分析純）和 35 ml 異丙醇加入至清洗 液 BW-I 試劑瓶中，顛倒混合均勻，在試劑瓶上標明“已加入醇”和日期，備用。2、清洗液 BW-II ：用 50 ml量筒移取 49 ml 無水乙醇加入至清洗液 BW-II 試劑瓶中，顛倒混合均 勻，在試劑瓶上標明“已加入醇”和日期，備用。3、蛋白酶 K 準備：取出蛋白酶 K，室溫解凍，渦旋混勻后備用。4、磁性微粒準備：將磁性微粒渦旋混勻，保證均一。實驗操作步驟：1. 將 20 l 蛋白酶 K溶液加入 2 ml 離心管的管底。依次加入 100 l 全血、 200 l 裂解液 BL，用渦旋振蕩器混合 15 sec（ 以下簡稱渦旋混勻 ），56

3、 水浴 20 min。2. 向步驟 1裂解處理的樣品中依次加入 300 l 結(jié)合液 BI、25 l 的磁性微粒 （移取前必須充 分渦旋混勻），渦旋混勻，室溫靜置 5 min 。磁性分離 5 min ，棄上清。3. 從磁性分離器上取出離心管， 加入 400 l 清洗液 BW-I，渦旋混勻， 磁性分離至上清澄清 （期 間上下顛倒數(shù)次，以清洗離心管管壁） ，棄上清；重復(fù)本步操作，以 400l 清洗液 BW-I 重復(fù) 清洗一次。4. 從磁性分離器上取出離心管， 加入 400 l 清洗液 BW-II ，渦旋混勻，磁性分離至上清澄清 （期 間上下顛倒數(shù)次，以清洗離心管管壁） ，棄上清（盡可能棄去所有的清洗

4、液 BW-II ）。5. 打開離心管蓋，將其室溫晾干 5 min6. 從磁性分離器上取下離心管，向管中加入 100 l 洗脫液 ES，渦旋混勻， 56水浴 5 min 。7. 將離心管置于磁性分離器上，磁性分離至上清澄清。將上清液（分離純化得到的DNA溶液）轉(zhuǎn)移到 2 ml 離心管中，直接用于下游實驗或于 -20 保存?zhèn)溆?。B：PCR擴增液準備（1）每人份需做兩個反應(yīng)，取兩個無菌 PCR薄壁管，在 PCR薄壁管管蓋上依次標有 M、WT。（2）將試劑從 - 20取出平衡至室溫，瞬時離心。在標有 M的管中加入 29l 擴增液（ M），在標 有 WT的管中加入 29 l擴增液（ WT）。（3）分別向

5、以上 M和 WT各管中加入 1l反應(yīng)液。將管蓋蓋緊后，渦旋混勻，瞬時離心待用。C：待檢測 DNA樣本的配制在上述標有 M、WT管中分別加入 3l待測基因組 DNA，分別再加入 17l ddH2O使終體積為 50 l 。 將管蓋蓋緊后，渦旋混勻，瞬時離心。D：PCR擴增將 PCR管放入 PCR儀中，按如下程序擴增： 50 2 min；95 5min ； 94 30sec、60 30sec、65 1min （ 26Cycles ）；65 10min ； 4 Hold 。取出 PCR產(chǎn)物， 28保存。E：檢測卡檢測實驗從密封袋中取出檢測卡，將待測樣本 M與 WT管中的 PCR產(chǎn)物分別滴加在檢測卡對應(yīng)

6、的樣品墊處， 待 25 min 對結(jié)果進行判讀， 20min后結(jié)果不可靠。F：質(zhì)量控制1）檢測結(jié)果中陽性對照應(yīng)在陽性對照卡檢測線（ T線）出條帶，陰性對照應(yīng)在陰性對照卡檢測線（ T線）不出條帶。正常檢測時，應(yīng)定期進行陽性對照品及陰性對照品實驗。（2）陽性對照品實驗：取兩個無菌 PCR薄壁管，在 PCR薄壁管管蓋上依次標有 M、WT，將 20l M陽性對照液、 20l WT 陽性對照液分別加入標有 M、WT的 PCR薄壁管中，再依次分別加入 M擴 增液 29l及 1l反應(yīng)液、 WT擴增液 29l及 1l反應(yīng)液，按照步驟中 DF完成，檢測線（ T 線）及質(zhì)控線（ C線）均應(yīng)出現(xiàn)條帶。（3）陰性對照

7、品實驗：取兩個無菌 PCR薄壁管，在 PCR薄壁管管蓋上依次標有 M、WT，將 M擴增 液 29l 、1l反應(yīng)液及 WT擴增液 29 l 、1l反應(yīng)液分別加入標有 M、WT的 PCR薄壁管中， 再 分別加入 20l陰性對照液，按照步驟中 DF完成，質(zhì)控線（ C線）應(yīng)出現(xiàn)條帶，檢測線（ T 線） 應(yīng)無條帶出現(xiàn)。G：結(jié)果判讀（如下圖、下表）如上圖一所示，以陽性對照液為模板進行 PCR反應(yīng)，對 PCR產(chǎn)物進行檢測，檢測線（ T 線）有條 帶出現(xiàn)，作為陽性對照；以陰性對照液為模板進行PCR反應(yīng)，對 PCR產(chǎn)物進行檢測，檢測線（ T線）無條帶出現(xiàn)，為陰性對照。若陰性樣本有條帶出現(xiàn)，有可能加樣時未及時更換

8、吸頭，有 DNA 污染，建議在操作過程中，先配制陰性對照管并及時閉合 PCR管蓋。圖二顯示 MTHFR 677C表C 示 正常野生型；圖三顯示 MTHFR67 7TT表示一對等位基因的第 677 位胞嘧啶（C）均變?yōu)樾叵汆奏ぃ═）， 即純合突變；圖四顯示 MTHFR6 77CT表示其中一個等位基因的第 677位胞嘧啶（ C）變?yōu)樾叵汆奏?（T），即雜合突變；圖五質(zhì)控線（ C線）無條帶或質(zhì)控線（ C線）與檢測線（ T 線）均無條帶，即 為無效檢測。無效原因可能為操作不正確或試紙條已變質(zhì)損壞。應(yīng)再次仔細閱讀說明書，并用新 的檢測卡重新檢測。如果問題仍然存在，應(yīng)立即停止使用該批號產(chǎn)品，并與廠家或供應(yīng)

9、商聯(lián)系。圖一 陽性及陰性對照圖二 野生型 圖三 純合突變 圖四 雜合突變圖五 無效圖H：注意事項（ 1）實驗室應(yīng)該遵循 PCR實驗規(guī)范的要求分區(qū)操作，各區(qū)物品均為專用，不得交叉使用，加模板和引物 的移液器不能混用，每次加樣后均需更換吸頭，推薦使用無核酶、帶濾芯的吸頭。各區(qū)的儀器、設(shè)備和工 作服應(yīng)獨立使用。（2）本試劑盒用于體外操作。用戶切勿吸入試劑或直接接觸皮膚。（3）使用本試劑盒前，請仔細閱讀說明書，嚴格按照說明書的要求操作。打開包裝后請盡快使用。（ 4）使用本試劑盒時，因 PCR體系為 50 l 體系，應(yīng)使用 200l 的 PCR擴增管進行操作。（5）本試劑盒備有“ PCR組分加入確認單”，在【檢測方法】中的步驟B（PCR擴增系統(tǒng)