酶分子定向進(jìn)化

1、酶分子定向進(jìn)化技術(shù) 天然酶的應(yīng)用及局限性 酶的定向進(jìn)化的思想 酶的定向進(jìn)化的策略和方法 酶的定向進(jìn)化技術(shù)的展望 生物體系之所以能夠相對(duì)獨(dú)立地存在于自 然界中, ,并維持其獨(dú)立性和生命的延續(xù)性, ,都 是因?yàn)樯矬w內(nèi)的一系列酶在發(fā)揮著作用. . 酶保證了生物體內(nèi)組成生命活動(dòng)的大量生 化反應(yīng)得以按照預(yù)定的方向有序, ,精確而順 利地進(jìn)行, ,幾乎所有生物的生理現(xiàn)象都與酶 的作用緊密相關(guān), ,可以這樣說(shuō), ,沒(méi)有酶的存在, , 就沒(méi)有生物體的一切生命活動(dòng). . 天然酶的局限性 隨著酶催化應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大和研究的 逐步深入, ,研究者發(fā)現(xiàn), ,酶催化的精確性和有 效性常常不能很好地滿足酶學(xué)研究和工業(yè)

2、 化應(yīng)用的要求, ,而且天然酶的穩(wěn)定性差, ,活性 低使催化效率很低, ,還缺乏有商業(yè)價(jià)值的催 化功能 天然酶的局限性源于酶的自然進(jìn)化過(guò)程. 現(xiàn)代生物工程對(duì)酶的要求 能具備長(zhǎng)期穩(wěn)定性和活性 能適用于水及非水相環(huán)境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的 合成底物 進(jìn)一步增強(qiáng)酶對(duì)多種底物的分解能力 如何利用相對(duì)簡(jiǎn)單的方法以達(dá)到對(duì)天然酶 的改造或構(gòu)建新的非天然酶就顯得非常有 研究意義和應(yīng)用前景. 1993年,美國(guó)科學(xué)家Arnold F H首先提出酶分 子的定向進(jìn)化的概念,并用于天然酶的改造或 構(gòu)建新的非天然酶. 定向進(jìn)化 定向進(jìn)化是模擬自然進(jìn)化的過(guò)程，進(jìn)行人工 隨機(jī)突變，并在特定的環(huán)境條件下進(jìn)行選擇

3、， 使進(jìn)化朝著人們所需要的方向發(fā)展的技術(shù)過(guò) 程。 分為分子定向進(jìn)化和細(xì)胞定向進(jìn)化 細(xì)胞定向進(jìn)化 細(xì)胞定向進(jìn)化是在細(xì)胞水平上進(jìn)行定向進(jìn)化 的過(guò)程，以各種細(xì)胞為進(jìn)化對(duì)象，目的是改 良細(xì)胞的各種特征，主要包括微生物細(xì)胞的 定向進(jìn)化、動(dòng)物細(xì)胞的定向進(jìn)化、植物細(xì)胞 的定向進(jìn)化等。 隨機(jī)突變方法有全基因組重排技術(shù)。 基因組重排技術(shù)通過(guò)把誘變與細(xì)胞融合技術(shù) 相結(jié)合，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因組重排，從而大幅 度增加細(xì)胞的正突變頻率。 分子定向進(jìn)化 分子定向進(jìn)化是在分子水平上進(jìn)行定向進(jìn)化 的過(guò)程。 分子定向進(jìn)化首先要通過(guò)從細(xì)胞內(nèi)提取或者 通過(guò)PCRPCR等方法獲得目標(biāo)分子的基因，在體 外采用易錯(cuò)PCR PCR 、重排、基

4、因家族重 排等技術(shù)進(jìn)行人工突變，然后進(jìn)行定向選擇 而獲得所需突變體。 酶分子定向進(jìn)化 簡(jiǎn)稱(chēng)酶定向進(jìn)化，是模擬自然進(jìn)化過(guò)程（隨 機(jī)突變和自然選擇），在體外進(jìn)行酶基因的 人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫(kù)，在人工 控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有 優(yōu)良催化特征的酶的突變體的技術(shù)過(guò)程。 酶定向進(jìn)化的基本過(guò)程 隨機(jī)突變、構(gòu)建突變基因文庫(kù)、定向選擇 酶定向進(jìn)化的基本過(guò)程： 酶基因 隨機(jī)突變 構(gòu)建突變基因文庫(kù) 篩選 負(fù)突變基因 正突變基因進(jìn)化酶 反復(fù)進(jìn)行 隨機(jī)突變的策略 易錯(cuò)PCRPCR技術(shù)(error-prone PCR)(error-prone PCR) DNADNA改組(DNA shuflling

5、):(DNA shuflling):由美國(guó)Stemmer Stemmer 于1994 1994 年首次提出 一項(xiàng)體外重組技術(shù) 隨機(jī)引發(fā)重組(RPR) 1998 (RPR) 1998 年,Arnold ,Arnold 提出了一 種有效的新方法 交錯(cuò)延伸技術(shù)(StEP):(StEP):由Zhao Zhao 等 提出, , 是一種簡(jiǎn) 化的DNA shuffling DNA shuffling 技術(shù) 基因家族重排技術(shù) 酶定向進(jìn)化的特點(diǎn) 1 1 適應(yīng)面廣 2 2 目的性強(qiáng) 3 3 效果顯著 第二節(jié) 酶基因的隨機(jī)突變 體外隨機(jī)突變的方法：PCRPCR技術(shù)、DNADNA重排 技術(shù)、基因家族重排技術(shù) 基因隨機(jī)

6、突變方法的特點(diǎn)P207P207表8 81 1 隨機(jī)突變方法可以聯(lián)合使用，交叉進(jìn)行，通 過(guò)多次試驗(yàn)，反復(fù)篩選，以完成對(duì)酶的定向 進(jìn)化。 一 易錯(cuò)PCR技術(shù) 在PCRPCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)改變反應(yīng)條件， 增加堿基配對(duì)錯(cuò)誤的出現(xiàn)頻率，就成為易錯(cuò) PCRPCR技術(shù)。 可以通過(guò)提高鎂離子濃度、添加一定濃度的 錳離子、改變4 4種底物（dAMPdAMP、dTMPdTMP、 dCMPdCMP、dGMPdGMP）的濃度比等反應(yīng)條件，使 DNADNA聚合酶在催化基因擴(kuò)增時(shí)，增加堿基配 對(duì)錯(cuò)誤的出現(xiàn)頻率，而引起基因突變。 特點(diǎn) 正突變的概率低，突變基因文庫(kù)較大，文庫(kù) 篩選的工作量大，一般適用于較小基因的定 向進(jìn)

7、化。 二 DNADNA重排技術(shù) 概念：又稱(chēng)為DNADNA改組技術(shù)，是從正突變 基因文庫(kù)中分離得到的同源DNADNA，用酶切 割成隨機(jī)片斷，經(jīng)過(guò)不加引物的多次PCRPCR循 環(huán)，使DNADNA的堿基序列重新排布而引起基 因突變的技術(shù)過(guò)程。 DNA重排技術(shù)的基本過(guò)程 兩條以上正突變基因 DNADNA隨機(jī)片斷 突變基因 構(gòu)建突變基因文庫(kù) 篩選 負(fù)突變基因 正突變基因進(jìn)化酶 酶切 （反復(fù)進(jìn)行） 無(wú)引物PCRPCR 基因重組 酶切 DNADNA重排技術(shù)將兩條或多條正突變基因通過(guò)脫氧核 糖核算酶（DNase )DNase )等酶的作用，隨機(jī)切割成若 干DNADNA片斷，然后將這些隨機(jī)片斷在不加引物的條 件

8、下經(jīng)過(guò)多次PCRPCR循環(huán)，使這些DNADNA隨機(jī)片斷互為 模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增、延伸，再加入適宜的引物進(jìn) 行PCRPCR反應(yīng)，獲得全長(zhǎng)基因。 這些全長(zhǎng)基因由于是在不加引物的條件下由DNADNA隨 機(jī)片斷互為模板和引物擴(kuò)增而成的，其堿基序列經(jīng) 過(guò)重新排布而形成眾多的突變基因。 1 1）交錯(cuò)延伸PCRPCR技術(shù)：在同一個(gè)反應(yīng)體系中以?xún)蓚€(gè) 或多個(gè)相關(guān)的DNADNA片斷為模板進(jìn)行PCRPCR反應(yīng)，把 PCRPCR反應(yīng)中常規(guī)的退火和延伸合并為一步，并且大 大縮短了反應(yīng)時(shí)間（5555，5s)5s)。在反應(yīng)過(guò)程中，引 物先與一個(gè)模板結(jié)合，進(jìn)行延伸，隨之進(jìn)行多次變 性和短時(shí)的退火延伸反應(yīng)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)中，

9、不同長(zhǎng)度的延伸片斷在變性時(shí)與原先的模板分開(kāi)， 退火時(shí)與另一個(gè)模板結(jié)合，再進(jìn)行延伸。通過(guò)在不 同的模板上交替延伸，所合成的DNADNA片斷中包含有 不同模板上的信息，直到獲得全長(zhǎng)的突變基因?yàn)橹埂?2 2）隨機(jī)引物體外重組技術(shù) 采用單鏈DNADNA為模板，配合若干條隨機(jī)序列 的引物進(jìn)行PCRPCR反應(yīng)，產(chǎn)生若干個(gè)與模板不 同部分的序列互補(bǔ)DNADNA小片斷，然后除去模 板，這些DNADNA小片斷互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò) 增，通過(guò)堿基序列的重新排布而獲得全長(zhǎng)突 變基因。 三基因家族重排技術(shù) 概念 又稱(chēng)為基因家族改組技術(shù)，是從基因家族 的若干同源基因出發(fā)，用酶(DNase )(DNase )切割 成隨機(jī)片

10、斷，經(jīng)過(guò)不加引物的多次PCRPCR循環(huán)， 使DNADNA的堿基序列發(fā)生重新排布而引起基 因突變的技術(shù)過(guò)程。 基因家族重排技術(shù)的基本過(guò)程 基因家族若干同源基因 酶切 DNADNA隨機(jī)片斷 突變基因 突變基因文庫(kù) 基因重組 篩選 負(fù)突變基因 正突變基因 進(jìn)化酶 無(wú)引物PCRPCR 酶切 反復(fù)進(jìn)行 DNADNA家族重排技術(shù)與DNADNA重排技術(shù)的異同點(diǎn) 相同點(diǎn)：DNADNA家族重排技術(shù)與DNADNA重排技術(shù)的過(guò)程 大致相同，都要經(jīng)過(guò)基因的隨機(jī)切割、無(wú)引物PCRPCR 等步驟以獲得突變基因，然后經(jīng)過(guò)構(gòu)建突變基因文 庫(kù)、采用高通量篩選技術(shù)篩選獲得正突變基因。 不同點(diǎn)： DNADNA家族重排技術(shù)從基因家族

11、的若干同源 基因出發(fā)進(jìn)行DNADNA序列的重新排布，而后者則從采 用易錯(cuò)PCRPCR等技術(shù)所獲得的兩個(gè)以上的正突變基因 出發(fā)進(jìn)行DNADNA序列的重新排布。 第三節(jié) 酶突變基因的定向選擇 突變基因的定向選擇基本過(guò)程 突變基因基因載體 突變基因文庫(kù) 基因重組 篩選 目的基因 一 酶突變基因文庫(kù)的構(gòu)建 （一）構(gòu)建基因文庫(kù)的質(zhì)量要求 1 1 文庫(kù)的包容性: :指構(gòu)建的文庫(kù)必須盡可能地 包含基因的任何一種可能的突變信息。 2 2 文庫(kù)的完整性：指文庫(kù)中包含的DNADNA片斷 必須盡可能完整地反應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)和功能信 息，以便通過(guò)篩選得到的突變基因能夠通過(guò) 表達(dá)獲得完整的具有催化功能的進(jìn)化酶。 （二）構(gòu)建

12、突變基因文庫(kù)的主要過(guò)程 載體的選擇 1 1）質(zhì)粒載體：微生物細(xì)胞染色體外，閉合環(huán)狀雙鏈 DNADNA分子。 2 2）噬菌體DNADNA載體：由噬菌體DNADNA改造而成的具有 自我復(fù)制能力的載體。 3 3）黏粒載體：是一類(lèi)人工構(gòu)建的含有DNADNA黏性末 端和質(zhì)粒復(fù)制子的質(zhì)粒載體，又稱(chēng)為柯斯質(zhì)粒。 4 4）噬菌粒載體：是一類(lèi)人工構(gòu)建的由M13M13噬菌體單鏈 DNADNA的基因間隔區(qū)與質(zhì)粒載體結(jié)合而成的基因載體。 基因重組 在體外通過(guò)DNADNA連接酶的作用，將基因與載體 連接在一起形成重組DNADNA的技術(shù)過(guò)程。 黏性末端連接 平頭末端連接 修飾末端連接 形成基因文庫(kù) 將重組DNADNA轉(zhuǎn)入

13、受體細(xì)胞或包裝成有感染活性 的噬菌體的過(guò)程。 重組質(zhì)粒載體：轉(zhuǎn)化 重組噬菌體DNADNA載體：需要用噬菌體外殼蛋白 將重組DNADNA進(jìn)行包裝，稱(chēng)為有感染活性的重 組噬菌體，而形成基因文庫(kù)。 二突變基因的篩選 （一）定向選擇環(huán)境條件的設(shè)定 （1 1）提高酶的穩(wěn)定性，高溫篩選重組細(xì)胞，每一 次突變篩選的循環(huán)中逐步提高重組細(xì)胞的培養(yǎng) 溫度。 （2 2）如果定向進(jìn)化的目的是提高內(nèi)酰胺酶的 活性，從而提高對(duì)內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素的耐受性， 可以通過(guò)在含有一定濃度的內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組細(xì)胞，并在每一次突變篩 選循環(huán)中逐步提高抗生素的濃度。 （二）高通量篩選技術(shù)P217P217表8 82 2 一 平板篩選法 平板篩選法所依據(jù)的重組細(xì)胞的表型包括細(xì) 胞生長(zhǎng)情況、顏色變化情況、透明圈情況。 1 1）依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況篩選突變基因 在提高酶的熱穩(wěn)定性、抗生素耐受性、pHpH穩(wěn)定 性和對(duì)其他極端環(huán)境條件的耐受能力等方面 有廣泛應(yīng)用。 2 2）依據(jù)顏色變化篩選突變基因 （1 1）在采用噬菌體DNADNA載體構(gòu)建突變基因文庫(kù)時(shí)， 可以用大腸桿菌半乳糖苷酶的基因片斷 （lacZlacZ）插入到噬菌體DNADNA的間隔區(qū)域中，當(dāng)它 感染了相應(yīng)的大腸桿菌宿主細(xì)胞時(shí)，在含