微量凱氏定氮法測定蛋白質含量

1、南昌丸爭實驗報告實驗課程：微量凱氏定氮法測定蛋白質含量學生姓名：xxx學 號: XXX專業(yè)班級： XXX2017年4月11日實驗背景：凱氏定氮法： 測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。 該方法 在有催化劑的條件下， 用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機 銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉化為氨， 隨水蒸氣餾出并為過 量的酸液吸收，再以標準堿滴定，就可計算出樣品中的氮量。由 于蛋白質含氮量比較恒定，可由物質含氮量計算其蛋白質含量， 故此法是經典的蛋白質定量方法。一、實驗目的1、掌握凱氏( Kjeldahl )定氮法測定蛋白質含量的原理方法；2、學會使用凱式定氮儀。二、實驗原理蛋白質是含氮的化合物。

2、 凱氏定氮法首先將含氮有機物與濃硫酸 共熱，經一系列的分解、碳化和氧化還原反應等復雜過程，最后 有機氮轉變?yōu)闊o機氮硫酸銨， 這一過程稱為有機物的消化。 消化 完成后， 將消化液轉入凱氏定氮儀反應室， 加入過量的濃氫氧化 鈉，將NH4+轉變成NH3，通過蒸餾把NH3驅入過量的硼酸溶液 接收瓶內，硼酸接收氨后，形成四硼酸銨，然后用鹽酸標準溶液 滴定，直到硼酸溶液恢復原來的氫離子濃度。 滴定消耗的標準鹽 酸摩爾數即為NH3的摩爾數，通過計算即可得出總氮量。 測定出 的含氮量是樣品的總氮量， 其中包括有機氮和無機氮。 以甘氨酸 為例，其反應式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4 f 2CO2+3S

3、O2+4H2O+NH3( 1 )2NH3 +H2SO4 f (NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4+2NaOH f 2H2O+Na2SO4+2NH 3 T(3)三、實驗器材和試劑1、實驗器材：凱氏定氮蒸餾裝置、50ml錐形瓶3個、酸式滴定管、酒精燈2、實驗試劑：濃硫酸、30%氫氧化鈉溶液、2%硼酸指示劑0.2M HCL四、實驗步驟1、定氮儀的洗滌1）測定前定氮裝置如下法洗滌 23 次：從樣品進口入加水適 量（約占反應管三分之一體積）通入蒸汽煮沸，產生的蒸汽沖洗冷凝管，數分鐘后關閉夾子P3,使反應管中的廢液倒吸流到反應 室外層，打開夾子 P1 由橡皮管排出，如此數次。（2）用蒸汽洗滌反應室約

4、 10min 后，在冷凝管末端小玻璃管的 位置放上一個盛硼酸 -指示劑混合液的錐形瓶，將瓶傾斜，以保 證冷凝管末端連接的小玻璃管完全浸于液體內。繼續(xù)蒸餾12min。觀察錐形瓶內溶液是否變色， 如不變色，則證明反應室內部已洗滌干凈；如果混合液變綠，說明定氮儀內有殘留氨，沒 有洗滌干凈，需要進一步用蒸汽洗滌。2、蒸餾（1）準備工作：蒸餾器洗凈后，開放水龍頭P3,使水進入A室， 水放至 A 室球部 2/3處即可。取 3個 50ml 的錐形瓶，分別加入 10ml 硼酸（內加有混合指示劑） 。用表面皿復蓋備用。（2）加樣：用移液管吸取 2ml消化液，小心地由漏斗 D傾入B 室，用少量蒸餾水沖洗漏斗 D。

5、取一個盛有硼酸的錐形瓶，置于M 管下，使管口置于硼酸溶液液面以下，將P4 夾緊, 向漏斗 D加入30%氫氧化鈉5ml，慢慢松開P4，使氫氧化鈉進入 B室， 但漏斗中始終保持一部分液體封閉， 往漏斗加入少量蒸餾水， 重 復以上過程，全程都要保持漏斗中的液體封閉。（ 3）蒸餾：用酒精燈加熱，維持火力恒定，沸騰不可高于Y 管口以免 A 室溶液從 Y 管倒吸，待第一滴蒸餾液從冷凝柱 F 頂端 滴下時起，繼續(xù)蒸餾5分鐘，然后將錐形瓶放低，使導管離開液 面再蒸2分鐘，最后用蒸餾水洗導管外壁，蒸餾完畢，取下錐形 瓶準備滴定。（4）空白蒸餾：用移液管分別吸取 2ml蒸餾水按上述操作步驟 進行蒸餾。3、滴定蒸餾

6、完畢，用微量酸式滴定管，以 0.01mol/L鹽酸標準溶液滴定 錐瓶內溶液，溶液由藍綠色變?yōu)榈仙蚧疑?，即為終點。記錄 所用鹽酸的量。五、實驗結果處理1、實驗數據實驗次序123實驗試劑空白樣品1樣品2蒸餾水/ml100樣液/ml011NaOH/ml555消耗HCI/ml0.050.850.80平均值0.050.8252、計算：（A B） x 0 214樣品的總氮含量（） =（）100CM 1000 X 10若測定的樣品含氮量部分只是蛋白質則: 樣品的總蛋白含量（%） =（A_B）0葬625 100C x 1000 x 10式中：A為滴定樣品用去的鹽酸平均毫升數；B為滴定空白用去的鹽酸平均毫升

7、數；C為稱量樣品的毫升數；0.2為鹽酸的當量 濃度（實際上，此項應按實驗中使用鹽酸的實際濃度填寫）；14 為氮的原子量；6.25為常數;100是配出的100ml消化液；10是面粉質量10g樣品的總蛋白含量（%）=：（.825 一0.05）214& 25100 = 13.57%1 1000 10由資料知面粉含量如圖從寫級二看，我們又可以把面粉分九特等粉、一竽粉、二等粉等各個等級蛋白睫|特諄粉7 2127o.4a高瀚面包冃10.70.45法弍茴包用二躺1150 54面包月該實驗數據測得的蛋白質量略高出標準值六、誤差分析與討論1、誤差分析（1）通常情況下，蛋白質含氮量在16%左右，其F值為6.25。

8、但是，實際上不同來源的蛋白質的氨基酸組成差別很大，含氮量的差別也很大，如乳制品、面粉、花生的蛋白質含氮量分別為15.67%、17.54% 和18.32%，則它們的F值分別為6.38、5.70和5.46。而計算中取F為6.25,會導致蛋白質含量值偏大。（2）樣品在空氣中易變質；（3）實驗用于滴定的HCI濃度過高，導致空白對照組僅滴定一滴便達到滴定終點，易產生操作誤差；2、問題討論實驗中應該注意些什么？本法適用于 0.05-3.0mg 氮，樣品中含氮量過高時， 則應減少取 樣量或將樣液稀釋。勿使樣品粘于燒瓶頸部。 放置液體樣品時， 需將吸管插至燒瓶 底部再放樣：如固體樣品， 可將樣品卷在紙內， 平插入燒瓶底部， 然后再將燒瓶直起，紙卷內的樣品即完全放在燒瓶底部。 參考文獻：中國知網 百科, 凱式定氮法GB/T 5009.5 200