QTOF質(zhì)譜材料培訓(xùn)

1、QTOF質(zhì)譜材料培訓(xùn)內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考儀器原理介紹電噴霧電離源（ ESI）套管的清洗、維護(hù)（如果需要可以演示操作）電噴霧電離源是一種軟電離方式，即便是分子量大，穩(wěn) 定性差的化合物，也不會在電離過程中發(fā)生分解， 它 適合于分析極性強(qiáng)的大分子有機(jī)化合物，如蛋白 質(zhì)、肽、糖等。（對于非極性、揮發(fā)性的待測化合 物，則不使用。） 電噴霧電離源的最大特點(diǎn)是容易形成多電荷離子。 這樣，一個分子量為 10000Da的分子若帶有 10個電 荷，則其質(zhì)荷比只有 1000Da，進(jìn)入了一般質(zhì)譜儀可 以分析的范圍之內(nèi)。 根據(jù)這一特點(diǎn)， 目前采用電噴 霧電離，可以測量分子量在 300000Da以上的蛋白 質(zhì)。（

2、因此由 ESI 電離源電離的質(zhì)譜儀在測量的分子 量范圍上，理論無上限，只需要調(diào)節(jié)條件，讓其帶上 更多的電荷即可。）內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考電離源幾個參數(shù)的意義1、毛細(xì)管電壓 （3KV8KV）控制合適的電壓，以便對于待測化合物有更好 的電離度并且在這個條件下不會發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)， 從而降低待測物質(zhì)的信號。 在負(fù)離子模式下， 由于 電壓過高，電離源尖端會出現(xiàn)紫色的尖端放電現(xiàn) 象，做樣品測試的時候要盡量避免， 防止由于尖端 放電，電壓過高使樣品發(fā)生裂解， 從而不能得到較 高豐度的分子離子峰。同時也會由于電流的產(chǎn)生， 損毀離子源內(nèi)的元件。2、去溶劑溫度（溶劑的最低的氣化溫度到最高的 氣化溫度之間）電

3、離源溫度是溶劑氣化的重要參數(shù)。軟件添加 附件之后可以將該參數(shù)設(shè)置到 350。對于水比較 多流動相而言，我們需要調(diào)高電離源的去溶劑溫度 以便水能最大程度液化， 因為有時候未氣化的水會 進(jìn)入到質(zhì)譜儀器內(nèi)部， 對一些閥門造成損壞。 （當(dāng) 然，對于水而言， 由于表面張力比較高， 很難形成 電噴霧，所以可以在不影響液相分離的情況下， 盡 量減少水的含量，避免信號的損失。） 3、錐孔電壓（根據(jù)靈敏度和分辨率進(jìn)行數(shù)值優(yōu)化）內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考錐孔也可以叫采樣孔，調(diào)節(jié)合適的錐孔電壓可 以增強(qiáng)儀器的靈敏度， 但是錐孔電壓過高會造成待 測化合物的源內(nèi)裂解。 造成非二級質(zhì)譜造成的碎片 峰的產(chǎn)生，不利于譜圖的

4、解析。4、去溶劑氣 去溶劑氣流量的選擇： 經(jīng)驗法選擇去溶劑氣， 一般 流動相的流速為 0.1mL/min 時候，選擇 100L/h 的 去溶劑氣流量， 0.2 mL/min 時選擇 200L/h 的去溶 劑氣流量，依次類推。去溶劑氣的流量必須穩(wěn)定， 需將液氮分壓表的分壓控制在 0.6 左右，否則做出 實驗的待測化合物的離子計數(shù)重現(xiàn)性很差。另外， 當(dāng)去溶劑氣流量升到 1000L/h 的時候，會發(fā)現(xiàn)去溶 劑溫度的反饋值保持在 300（如果預(yù)設(shè)為 350）， 屬于正?，F(xiàn)象?？偠灾婋x源的最佳使用效果是要保證從電離 源外觀看來，一定要產(chǎn)生錐形電噴霧。 從圖譜上看， 如果樣品量能保證在 mg/mL,

5、質(zhì)譜的響應(yīng)值能達(dá)到 103或者 104 數(shù)量級。如果未達(dá)到，分析思路： 1、 離子模式選擇是否正確。 2、離子源、錐孔是否清 潔。 3、所設(shè)的離子源數(shù)值是不是沒有得到相應(yīng)的 反饋值。 4、待測樣品是否適合用這種電離源進(jìn)行 電離。 5、儀器的靈敏度是不是不夠（在重新進(jìn)行 軟件的內(nèi)部資料經(jīng)驗交流僅供參考附件安裝之前，應(yīng)該保存ms tune方法參數(shù)，以防由于參數(shù)設(shè)置問題造成靈敏度下降）。兩種工作方式：1全掃描scan：指定的兩個質(zhì)核比間掃描每個離子的豐度。2. 僅檢測被選擇的一個或多個離子的豐度。飛行時間檢測器原理內(nèi)部資料經(jīng)驗交流僅供參考QUADRUPOLE M$TOF MSMS/MSZSPAYIO

6、N SOURCEHEXAPOteION BRIDGE|-niiiOUADRUPOtE(RESOLWfG)HEXAPCIECOLLISION CELLThe Q-TOF (Micromass) combines a quadrupole mass filter (MS1) and an orthogonally attached TOF mass analyzer (MS2) in one spectrometer. This delivers good precursor ion selection (R 1000) for MS/MS. For MS applications, the TO

7、F allows for higher resolution than a quadrupoleRtFLECTRON質(zhì)荷比與時間的平方成正比，只要測定出飛行時間，就可換算成質(zhì)荷比。在檢測時，顯然是質(zhì)荷比小的先到達(dá)檢測器，質(zhì)荷比大的后到達(dá)。在通常情況下，離子的飛行時間為微秒數(shù)量級。RF-only modeRF-only modeTOF spectrom(detect all ions)pusherdetector/ ,u TOF 9U 1 J tukx% /IIIrefrectron飛行時間性能指標(biāo):內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考1. 分辨率： RP = M / M（M:為測定的質(zhì)量， M:半峰高

8、的峰寬） 線性模式， 分辨串較低； 反射模式， 分辨率可高達(dá) 15000 “延遲引出”（DE）技術(shù)或稱“脈沖離子引出”（PIE）2. 質(zhì)量范圍：目前的商品儀器般可測到幾十 萬原子質(zhì)量單位（ u） 飛行時間在多肽， 蛋白質(zhì)，糖，核苷酸有廣泛的 應(yīng)用，能使有機(jī)質(zhì)譜測試難得到信號的物質(zhì)得到理 想譜圖。MCP檢測器微通道板與電子倍增器的作用類似， 都是離子 的物理型放大器。 與電子倍增器不同的是， MCP有 成像功能；但是在 TOFMS應(yīng)用中僅使用了電子倍增 功能。在微通道板的每個通道的內(nèi)壁上都涂有一種 能發(fā)射次級電子的半導(dǎo)體材料， 當(dāng)給微通道板加了 一定電壓后，就會在每個通道中產(chǎn)生一個均勻的電 場。

9、這個電場是軸向的。 所以能使進(jìn)入電場的低能 電子（光子或電子） 與壁碰撞的時候能產(chǎn)生次級電 子，并且在軸向電場的作用下次級電子被加速， 這 樣次級電子碰到壁上又會產(chǎn)生更多的新的次級電 子。這樣。對于一個入射粒子。 在板的輸出端就會 產(chǎn)生很多的電子。 實際上我們很容易理解， 每個通內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考道就是一個光電倍增管，不過它沒有專門的光陰 極，而且打拿極是連續(xù)分布的， 另外入射電子不只 限于光子， 事實上任何載能電子， 只要在通道壁上 能打出次級電子， 它都能響應(yīng)， 與光電倍增管外電 路分壓器相比擬，它利用鉛玻璃自身的體電阻作為 分壓電阻， 一般極間總電阻為 10歐，通道中的電勢 梯

10、度使次級電子得到加速， 獲得能量， 從而保證在 下一次轟擊通道時有足夠大的二次發(fā)射系數(shù)。 微通道板（ MCP）是由內(nèi)壁鍍有半導(dǎo)體層的微管規(guī) 則排列熔壓而形成的二維陣列， 可以將微弱電子圖 像或信號均勻放大到 10000倍以上。保持端面的清潔，不能用手觸摸。 避免碰撞，擠壓造成機(jī)械破損。避免真空不高的情況下加高壓， 以免引起通道 內(nèi)孔放電。防止兩端面間高壓擊穿造成絕緣破壞。 防止 MCP一次性直接暴露在強(qiáng)粒子束中。二級質(zhì)譜原理 在一級的基礎(chǔ)上，確定感興趣的母離子進(jìn)行碎 裂（借助四極桿進(jìn)行篩選， 使用碰撞池進(jìn)行碰撞碎 裂），碎裂機(jī)理為碰撞誘導(dǎo)解離。（ CID）本實驗 選擇在一級質(zhì)譜的基礎(chǔ)上選擇分子

11、量為 721的離子內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考進(jìn)行碰撞，可得到如下的質(zhì)譜圖，見其碎片峰。二級圖譜的碰撞電壓的選擇直接影響圖譜的 形成，對數(shù)據(jù)的解析有很大的影響。 最佳情況應(yīng)該 保證圖譜中存在 5%10%的原母離子和碎片離子， 若 碰撞電壓設(shè)置過高， 也會對碎片信息的獲得造成影 響，碎片過碎，碎片難以解析。二級質(zhì)譜的應(yīng)用 待測化合物的碎片獲得， 可以通過二級圖譜與 已知化合物的二級碎片進(jìn)行對比， 進(jìn)行待測化合物 的確定。半定量的方法 多肽測序 代謝產(chǎn)物的鑒定新開機(jī)后儀器使用、調(diào)諧一：開機(jī)1. 打開質(zhì)譜：總按鈕，抽真空與控制電壓按鈕2. 打開質(zhì)譜液相與電腦的中樞按鈕3. 打開電腦， MassLyn

12、x 軟件內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考注意： a. 如果 Mass Tune 界面是灰色的，而且沒 有時上時下的峰，則說明電腦與儀器連接不良。b. 如果電腦與儀器長期連接不良， 質(zhì)譜控制 電壓按鈕一定要處于關(guān)閉狀態(tài)， 以免質(zhì)譜內(nèi)電壓不 受控造成質(zhì)譜燒毀。二： MCP檢測器的老化（老化應(yīng)在真空 24 小時后 完成，觀察壓力表在 10-7 兆帕， Vaccum中的表指 針應(yīng)在綠色區(qū)域， 避免未達(dá)到真空度， MCP雙板電 極之間通電短路。 避免 MCP一次性暴露在強(qiáng)的粒子 流中）1. 打開 MS Tune 界面，點(diǎn)開 Press for operate （變綠）2. 將 Flight Tube 電壓逐

13、漸升至 5630V。（每隔 500V一升。）3.Options 中點(diǎn) MCP Conditioning ：Voltage ： start （ v） 0Stop（ v） 2300Time： start （ mins） 720Stop（ mins） 13. 開 始 之 后 12 小 時 Flight Tube 中 的 MCP Detector 為 2300v5. 關(guān)閉質(zhì)譜：將 Voltage 以 200v 為間隔降到 0v， 關(guān)閉 Press for operate （變紅）10內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考6.MCP電壓最高值是工程師調(diào)諧的， 若實驗過程中 發(fā)現(xiàn)精密度不高，也避免調(diào) MCP的電壓，

14、以免對 MCP造成損耗。三：質(zhì)譜校正校正溶液的選擇注意事項： 選擇能夠產(chǎn)生離子簇的 物質(zhì)，一般校正溶液的選擇與平時所測的物質(zhì)的分 子量范圍有關(guān)。1. 校正溶液異丙醇甲酸鈉的配制 （本實驗室常用校 正液）基本比例：以 10ml 異丙醇甲酸鈉為例A. 9ml 超純水放入容量瓶中， 用甲酸標(biāo)定，即得 10% 甲酸溶液。B. 將 0.5ml0.1mol/L 氫氧化鈉溶液與 0.5ml 甲酸 水溶液加入 10ml 容量瓶中C. 將體積比為 9:1 的異丙醇加入到“ 2”中的容量 瓶中標(biāo)定，即得甲酸鈉溶液。注意：有機(jī)相，水相分別過膜。2. 打開質(zhì)譜1、Press for operate 打開，點(diǎn)開兩個氣閥

15、。2、ES+ Source：capillary 調(diào)成 3350v（負(fù)離子 模式為 2600v，毛細(xì)管電壓可以根據(jù)不同化合物的 性 質(zhì) 做 出 調(diào) 節(jié) ， 總 體 范 圍 在 2kv8kv 之 間 ） desolvation temperature 調(diào)到 300（ 如果安裝 附件可以到達(dá) 350）11內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考3、Time of Flight ： Flight Tube 以 500v 為間隔 升到 5630v MCP Detector 以 200v 為間隔升到 2300v。開啟質(zhì)量校正頁面后，質(zhì)量校正前請先確 定目前儀器處于未校正的狀態(tài)，可以將 flie 文件 中的 Uncal

16、 No Calibration 。3. 連接校正液與質(zhì)譜， 打開校正液流速， 待質(zhì)譜有 信號后按” Acquire ”收集信號4. 一段時間后（ 3min 左右）將質(zhì)譜方法停止，觀 察 spectrum, 確定下分子量，在 MS Tune 中的 Calibration 中 查 詢 標(biāo) 準(zhǔn) 物 的 準(zhǔn) 確 分 子 量注意：由于經(jīng)常做的是天然產(chǎn)物，其分子量在400-500 之間，所以要校正 400-500 之間的數(shù)值。 （按 m/z 的需求對分子量進(jìn)行選擇， 若待測化合物 的分子量在 700 左右，則選擇 700 左右的分子量進(jìn) 行校正。）5. 計算 Leff 值，將計算后的 Leff 值輸入到

17、Option 里的 TDC setting 中，之后再進(jìn)行 3-4 操作，直 到采集到的分子量與查表得到的分子量小數(shù)點(diǎn)后 3 位一致即可6. 保存：A. 到 spectrum 中找到 process centre areas Tof okokfile saveB. MS Tune 中 Calibration From Files 找剛存12內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考的文件名稱點(diǎn)“ history ”（ acru mass ）點(diǎn) 最近那個時間 ok RMSr esidual 圖中的點(diǎn)若偏移 太大則刪去。（ 校正后保證質(zhì)量偏差在 10 個 10ppm）C. 再回到 MS Tune calibra

18、tion file save as 四、儀器靈敏度的調(diào)節(jié) 一般情況下，每一種待測化合物都有最適合自 己的電離條件，對于質(zhì)譜條件的優(yōu)化選用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn) 行，但是從科研角度而言， 這樣的工作一般做的比 較少的，除非是基于篩查的目的。 進(jìn)過標(biāo)準(zhǔn)品試液 之后，通過調(diào)節(jié)毛細(xì)管電壓、 電離源溫度、 去溶劑 溫度、去溶劑氣、電離源與錐孔距離的調(diào)節(jié)可以對 儀器靈敏度進(jìn)行優(yōu)化。 事實上，每一種化合物都有 最佳的質(zhì)譜條件，普適的靈敏度調(diào)節(jié)可以用接近儀 器最常使用的分子量范圍的校正液進(jìn)行。五、儀器的分辨率的調(diào)節(jié) 完成儀器的靈敏的調(diào)節(jié)之后可以對儀器的分 辨率進(jìn)行調(diào)節(jié)，本臺質(zhì)譜儀的分辨率為 5000左右， 相對于單四級桿的

19、 2002000的分辨率而言屬于高 分辨質(zhì)譜儀，并且分辨率主要由于飛行時間管提 供。但是相對于市場上高達(dá) 50000分辨率的質(zhì)譜而 言，分辨率就比較低了。 單峰法， R=M/半峰寬，調(diào) 節(jié) offset （微調(diào)）、毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、 MCP 檢測器電壓等參數(shù)， 但是比較繁瑣， 建議由專業(yè)工 程師進(jìn)行調(diào)節(jié)。并且 MCP檢測器電壓的調(diào)節(jié)對其使13內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考用壽命影響較大，應(yīng)該在專業(yè)工程師的引導(dǎo)下完 成。實際樣品的上機(jī)測試樣品前處理1. 選用試劑將樣品溶解，難溶解的物質(zhì)可超聲處 理。濃度不低于 1mg/ml。溶液可以在電離源發(fā)生 氣化，被真空系統(tǒng)抽走。 所以應(yīng)該選擇揮發(fā)性鹽溶

20、液作為流動相， 另外使用酸堿時， 應(yīng)盡量避免使用 三氟乙酸，以防其抑制樣品信號。2. 溶解后的樣品需要過膜處理 （但對于在膜上有吸 附的化合物，應(yīng)選用其他方法。）3. 若樣品經(jīng)過高速離心，即 30000rpm，樣品溶液 可以不過膜。流動相選擇1. 直接進(jìn)樣的方式：樣品溶劑多選用甲醇，乙腈， 異丙醇，乙醇和水等揮發(fā)性溶劑， 為了使樣品在溶 液中離子化， 通常使用揮發(fā)性的酸或堿如乙酸， 氨 水等調(diào)節(jié)溶液的 pH。一般流動相要與樣品溶解的 試劑保持一致。2. 常用的溶劑和緩沖液a 水、乙腈及甲醇 LC-MS 理想的溶劑b 乙酸和甲酸 可降低 LC流動相的 pH值以提高分 離度14內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流

21、僅供參考c 氫氧化銨 / 氨溶液 可提高 LC 流動相的 pH值 d 乙酸銨 是一種揮發(fā)性鹽， 用于緩沖流動相， 并 改善色譜分離而不影響 MS的性能。最大濃度不超 過 0.1mol/L 。（盡量控制鹽溶液濃度，以防鹽析 出堵塞毛細(xì)管） 離子模式的選擇1. 正離子模式適合于堿性樣品，可用乙酸（ pH3-4 ）或甲酸（ pH2-3 ）對樣品加以酸化。2. 負(fù)離子模式適合于酸性樣品， 可用氨水或三乙胺 對樣品進(jìn)行堿化。（ 10mmol/L50mmol/L）3. 有些酸堿性并不明確的化合物， 可優(yōu)先選用 ESI （ +）進(jìn)行測定。元素組成分析高分辨質(zhì)譜應(yīng)用 元素分析（有 lockspray 的情況下

22、） 1. 將液質(zhì)正常連好，在 option 中的 Lock Spray 勾上，在 MS Method中 Reference Scan 中將 voltage 調(diào)成 20v，frequency （sec ）調(diào)成 5 2. 將標(biāo)準(zhǔn)溶液接入 lock spray 接口處，進(jìn)行試驗。 校正液的信號要低于待測物質(zhì)的信號。3. 實驗完畢后， 打開 Chromatogram中 TIC 的 BPI; 將 MST une的 Process center TOFLock Mass， 將標(biāo)準(zhǔn)的分子量輸入其中。15內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考注意： 1. 這里的 Lock Mass 是鎖定的分子量，不 鎖定為 02.

23、先看 Lock Spray 中的哪一個峰離標(biāo)準(zhǔn)分 子量最近，再在 MS Tune中的 Calibration 中查 詢標(biāo)準(zhǔn)物的準(zhǔn)確分子量，將目標(biāo)分子量輸入到 Lock Mass 中。4. 再在 Tools Elemental composition 雙擊目 標(biāo)分子量 OK。即得到目標(biāo)分子的元素組成。5. 無 LockSpray 的情況下，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行分析， 操作見 1-4.圖譜的解析 拿到一張總離子流圖： 首先看右上角 TIC 下面的數(shù)值，如果達(dá)到 e4表明電 離程度較好。 但是并不用刻意追求這個數(shù)值， 只要 能檢出我們需要的峰， 這個數(shù)值就不是問題。 但是 如果沒有，則需要考慮電離條件的問

24、題。16內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考即可得到 BPI 圖譜點(diǎn)擊“ display ”到“ TIC”勾上 BPI chromatogram 單擊“ OK” 如下圖我們可以發(fā)現(xiàn) 信號高的地方得到了放大 信號低 的地方依舊沒有改變 如果想講圖譜變得更加“好看（信噪比變大）”， 需將 baseline% 改為 5%。點(diǎn)擊“ OK”17內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考我們可以發(fā)現(xiàn)基線變得更低了對比一下“BPI”的數(shù)據(jù)處理工具可以幫助我們找到更多的 信號峰，避免由于分離度不夠造成的峰識別困難。18內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考針對本總離子流圖的解讀對5.71 分鐘的峰進(jìn)行積分 得到其質(zhì)譜圖在 100400m/z

25、 范圍內(nèi) 有很多峰 不能確定是否由 于分離不好造成于是點(diǎn)擊 chromatogram 里面的 progress 下面的 combine spectrum 窗口將需要的峰右鍵選在 Average 條框內(nèi)，將不需要的 背景峰選在下面 subtract 條框內(nèi)。即可得到扣除 背景之后的峰。19內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考質(zhì)譜圖變得干凈很多 但是仍有少量小分子量 化合物 推測可能為樣品內(nèi)化合物或者樣品分子發(fā) 生源內(nèi)裂解的產(chǎn)物。繼續(xù)觀察出現(xiàn)的 453.2 、464.7 、904.8 、926.8 這幾個化合物之間是什么關(guān)系呢？ 這些化合物其實是同一化合物。 因為 453和904之間 其實是 M+1峰、

26、2M+1峰的關(guān)系、 2M+Na峰。 （由于玻璃儀器、自然界中都含有豐富的 NaK 元 素，所以常會形成加鈉或者加鉀峰，屬于正常現(xiàn) 象。） 多電荷的判斷20內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考放大 904的峰 可見其同位素峰分子量之間相差 1 即帶1個電荷。如果分子量之間差 0.5 ，則帶兩個電 荷，差 0.1 則帶10個電荷。此為經(jīng)驗公式。日常維護(hù)及使用1. 若質(zhì)譜中有 100 的分子量信號（若 100 為無關(guān)的 雜質(zhì)峰）很強(qiáng)降不下去， 可以在 Acquire 時將其中 的 masses 的值改成 105，避免分子量為 100 的峰。2. 若質(zhì)譜中有雜質(zhì)用液相沖不下來， 則可以將離子 源拆下來清洗：A將離子源拆下來用分別蘸過甲醇與水的棉簽反 復(fù)擦洗。B清洗錐孔， 針管：將錐孔拆下來分別用超純水， 甲醇，超純水各超聲 15min。C安裝離子源，安裝完畢觀察軟件中的電壓與溫 度是否能升上去，如果升不上去