電泳和電色譜學(xué)習(xí)課件

1、電泳的基本原理電泳的基本原理 帶電的膠?；虼蠓肿釉谕饧与妶?chǎng)中，向帶相帶電的膠?；虼蠓肿釉谕饧与妶?chǎng)中，向帶相 反電荷的電極作定向移動(dòng)的現(xiàn)象稱為反電荷的電極作定向移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳電泳。生物。生物 分子都帶電荷，其電荷的多少取決于分子性質(zhì)及分子都帶電荷，其電荷的多少取決于分子性質(zhì)及 其所在介質(zhì)的其所在介質(zhì)的pHpH及其組成。及其組成。 由于混合物中各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)由于混合物中各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù) 量以及分子量的不同，在同一電場(chǎng)的作用下，各量以及分子量的不同，在同一電場(chǎng)的作用下，各 組分泳動(dòng)的方向和速度也各異。因此，在一定時(shí)組分泳動(dòng)的方向和速度也各異。因此，在一定時(shí) 間內(nèi)各組分移動(dòng)的

2、距離不同，從而達(dá)到分離鑒定間內(nèi)各組分移動(dòng)的距離不同，從而達(dá)到分離鑒定 各組分的目的。各組分的目的。 在電場(chǎng)中，推動(dòng)帶電質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)的力（在電場(chǎng)中，推動(dòng)帶電質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)的力（F F）等于）等于 質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷量（質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷量（QQ）與電場(chǎng)強(qiáng)度（）與電場(chǎng)強(qiáng)度（X X）的）的 乘積。乘積。 F FQX QX 質(zhì)點(diǎn)的前移同樣要受到阻力（質(zhì)點(diǎn)的前移同樣要受到阻力（ f f ）的影響，）的影響， 對(duì)于一個(gè)球形質(zhì)點(diǎn)，服從對(duì)于一個(gè)球形質(zhì)點(diǎn)，服從StokeStoke定律，即：定律，即：f f 6 r 6 r （r r為質(zhì)點(diǎn)半徑，為質(zhì)點(diǎn)半徑， 為介質(zhì)粘滯系數(shù)，為介質(zhì)粘滯系數(shù)， 為質(zhì)點(diǎn)移動(dòng)速度）為質(zhì)點(diǎn)移動(dòng)速度） 當(dāng)質(zhì)點(diǎn)

3、在電場(chǎng)中作穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)時(shí)：F F f 即： QXQX6r6r 遷移率遷移率u u：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)強(qiáng)度下的電泳速度，：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)強(qiáng)度下的電泳速度， 粒子的粒子的 遷移率在一定條件下決定于粒子本身的性質(zhì)即其遷移率在一定條件下決定于粒子本身的性質(zhì)即其 所帶電荷及大小和形狀。所帶電荷及大小和形狀。 uv/E=q/6r v=QX /6r 在具體實(shí)驗(yàn)中，移動(dòng)速度V為單位時(shí)間t（單位為 s）內(nèi)移動(dòng)的距離d（單位為cm），即Vd/t。電 場(chǎng)強(qiáng)度X為單位距離L（單位為cm）內(nèi)電勢(shì)差E （單位為伏特），即 XE/L。將這兩個(gè)公式代入上述公式，得到 U=v/X=dL/Et d=u*Et/L 由此可以得到兩種物質(zhì)移動(dòng)距離的差為

4、d=(dA-dB)=(uA-uB)Et/L 從這個(gè)公式可以看出物質(zhì)能否進(jìn)行分離決定于二 者的遷移率。 影 響 因 素 1.1. 待分離大分子的性質(zhì)待分離大分子的性質(zhì) ：所帶的電荷、分子大小和：所帶的電荷、分子大小和 形狀，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接形狀，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接 近球形，則其電泳遷移速度越快近球形，則其電泳遷移速度越快 2. 2. 緩沖液緩沖液pHpH和離子強(qiáng)度和離子強(qiáng)度：pHpH值距離其等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，值距離其等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)， 其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大 ；但；但 是是pHpH過高或過低引起蛋白變性，緩沖

5、液通常要保持過高或過低引起蛋白變性，緩沖液通常要保持 一定的離子強(qiáng)度；強(qiáng)度過低，則緩沖能力差，不易一定的離子強(qiáng)度；強(qiáng)度過低，則緩沖能力差，不易 維持維持PHPH恒定，離子強(qiáng)度過高，在待分離分子周圍形恒定，離子強(qiáng)度過高，在待分離分子周圍形 成較強(qiáng)的帶相反電荷的離子擴(kuò)散層（即離子氛），成較強(qiáng)的帶相反電荷的離子擴(kuò)散層（即離子氛）， 降低了蛋白質(zhì)的帶電量，使電泳速度減慢。一般所降低了蛋白質(zhì)的帶電量，使電泳速度減慢。一般所 用離子強(qiáng)度為用離子強(qiáng)度為0.02-0.20.02-0.2之間。之間。 3. 電場(chǎng)強(qiáng)度：過高過高，產(chǎn)熱，樣品和，產(chǎn)熱，樣品和BufferBuffer擴(kuò)散增擴(kuò)散增 加，條帶增寬；蛋白變性

6、。加，條帶增寬；蛋白變性。過低過低，電泳時(shí)間增，電泳時(shí)間增 加，擴(kuò)散。當(dāng)需要增大電場(chǎng)強(qiáng)度以縮短電泳時(shí)加，擴(kuò)散。當(dāng)需要增大電場(chǎng)強(qiáng)度以縮短電泳時(shí) 間時(shí)，需附有冷卻裝置間時(shí)，需附有冷卻裝置 4. 電滲 ：在在 電場(chǎng)中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移電場(chǎng)中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移 動(dòng)；當(dāng)電滲方向與電泳方向一致時(shí)，會(huì)加快顆動(dòng)；當(dāng)電滲方向與電泳方向一致時(shí)，會(huì)加快顆 粒泳動(dòng)速度，反之，當(dāng)兩者方向相反時(shí)，會(huì)減粒泳動(dòng)速度，反之，當(dāng)兩者方向相反時(shí)，會(huì)減 慢顆粒泳動(dòng)速度。慢顆粒泳動(dòng)速度。 5. 5. 支持介質(zhì)的篩孔支持介質(zhì)的篩孔 ：篩孔越小，則顆粒在移動(dòng)篩孔越小，則顆粒在移動(dòng) 的過程中所受到的阻力也就越大的過程中所受到的阻

7、力也就越大 分 類 按按支持介質(zhì)支持介質(zhì)的不同可分為：的不同可分為： 紙電泳（紙電泳（Paper electrophorisisPaper electrophorisis） 醋酸纖維薄膜電泳（醋酸纖維薄膜電泳（Cellulose Acetate Cellulose Acetate electrophoresiselectrophoresis） 瓊脂凝膠電泳（瓊脂凝膠電泳（Agar Gel electrophoresisAgar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel Polyacrylamide Gel elect

8、rophoresiselectrophoresis）（）（PAGEPAGE） SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSSDSPAGEPAGE）。）。 按按支持介質(zhì)形狀支持介質(zhì)形狀不同可分為：不同可分為： 薄層電泳薄層電泳 ； 板電泳板電泳 ； 柱電泳柱電泳 分類 區(qū)帶電泳 不同的離子在均一的緩沖液體系中分離形成獨(dú)立的區(qū)帶。 等速電泳 區(qū)帶相隨分成清晰的界面，等速移動(dòng)。 等電聚焦 影響因素 電荷，電場(chǎng)強(qiáng)度（強(qiáng)，快），溶液pH，離子強(qiáng)度（高，慢），電滲現(xiàn)象 （區(qū)別分析），支持物（均勻，吸附力?。瑴囟龋ǜ?，快，擴(kuò)散也快） Electrophoresis (電泳電泳)Nucleic

9、 acids lDNA 4;4分鐘可分離1010種蛋白質(zhì). . 試樣用量少：僅需幾nLnL（1010-9 -9 L L）的試樣 儀器簡(jiǎn)單，操作成本低：分析一個(gè)試樣僅需幾毫升流動(dòng)液。 不足之處： 進(jìn)樣不夠方便。應(yīng)用范圍相對(duì)較窄。 分析陰離子時(shí)，由陰極進(jìn)樣，在陽(yáng)極檢測(cè)。但電滲流方向與 陰離子受電場(chǎng)力作用移動(dòng)方向相反，出峰時(shí)間較長(zhǎng)。 逆向作用色譜電泳 counteracting chromatographic electrophoresis，CACECACE 連續(xù)逆向色譜電泳結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率連續(xù)逆向色譜電泳結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率 和液相色譜的大處理能力，成為一種新型高效和液相色譜的大處理能

10、力，成為一種新型高效 的蛋白質(zhì)分離與純化方法。的蛋白質(zhì)分離與純化方法。CACECACE在在O O Farrell Farrell 19811981年提出之后已進(jìn)行了大量的理論與實(shí)驗(yàn)研年提出之后已進(jìn)行了大量的理論與實(shí)驗(yàn)研 究，研究工作主要集中在間歇操作過程。究，研究工作主要集中在間歇操作過程。 I 區(qū)凝膠顆粒內(nèi)孔隙度小，蛋白質(zhì)能滲入的體積小，為排阻區(qū)； II區(qū)凝膠顆粒內(nèi)孔隙度大，蛋白質(zhì)能滲入的體積大，為滲入?yún)^(qū)。 蛋白質(zhì)隨載液流過分離柱時(shí)，I區(qū)內(nèi)流速大于II區(qū)內(nèi)流速。調(diào)節(jié)直 流電場(chǎng)強(qiáng)度，使目標(biāo)蛋白質(zhì)逆向電泳速度介于兩區(qū)流速之間，目 標(biāo)蛋白質(zhì)就在兩區(qū)交界面處富集，交界面處蛋白質(zhì)濃度增加，導(dǎo) 致平衡離

11、子濃度增加，電導(dǎo)增加，電場(chǎng)強(qiáng)度下降，電泳速度下降， 使目標(biāo)蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)速度為零，結(jié)果加入分離柱內(nèi)的目標(biāo)蛋白質(zhì)富 集在交界面，并隨加入量的增加向II區(qū)發(fā)展. 為實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作和滿足在線檢測(cè)的需要，在分離柱中設(shè)置 不含凝膠的富集區(qū)，使目標(biāo)蛋白質(zhì)在此區(qū)域內(nèi)連續(xù)富集.把 圖1中的交界面沿軸向擴(kuò)展(圖2)成為不含凝膠的富集區(qū)(A 區(qū))，A區(qū)內(nèi)流速小于I區(qū)、II區(qū)內(nèi)流速. 在I區(qū)，目標(biāo)蛋白質(zhì)流速大于電泳速度而向A區(qū)運(yùn)動(dòng);在II區(qū)， 目標(biāo)蛋白質(zhì)流速小于電泳速度，也向A區(qū)運(yùn)動(dòng)，因而目標(biāo)蛋 白質(zhì)向A區(qū)積累。 在A區(qū)電泳速度大于流速，并隨著濃度增加而逐漸下降，最 后電場(chǎng)與流場(chǎng)達(dá)到逆向動(dòng)態(tài)平衡，目標(biāo)蛋白質(zhì)在A區(qū)連續(xù)富

12、集. 高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳 應(yīng)用與進(jìn)展應(yīng)用與進(jìn)展 一、離子分析 analysis of ion 陽(yáng)離子分析 遷移方向和電滲流 方向一致； 4.5min內(nèi)分離了24 種金屬離子； 陽(yáng)極進(jìn)樣，陰極檢測(cè)； 具有很高的靈敏度； 陰離子分析 陰離子電泳方向和電滲流方 向相反、速度接近，分析時(shí)間 長(zhǎng)、效率低； 質(zhì)量小、電荷密度大的離子 如：SO4-2、Cl-、F-等，電泳速 率大于電滲流，陽(yáng)極端流出， 在陰極端無法檢測(cè)； 加入電滲流改性劑，十六烷 基三甲基溴化胺等，使電泳方 向和電滲流方向一致，可在 3.1min內(nèi)分離36種陰離子；陰 極進(jìn)樣，陽(yáng)極檢測(cè)； 離子價(jià)態(tài)及存在形態(tài)分析； 二、藥物分析 a

13、nalysis of pharmaceutics 檢測(cè)體液或細(xì)胞中 某些代謝產(chǎn)物的分析； 尿液中的氨基酸含 量作為臨床診斷糖尿病 的輔助手段； 采用毛細(xì)管區(qū)帶電 泳方式，在11min內(nèi)分離 17種藥物； 采用MEKC模式， 鑒定違禁藥物； 效果優(yōu)于HPLG法 膠束電動(dòng)力學(xué)色譜 三、手性化合物分析 analysis of chiral compounds 合成獲得單一手性化合物相當(dāng)困難；528種手性合成藥物， 61種以單一對(duì)映體形式銷售，其他為外消旋體；檢測(cè)分析也 相當(dāng)困難；研究熱點(diǎn)；R-反應(yīng)停是安眠藥，S-式致胎兒畸形； HPCE分離分析手性化合物的方法：加入手性選擇劑； 形成配合物的穩(wěn)定常數(shù)

14、有差異，結(jié)合HPCE的高效率； 常用手性選擇劑：環(huán)糊精及其衍生物；手性冠醚；手性 表面活性劑（氨基酸衍生物、膽酸鈉、?；敲撗跄懰峒捌溻c 鹽、低聚糖等天然手性表面活性劑） 四、氨基酸與蛋白質(zhì)分析 analysis of amino acids 采用MEKC模式，在25分鐘內(nèi)分離了23種丹酰化氨基酸； HPCE可取代傳統(tǒng)的氨基酸分析儀； 問題：吸附和檢測(cè)； 蛋白質(zhì)分析 五、核酸分析及DNADNA排序 analysis of nucleic acids and sequence of DNA 重要分析手段； 圖，酶解的雙螺旋 DNA限制性片段的 分離； 六、新進(jìn)展 advances and spec

15、ial topics 1.1.微型化微型化 整體化學(xué)分析系統(tǒng)（TAS）及TAS微型化 在硅片上光刻出矩形槽作為毛細(xì)管，理論塔板數(shù)105/m； 2.2.聯(lián)用儀器聯(lián)用儀器 CE-MS； 3.3.陣列毛細(xì)管凝膠電泳陣列毛細(xì)管凝膠電泳 應(yīng)用于人類基因DNA測(cè)序； 510萬(wàn)個(gè)基因，30億個(gè)堿基對(duì)，目前最有效的DNA序列 分析儀，10小時(shí)/次；可同時(shí)電泳24個(gè)樣品；速度1200堿基對(duì) /小時(shí)，提高速度！ 100支毛細(xì)管陣列電泳；速度280堿基對(duì)/小時(shí)/支 20世紀(jì)3040年代 蒂塞利烏斯 (A.W.K.Tiselius） 建立了移動(dòng)界面電泳，將電 泳發(fā)展成分離技術(shù) 獲得1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) l 1981

16、年 J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs實(shí)驗(yàn)上和理論上 為毛細(xì)管電泳的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。 上一世紀(jì)后二十多年分析化學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展最迅速的分離分 析方法。 Electrophoresis (電泳電泳)Nucleic acids lDNA & RNA的分離 瓊脂糖凝膠電泳 EB(溴化乙啶)或Goldenview染色 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖 (A(A為正面,B,B為剖面) ) (1)(1)樣品膠pH6.7 (2)pH6.7 (2)濃縮膠pH6.7 pH6.7 (3)(3)分離膠pH8.9 (4)pH8.9 (4)電極緩沖液pH8.3pH8.3 注意事項(xiàng) 1. 不是所有的蛋白質(zhì)都能用SDS-凝膠電泳法測(cè)定其分子量， 已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方法測(cè)出的分子量是不可靠的。包 括：電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì) （如某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。例如組 蛋白F1，它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比 例的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子