HPLC測定小花清風(fēng)藤中齊墩果酸的含量

1、HPLC測定小花清風(fēng)藤中齊墩果酸的含量【摘要】目的：建立小花清風(fēng)藤中齊墩果酸的含量測 定方法，為該藥材控制種植、加工、應(yīng)用提供的質(zhì)量控制。方法：采用HPLC法，以甲醇-O.1mol/L乙酸銨(85 : 15)為流動相，在波長 210nm 處檢測小花清風(fēng)藤中齊墩果酸的含量。結(jié)果：齊墩果酸在 0.19891.2430mg/ml范圍內(nèi)呈良好的線 性關(guān)系(r=0.9991 , n=6);加樣回收率為 95.6%, RSD為0.6 %。 結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性較好，可用于小花 清風(fēng)藤的質(zhì)量控制?！娟P(guān)鍵詞】 小花清風(fēng)藤；高效液相色譜；齊墩果酸【中圖分類號】 R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A

2、【文章編號】 1007-8517(2015) 19-0008-03Abstract ： Objective To establish a method to determine components in Sabia parviflora Wall. ex Roxb. ， to improve its quality standard. And as the medicinal materials further to control the quality of the planting ang ， processing， using the basis.Methods Using HPLC

3、 with the gradient elution of Methyl alcohol-0.1mol/L ammonium acetate solution (85 : 15) detected the content of oleanolic acid at 210nm. Results Oleanolic acid showed a good linear range in 0.19891.2430mg/ml （ r=0.9991，n=6） ， recovery was 95.6%；RSD was 0.6%.Conclusion The established method is sim

4、ple ， accurate， sensitive and ， repeatability is good which ， can be used for quality control of Sabia parviflora Wall. ex Roxb.Keywords： Sabia Parviflora； HPLC； Oleanolic Acid 小花清風(fēng)藤為清風(fēng)藤科植物小花清風(fēng)藤 Sabia parvifloraWall. ex Roxb的莖和葉，俗稱小黃藥、黃腫藥、黃眼藥、雅 希強，是布依族、 苗族的常用藥物。 主要分布于云南、 廣西、 貴州黔西南安龍、望謨、冊亨、惠水等地 1 ；小花

5、清風(fēng)藤味 苦，性微寒，具有清熱利濕，清肝利膽，祛風(fēng)濕，消炎止痛 的功效，臨床用于治療濕熱黃疸，風(fēng)濕骨痛，跌打損傷，肝 炎。貴州少數(shù)民族用于治療肝炎具有很好的療效。 貴州植 物志記載，小花清風(fēng)藤制成的沖劑對甲肝患者治療的有效 率達(dá) 95%以上；對乙肝的治療效果也較顯著，其降黃疸和轉(zhuǎn) 氨酶的效果極佳，用藥后約 30%患者的表面抗原轉(zhuǎn)陰。現(xiàn)代 研究證明，小花清風(fēng)藤具有保肝、治療肝炎的作用 2。小花 清風(fēng)藤收載于 2003 版貴州省中藥材、 民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) ， 但標(biāo)準(zhǔn)僅有顯微和理化鑒別。小花清風(fēng)藤中含具有有護(hù)肝降 酶的齊墩果酸 3-4 ，研究在天然藥物化學(xué)的基礎(chǔ)上，結(jié)合小 花清風(fēng)藤的功能主治，建立

6、HPLC法測定小花清風(fēng)藤齊墩果 酸含量的方法，旨在為苗藥小花清風(fēng)藤的資源開發(fā)及質(zhì)量控 制提供實驗依據(jù)。1 儀器與材料1.1 儀器 Waters e2695 型高效液相色譜儀 （含 Empower 色譜數(shù)據(jù)工作站） ；AUY220 萬分子一電子天平 （日本島津） ； 賽多利斯CPA225葉萬分子一電子天平；電熱恒溫干燥箱（上 海博訊實驗有限公司） 。1.2 材料 齊墩果酸對照品（批號 110709-201206 ，中國 藥品生物制品檢定所， 含量 94.9%）；小花清風(fēng)藤采于貴州黔 西南興義市滴水村。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑 均為分析純。2 方法與結(jié)果2.1 色譜條件 色譜柱： Wat

7、ers SunFire C18 （5um 4.6 x 250mm）； 流動相： 甲醇-0 . 1 mol/L 乙酸銨（85： 15）；柱溫： 30C；進(jìn)樣量：10卩I；檢測波長：210nm。2.2對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸 52.39mg （含 量 94.9%），加甲醇定容至 100mI 量瓶中， 制成每 1mI 含齊墩 果酸 0.4972mg 的溶液，所得對照品圖譜見圖 1。2.3供試品溶液的制備 取小花清風(fēng)藤藥材粉末 4g,精 密稱定， 加入 70%乙醇 50mI ，水浴回流 2小時，取出，放冷； 再用 70%乙醇補足減失的重量，過濾，精密取 25mI 濾液置 于蒸發(fā)皿中，蒸干，殘

8、渣加 3moI/L HCI 50mI 使其溶解，加熱 回流 3 小時，然后用三氯甲烷振搖提取 4 次（每次 15mI ）， 合并三氯甲烷液，揮干，殘渣加甲醇溶解，定容至 10mL，搖勻，取續(xù)濾液，即得。所得供試品圖譜見圖2.4 線性關(guān)系的考察 分別取齊墩果酸對照品 4、8、10、15、20、25卩l(xiāng)，按“ 2.1 ”項進(jìn)行HPLC分析，以峰面積 丫為 縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度 X 為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 為 丫=4.67X 106X-1.54X 104, r=0.9991 （n=6）。結(jié)果表明齊墩 果酸進(jìn)樣量在 0.19891.2430mg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良 好的線性關(guān)系。具體見表

9、1 、圖 3。2.5 精密度試驗 取齊墩果酸對照品（濃度為0.4792mg/ml ） 10卩l(xiāng)，連續(xù)進(jìn)樣6次，在上述色譜條件下， 測定齊墩果酸的峰面積。結(jié)果齊墩果酸峰面積的平均積分值為2373089 , RSD=0.7%表明儀器的精密度良好。2.6重復(fù)性試驗 精密稱取小花清風(fēng)藤粉末（ 3 號樣大莖） 6 份， 按“2.3”項操作，制備 6份供試品溶液，按“ 2.1”項色譜 條件測定，記錄峰面積，測定齊墩果酸含量。結(jié)果齊墩果酸 峰面積RSD為2.8%，說明本方法重復(fù)性良好。2.7 穩(wěn)定性考察 取一份小花清風(fēng)藤粉末 （ 4號樣大莖），按“ 2.3”項操作，制備供試品溶液，室溫放置0、 2、 4、

10、6、& 10h，按“ 2.1 ”項色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果齊墩 果酸峰面積的RSD為2.5%，表明供試品溶液在 10h內(nèi)穩(wěn)定。2.8 加樣回收率試驗 稱取已知含量的（ 3 號樣大莖）小 花清風(fēng)藤藥材6份，每份約2g,分別加入10ml 0.4972mg/ml 齊墩果酸對照品溶液， 按 2.3項方法進(jìn)行樣品處理后， 按 2.1 項色譜條件測定，記錄峰面積，測定齊墩果酸含量，計算加 樣回收率。由表 2 可知，齊墩果酸的平均加樣回收率為 95.6%， RSD為0.6%,表明本方法的準(zhǔn)確度良好。2.9 樣品含量測定 分別稱取 6個批次的小花清風(fēng)藤粉 末，按“ 2.3”項操作，平行制備供試品溶液，按

11、“ 2.1”項 方法進(jìn)行分析，記錄峰面積，測定藥材中齊墩果酸含量。結(jié) 果見表 3 。3 討論從表 3 可知，小花清風(fēng)藤樣品間齊墩果酸的含量存在一 定差異，大莖葉中的齊墩果酸含量高于嫩莖嫩葉、小莖葉及 中莖葉。藥材的莖葉生長年限越長，齊墩果酸的含量越高。 說明在藥材選擇時偏向生長年限長，莖葉粗大的較好。結(jié)合參考文獻(xiàn) 5和齊墩果酸的化學(xué)特性， 藥材采用 70% 乙醇 50ml 水浴回流 2 小時，加 3mol/L 鹽酸加熱回流 3 小時， 用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷液，蒸干，甲醇定容。在吸 收波長的選擇上，參考文獻(xiàn)5-6及通過DAD三微圖譜掃描軟 件，齊墩果酸 210nm 波長處有較好吸收且雜峰

12、較少基線較平， 故選擇 210nm 為吸收波長。流動相選擇時使用了甲醇-0.1mol/L乙酸銨（85 : 15）、 甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（87 : 13 : 0.04 : 0.02）,兩種流動相 得到的齊墩果酸峰型都較好，供試品主峰都能與雜峰得到分 離，因此參考 2010版中國藥典（一部）翼首草含量測定的流動相選擇，故選擇甲醇 -0.1mol/L 乙酸銨作為流動相。綜上所述，研究建立的HPLC測定小花清風(fēng)藤中齊墩果酸的方法對齊墩果酸的分離較好，方法簡單，靈敏，精確度 高，可作為小花清風(fēng)藤的質(zhì)量控制指標(biāo)。參考文獻(xiàn)1 貴州省藥品監(jiān)督管理局 . 貴州省中藥材、 民族藥材質(zhì) 量標(biāo)準(zhǔn)S.貴陽：2003 : 57.2 劉易蓉，邱曉春，陳惠 .小花清風(fēng)藤保肝作用實驗研究J.中國藥房，2008，19（ 30）： 2341.3 林材，梁光義.清風(fēng)藤等中藥化學(xué)成分的研究 D.貴陽: 貴州大學(xué)，