DNA提取中各種實驗試劑作用原理

1、DNA提取中各種實驗試劑作用原理1、STE是Tris-Hcl 、EDTA Nacl的混合液。其總體作用是為 DNA提供保護環(huán)境，在此環(huán)境下DNA可以呈穩(wěn)定態(tài)，最少限度地受到破壞。Tris.HCl提供緩沖體系，DNA在這一體系中呈穩(wěn)定態(tài)。EDTA是DNA酶的抑制劑，可以防止細胞破碎后 DNA酶降解DNANaCl，有利于DNA的溶解。2、SDS的作用：利用高濃度的陰離子去垢劑 SDS（十二烷基磺酸鈉，Sodium dodecyl sulfate ）使DNA與蛋白質(zhì)分離，在高溫（5565C）條件下裂解細胞，使染色體 離析，蛋白變性，釋放出核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的方法使蛋白質(zhì)及 多糖雜質(zhì)沉

2、 淀，離心后除去沉淀，3、 苯酚的作用：使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的優(yōu)點：1.有效變性蛋白質(zhì)；2.抑制了 DNase的降解作用。缺點： 1. 能溶解 10-15%的水，從而溶解一部分poly（A） RNA。 2. 不能完全抑制RNase的活性。Tris 酚的顏色，一般為黃色。如果變成粉紅色，說明被氧化，不能再用。4、氯仿的作用克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。 (酚易溶于氯仿中)5、異戊醇：減少蛋白

3、質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。6、用乙醇沉淀DNA寸，為什么加入單價的陽離子？用乙醇沉淀 DNA時，通常要在溶液中加入單價的陽離子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的負電荷，減少 DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。7、為什么在保存或抽提 DNA過程中，一般采用TE緩沖液？在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)(pKa= 7.2 )和硼酸系統(tǒng)(pKa=9.24)等雖然也都符

4、合細胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實驗時，磷酸根離子 的種類及數(shù)量將與 Ca2+產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反應(yīng)時，不同的酶對輔助因 子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCI (pKa=8.0)的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是 TrisH+/Tris ，不存在金屬離子的 干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA 更能穩(wěn)定 。8、STE是Tris-Hcl 、EDTA Nacl的混合液。其總體作用是為 DNA提供保護環(huán)境，在此環(huán)境下DNA可以呈穩(wěn)定態(tài)，最少限度地受到破壞。Tris.

5、HCI提供緩沖體系，DNA在這一體系中呈穩(wěn)定態(tài)。EDTA是DNA酶的抑制劑，可以防止細胞破碎后DNA酶降解DNANaCI，有利于DNA的溶解。9、SDS的作用：利用高濃度的陰離子去垢劑 SDS（十二烷基磺酸鈉，Sodium dodecyl sulfate ）使DNA與蛋白質(zhì)分離，在高溫（5565C）條件下裂解細胞，使染色體 離析，蛋白變性，釋放出核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的方法使蛋白質(zhì)及 多糖雜質(zhì)沉 淀，離心后除去沉淀，10、 苯酚的作用：使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿 液時，由于蛋白與 DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似 相溶。

6、蛋白分子溶于酚相，而 DNA溶于水相。使用酚的優(yōu)點：1.有效變性蛋白質(zhì)；2.抑制了 DNase的降解作用。缺點： 1. 能溶解 10-15%的水，從而溶解一部分 poly（A） RNA。 2. 不能完全抑制RNase的活性。Tris 酚的顏色，一般為黃色。如果變成粉紅色，說明被氧化，不能再用。11、氯仿的作用克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。 （酚易溶于氯仿中）5、異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。12、用

7、乙醇沉淀DNA寸，為什么加入單價的陽離子？用乙醇沉淀 DNA時，通常要在溶液中加入單價的陽離子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的負電荷，減少 DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。Tris中文品名 : 三羥甲基氨基甲烷 ; 氨基丁三醇 ; 緩血酸胺Tris 結(jié)構(gòu)式英文品名 : Tris; Tris(Hydroxymethyl)aminomethane英文別名 : 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediolTHAM; Tris base; Trometamol通用 CAS : 77-86-1產(chǎn)品純度:100%(USP藥典級)/ 99

8、.9%(實驗室技術(shù)級)產(chǎn)品級別:USP藥典級,符合USP/EP/cGMP寸藥物賦形劑的要求分 子 式: NH2C(CH2OH)3分 子 量: 121.14使用用途:生物制藥，體外診斷，個人護理及化妝品原料等 保存溫度:常溫密封避光保存TRIS是一種最常用的生物緩沖液，常配成PH值為6.8，7.4，8.0，8.8。其PH值隨溫度變化很大。一般來說，溫度每升高一度，PH值下降0.03 o1M TRIS-HCl 6.8 和 1.5M TRIS-HCl 8.8 是 SDS-PAG最常用的試劑。而由TRIS配成的TAE TBE等是DNA電泳最常用的試劑，TE (PH8.0)主要用于溶解 DNA TE 為

9、 Tris 加 EDTA合稱。緩沖特性：Tris為弱堿，在室溫(25C)下，它的pKa為8.1 ;根據(jù)緩沖理論，Tris 緩沖液的有效緩沖范圍在 pH7.0到9.2之間。Tris堿的水溶液pH在10.5左右，一 般加入鹽酸以調(diào)節(jié)pH值至所需值，即可獲得該 pH值的緩沖液。但同時應(yīng)注意溫度 對于Tris的pKa的影響。衍生緩沖液：由于Tris緩沖液為弱堿性溶液，DNA在這樣的溶液中會被去質(zhì)子化，從而提高其溶 解性。人們常常在Tris鹽酸緩沖液中加入 EDTA制成“TE緩沖液”，TE緩沖液被用 于DNA勺穩(wěn)定和儲存。如果將調(diào)節(jié)pH值的酸溶液換成乙酸，則獲得“ TAE緩沖液”(Tris/Acetate/EDTA )，而換成硼酸則獲得“ TBE 緩沖液”(Tris/Borate/EDTA ) 這兩種緩沖液通常用于核酸電泳實驗中。制備：Tris可以由兩步反應(yīng)生成：先由硝基甲烷生成中間體三羥甲基硝基甲烷(HOCH2)3CNO2然后再由該中間體還原得到Tris 用途： Tris 緩沖液不僅被廣泛用作核酸和蛋白質(zhì)的溶劑，還有許多重要用途。 Tris 被用