2015初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證

1、.初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證方案產(chǎn)品名稱：一次性包皮環(huán)切縫合器編制：日期：審核：日期：批準(zhǔn)：日期：江西狼和醫(yī)療器械股份限有限公司.目錄初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證方案1概述2驗(yàn)證目的3職責(zé)與驗(yàn)證申請(qǐng)4驗(yàn)證依據(jù)5驗(yàn)證計(jì)劃6驗(yàn)證內(nèi)容.初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證方案1. 概述：初始污染菌的數(shù)量可以反映出車間環(huán)境衛(wèi)生的清潔度，與產(chǎn)品滅菌工藝、成品熱原及內(nèi)毒素有直接關(guān)系， 故而要對(duì)其檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證， 確認(rèn)其有效性及檢測(cè)準(zhǔn)確性，從而優(yōu)化產(chǎn)品滅菌工藝及控制產(chǎn)品熱原及內(nèi)毒素，確保產(chǎn)品的安全性。2. 目的：通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證檢測(cè)方法的適用性及計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基的適用性。3. 職責(zé)與驗(yàn)證申請(qǐng)：3.1 質(zhì)量管理部提供檢測(cè)項(xiàng)目方案、接收標(biāo)準(zhǔn)

2、、評(píng)價(jià)等級(jí)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。3.2 生產(chǎn)技術(shù)部負(fù)責(zé)按驗(yàn)證方案生產(chǎn)相關(guān)樣品初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證申請(qǐng)表驗(yàn)證組姓名職務(wù)單位黃燕組長(zhǎng)質(zhì)量管理部經(jīng)理龍章宏組員化驗(yàn)員江西狼和醫(yī)療器械股份有限公司蘇俊組員化驗(yàn)員胡梓鵬組員化驗(yàn)員批準(zhǔn)經(jīng)研究：同意以上成員組成驗(yàn)證小組，按照此方案對(duì)本公司的產(chǎn)品的初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。批準(zhǔn)人：年月日4. 依據(jù)：中國(guó)藥典 2015 版5. 驗(yàn)證計(jì)劃：5.1 實(shí)驗(yàn)操作人員確認(rèn)；5.2 實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器材的確認(rèn)；5.3 產(chǎn)品取樣及方法確認(rèn)。6. 驗(yàn)證內(nèi)容：6.1 菌種和菌液制備.6.1.1菌種試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò) 5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第 0 代），并采用適宜

3、的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。6.1.2 菌液制備接種金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，30? 35培養(yǎng) 18? 24 小時(shí)；接種白色念珠菌的培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20? 25培養(yǎng) 2-3 天，上述培養(yǎng)后的新鮮培養(yǎng)物用 PH7.0 無(wú)菌化鈉 - 蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌化鈉溶液制成每 lml 菌數(shù)小于 100cfu( 菌落形成）的菌懸液。接種黑曲霉的培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂面培養(yǎng)基上， 20? 25培養(yǎng) 5? 7 天，加人 3? 5 ml 0.05%(ml/ml)聚山梨酯 80

4、 的 pH7.0 無(wú)菌化鈉- 蛋白胨緩沖液或 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用 0.05% (ml/ml) 聚山梨醋 80 的 pH7.0 無(wú)菌化鈉 - 蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每lml 孢子數(shù)量小于 100cfu 的孢子懸液。菌懸液若在室溫下放置，應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2? 8 在 24h 內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液存在2? 8，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)用。6.2 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查6.2.1 需氧菌的計(jì)數(shù)分別取 1ml 的金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各菌懸液，接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大

5、豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板。金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽孢桿菌在 30-35 ，培養(yǎng)不超過(guò) 3 天；白色念珠菌、黑曲霉在 20-25 ，培養(yǎng)不超過(guò) 5 天。每一試驗(yàn)菌株平行制備 2 管或 2 個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。6.2.2 霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)分別取 1ml 的白色念珠菌、黑曲霉各菌懸液，接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。在20-25 ，培養(yǎng)不超過(guò) 5 天。每一試驗(yàn)菌株平行制備2 管或 2 個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。6.2.2 結(jié)果判定被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)

6、與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。6.2.3 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表16.3 計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證6.3.1 供試液的制備：洗脫液用 0.9%的滅菌生理鹽水，檢品液制備在10000 級(jí)環(huán)境中進(jìn)行。6.3.2接種和稀釋.按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋 , 制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過(guò)供試液體積的 1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出， 首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。（1）試驗(yàn)組 取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每 1ml 供試液或每張濾膜所濾過(guò)的供試液中含菌量不大于 100cfu 。（2）供試品對(duì)照組取制備

7、好的供試液 ,以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。（3）菌液對(duì)照組 取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液 , 按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o(wú)法選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用無(wú)法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過(guò)中和、稀釋或薄膜過(guò)濾處理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗(yàn)。6.3.3抗菌活性的去除或滅活供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值小于菌液對(duì)照組菌數(shù)值的50%，可采用下述方法消除供試品的抑

8、菌活性。 增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。 加入適宜的中和劑或滅活劑。6.3.4微生物的回收按照 6.2 的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基所用的試驗(yàn)菌逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)，法和薄膜過(guò)濾法。回收試驗(yàn)采用平皿6.3.4.1平皿法 -傾注法取 6 個(gè)直徑 90mm的無(wú)菌平皿。 2 個(gè)分別注入照上述“試驗(yàn)組”制備的供試液1ml；2 個(gè)分別注入照上述“供試品對(duì)照組”制備的供試液1ml；2 個(gè)分別注入照上述“菌液對(duì)照組”制備的供試液1ml。每個(gè)平皿注入1520ml溫度不超過(guò)45熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。6.3.4.2平皿法試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表26.3.4.3薄膜過(guò)濾法薄膜過(guò)

9、濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45 m,直徑一般為50mm,若采用其他直徑的濾膜 , 沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí) , 應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。 供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后 , 若需要用沖洗液沖洗濾膜 , 每張濾膜每次沖洗量一般為 100ml?？倹_洗量不得超過(guò)1000ml, 以避免濾膜上的微生物受損傷。取照上述“試驗(yàn)組”、“供試品對(duì)照組”和“菌液對(duì)照組”制備的供試液適量（一.般取相當(dāng)于1g、1ml 或 10cm2 的供試品 ,若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中,

10、混勻 , 過(guò)濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。若測(cè)定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測(cè)定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。6.3.4.4薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3.初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告報(bào)告編號(hào)：報(bào)告時(shí)間：.目錄初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告1、目的2、概述3、測(cè)試方法與試驗(yàn)結(jié)果4、結(jié)論5、重新驗(yàn)證條件.1. 目的：參照中國(guó)藥典 2015 版，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證檢測(cè)方法的適用性及計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基的適用性，從而驗(yàn)證現(xiàn)在使用初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法是否準(zhǔn)確合格。2. 概述：產(chǎn)品型號(hào)為 26 型：批號(hào)為： 2015

11、01013. 測(cè)試方法及檢驗(yàn)結(jié)果：3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器材：該實(shí)驗(yàn)使用儀器及器具主要有： 滅菌移液管及移液槍吸嘴、 無(wú)菌小泵管、培養(yǎng)皿、小型蠕動(dòng)泵、薄膜過(guò)濾器、滅菌鍋、百級(jí)工作臺(tái)、生物安全柜、電子天平、電熱恒溫培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱。設(shè)備名稱是否校量是否在有效期內(nèi)結(jié)論滅菌鍋已校量在有效期內(nèi)符合要求百級(jí)工作臺(tái)已校量在有效期內(nèi)符合要求生物安全柜已校量在有效期內(nèi)符合要求電子天平已校量在有效期內(nèi)符合要求電熱恒溫培養(yǎng)箱已校量在有效期內(nèi)符合要求霉菌培養(yǎng)箱已校量在有效期內(nèi)符合要求確認(rèn)人 / 日期：審核 / 日期：3.2 使用材料及菌種：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊

12、脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培對(duì)照養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基、銅綠假單胞菌、 金黃色葡萄球菌、 枯草芽孢桿菌、 白色念珠菌、黑曲霉（菌種購(gòu)買單位均為微生物種質(zhì)資源庫(kù)） 。3.3 菌液制備：接種金色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，30? 35培養(yǎng) 18? 24 小時(shí)；接種白色念珠菌的培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20? 25培養(yǎng)2-3 天，上述培養(yǎng)后的新鮮培養(yǎng)物用PH7.0無(wú)菌化鈉 - 蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌化鈉溶液制成每lml菌數(shù)小于100cfu( 菌落形成）的菌懸液。接種黑曲霉的培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂

13、面培養(yǎng).基上， 20? 25培養(yǎng) 5? 7 天，加人 3? 5 ml 0.05%(ml/ml) 聚山梨酯 80 的 pH7.0 無(wú)菌化鈉 - 蛋白胨緩沖液或 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用 0.05% (ml/ml) 聚山梨醋 80 的 pH7.0 無(wú)菌化鈉 - 蛋白胨緩沖液或 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每 lml 孢子數(shù)量小于 100cfu 的孢子懸液。菌懸液若在室溫下放置，應(yīng)在 2 小時(shí)內(nèi)使用；若保存在 2? 8 在 24h 內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液存在 2? 8，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)用。3.4 培養(yǎng)基適用性檢查3.4.1 需氧菌的計(jì)數(shù)分別

14、取 1ml 的金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各菌懸液，接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板。 金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽孢桿菌在 30-35 ，培養(yǎng)不超過(guò) 3 天；白色念珠菌、黑曲霉在 20-25 ，培養(yǎng)不超過(guò) 5 天。每一試驗(yàn)菌株平行制備 2 管或 2 個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。3.4.2 霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)分別取 1ml 的白色念珠菌、黑曲霉各菌懸液，接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。在20-25 ，培養(yǎng)不超過(guò) 5 天。每一試驗(yàn)菌株平行制備2 管或 2 個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)

15、。3.4.3 結(jié)果判定被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。3.4.4 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1表 1加入菌種銅綠假單胞菌平均值金黃色葡萄球菌平均值枯草芽孢桿菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值加入菌種白色念珠菌平均值黑曲霉平均值培養(yǎng)基菌落數(shù)cfu培養(yǎng)條件胰酪大豆胨瓊脂培胰酪大豆胨瓊脂對(duì)照養(yǎng)基培養(yǎng)基33 ,48小時(shí)23 ,72小時(shí)培養(yǎng)基菌落數(shù)cfu培養(yǎng)條件沙氏葡萄糖瓊脂培沙氏葡萄糖瓊脂對(duì)照養(yǎng)基培養(yǎng)基23 ,72小時(shí)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基 / 胰酪大豆胨瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基沙

16、氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 / 沙氏葡萄糖瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基.結(jié)論菌 落 形態(tài)大小于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致結(jié)論菌落形態(tài)大小于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致結(jié)論：從以上檢測(cè)結(jié)果可知，上述批號(hào)的培養(yǎng)基適用性檢查符合要求，可用于日常產(chǎn)品檢測(cè)中的計(jì)數(shù)。驗(yàn)證人 / 日期：審核 / 日期：3.5 計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證3.5.1 供試液的制備：洗脫液用 0.9%的滅菌生理鹽水，檢品液制備在10000 級(jí)環(huán)境中進(jìn)行。3.5.2接種和稀釋按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋 , 制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過(guò)供試液體積的 1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出， 首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。（1）

17、試驗(yàn)組 取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每 1ml 供試液或每張濾膜所濾過(guò)的供試液中含菌量不大于 100cfu 。（2）供試品對(duì)照組取制備好的供試液 ,以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。.（3）菌液對(duì)照組取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液, 按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o(wú)法選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用無(wú)法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過(guò)中和、稀釋或薄膜過(guò)濾處理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗(yàn)。3.5.3抗菌活性的去除或滅活供試液接種

18、后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值小于菌液對(duì)照組菌數(shù)值的50%，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。 增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。 加入適宜的中和劑或滅活劑。3.5.4微生物的回收按照6.2的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基所用的試驗(yàn)菌逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)，回收試驗(yàn)采用平皿法和薄膜過(guò)濾法。3.5.4.1平皿法 -傾注法取 6 個(gè)直徑 90mm的無(wú)菌平皿。 2 個(gè)分別注入照上述“試驗(yàn)組”制備的供試液1ml；2 個(gè)分別注入照上述“供試品對(duì)照組”制備的供試液1ml；2 個(gè)分別注入照上述“菌液對(duì)照組”制備的供試液1ml。每個(gè)平皿注入 1520ml 溫度不超過(guò) 45熔化的

19、胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。3.5.4.2平皿法試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 2表 2一次性包皮環(huán)切縫合器一次性包皮環(huán)切縫合器一次性包皮環(huán)切縫合器樣品 1樣品 1樣品 1沖洗一次263025沖洗二次042沖洗三次000沖洗四次000回收率100%88.3%92.6%平均回收率93.7%修正系數(shù)1.07結(jié)論：以上產(chǎn)品各做三套平均回收率達(dá) 80%以上，一次回收率達(dá)到要求。正常試驗(yàn)中可采用沖洗一次后 * 回收系數(shù)進(jìn)行估算。試驗(yàn)人 / 日期：審核 / 日期.3.5.4.3薄膜過(guò)濾法薄膜過(guò)濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45 m,直徑一般為 50mm,若采用其他直徑的濾膜 , 沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí) , 應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。 供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后 , 若需要用沖洗液沖洗濾膜 , 每張濾膜每次沖洗量一般為 100ml。總沖洗量不得超過(guò) 1000ml, 以避免濾膜上的微生物受損傷。取照上述 “試驗(yàn)組”、“供試品對(duì)照組”和“菌液對(duì)照組”制備的供試液適量 （一般取相當(dāng)于 1g、1ml 或 10cm2 的供試品 , 若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供試