丙型肝炎病毒核酸定量檢測標準作業(yè)指導(dǎo)書

1、丙型肝炎病毒核酸定量檢測標準作業(yè)指導(dǎo)書1. 目的采用PCR技術(shù)、實時熒光探針技術(shù)，用于臨床血清或血漿標本中的丙型肝炎病毒核酸的定性檢 測，適用于丙型肝炎病毒感染的輔助診斷。2. 范圍適用于丙型肝炎病毒核酸定量檢測。3. 職責(zé)操作人員： 負責(zé)標本制備檢測、儀器操作、報告發(fā)送。專業(yè)組組長 ：負責(zé)本組耗材的請購，監(jiān)督本組標本檢測、儀器操作、報告發(fā)送、質(zhì)控管理等各方 面工作。實驗室主任 ：負責(zé)監(jiān)督和指導(dǎo)實驗室各方面工作。4. 原理采用熒光PCR技術(shù)，以丙型肝炎病毒基因編碼區(qū)的高度保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計特異性引物及熒光探針，進行一步法 RT-PCRT增，并檢測熒光信號，儀器軟件系統(tǒng)自動繪制出實時擴增曲線，

2、根據(jù) 閾循環(huán)值（CT）實現(xiàn)對未知樣本的檢測。另外，本試劑盒帶有內(nèi)標物質(zhì)，用于對核酸提取的整個過程進 行監(jiān)控，減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。5. 樣本要求適用標本類型 ：血清標本采集用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2 ml，注入無菌的真空采血管中（未加抗凝劑），室溫（22-25 C）放置30-60min血標本可自發(fā)完全凝集析出血清，或直接使用水平離心機，1500rpm離心5min ；吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至滅菌離心管。標本保存和運送所采集的標本可立即用于測試或長期保存于 -70C ,也可保存于-20C待測，保存期為3個月，標 本應(yīng)避免反復(fù)凍融。標本運送采用干冰（或者冰袋）保持低溫，運輸時間不應(yīng)超過4 天。

3、拒收標本： 拒絕重度溶血樣本、肝素抗凝的血漿。6.儀器和試劑設(shè)備AB7500核酸擴增儀、恒溫金屬浴、生物安全柜、低溫離心機等。試劑生產(chǎn)廠家：中山大學(xué)達安基因股份有限公司產(chǎn)品標準批號： YZB屆 7271-2013最低檢出量：最低檢出量為500 IU/ml試劑各組分見表1:表1 試劑盒組分表組分名稱規(guī)格數(shù)量核酸提取試劑RNA提取液A200 ul/ 管1RNA提取液B5 ml/ 瓶2DEPC HO3 ml/ 瓶1PCR檢測試劑HCV內(nèi)標溶液100 ul/ 管1HCV反應(yīng)液A270 ul/ 管1HCV反應(yīng)液B30 ul/ 管1質(zhì)控品陰性質(zhì)控品200 ul/ 管1HCV強陽性質(zhì)控品200 ul/ 管1

4、HCV臨界陽性質(zhì)控品200 ul/ 管17.操作步驟試劑準備（試劑儲存和準備區(qū)）進入試劑準備區(qū)， 打開通風(fēng)設(shè)備，按照消毒清潔程序擦拭實驗臺面，并在檢驗流程記錄表上做相應(yīng)記錄。PCR反應(yīng)液配制取出HCV反應(yīng)液A、HCV反應(yīng)液AB,室溫溶化后振蕩混勻，8000rpm離心數(shù)秒后使用。取出N個（N =待測樣本數(shù)+ 4個HCV陽性定量標準品+HCV強陽性質(zhì)控品+HCV臨界陽性質(zhì)控品+陰性質(zhì)控品+空白孔）PCR反應(yīng)管，HCV單人份擴增體系配制見表 2:表2 PCR反應(yīng)液配置表組分HCV反應(yīng)液AHCV反應(yīng)液B總體積用量/人份27 ul3 ul30 ul將各組分充分混勻，混合好后進行短時離心將管壁上的液體全部

5、離心至管底，之后將30 ul擴增體系分裝到PCR反應(yīng)管，反應(yīng)液分裝時盡量避免產(chǎn)生氣泡，蓋緊管蓋，經(jīng)傳遞窗傳遞到標本制備區(qū)。75%乙醇配制：取 ml的DEPC H2O,加入的無水乙醇，振蕩混勻，配制成75%乙醇，蓋緊蓋子，經(jīng)傳遞窗傳遞到標本制備區(qū)。RNA提取（標本制備區(qū)）進入標本制備區(qū)，從傳遞窗中取出PCR反應(yīng)管和75%乙醇，放入標本制備區(qū)冰箱冷藏。從冰箱取出待測樣本、陰性質(zhì)控品、強陽性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、RNA提取液A、RNA提取液B和內(nèi)標液，放入生物安全柜內(nèi)室溫溶解，備用。打開金屬浴，調(diào)節(jié)溫度為 65 C，使儀器自動升溫。用鑷子夾取n個ml滅菌離心管放于安全柜內(nèi)離心管架上。（n=待測樣本

6、數(shù)+ 3 =待測樣本數(shù) +HCV強陽性質(zhì)控品+HCV臨界陽性質(zhì)控品+陰性質(zhì)控品）向離心管中各加入10 ul內(nèi)標溶液，再分別加入 200ul樣本，800 ul RNA提取液B,蓋緊管蓋，振蕩 混勻15s以充分混勻，室溫放置 5min （每隔1min旋渦振蕩5s,使裂解更充分，處理結(jié)束后瞬時離 心。）加入200 ul無水乙醇，蓋緊管蓋，漩渦振蕩混勻15s以充分混勻，瞬時離心，再加入 20 ul RNA提取液A,漩渦振蕩混勻 5s,室溫靜置1min。 8000 rpm離心1min，小心吸棄上清。再加入200 ul RNA提取液B,蓋緊管蓋，充分混勻（用移液槍吹打），室溫下8000 rpm離心1min

7、 ,小心吸棄上清。加預(yù)冷的75%乙醇400ul充分混勻，8000 rpm離心1min，小心吸棄上清。加預(yù)冷的75%乙醇400ul充分混勻，8000 rpm離心1min，小心吸棄上清。打開管蓋，放入金屬浴，65 C干燥5 min，使液體揮發(fā)完全。溫育5min后，用鑷子從金屬浴中取出離心管，加入50 ul DEPC HO,用移液槍吹打混勻，室溫靜置1min后，8000 rpm離心1min。離心管內(nèi)的上清液即為病毒核酸溶液，建議立即使用，如需保存，置于-70Co取出已分裝好的 PCR反應(yīng)管，向?qū)?yīng)編號的PCR管中加入處理好的的樣品（包括待測標本、陰性質(zhì)控品、強陽性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品）上清液各20

8、 ul，空白對照不加模板，蓋緊反應(yīng)管。8000rpm 離心數(shù)秒，經(jīng)傳遞窗移至擴增檢測區(qū)。（用移液槍小心吸取上清液，盡量不要碰到底層沉淀。）PCR擴增(擴增區(qū))從傳遞窗中取出 PCR反應(yīng)管，放入儀器樣品槽內(nèi)。在“ Set up”按對應(yīng)順序設(shè)置空白管、陰性質(zhì)控品、陽性室內(nèi)質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、陽性定量參考品及待測標本，并在“ samplename ”一欄中設(shè)置樣本名稱，探針檢測模式設(shè)置：Reporter Dye1 :FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2：VIC，Quencher Dye2：none；Passive Reference：NONE。 具體設(shè)置方法參

9、考 AB 7500核酸擴增儀標準作業(yè)指導(dǎo)書 。打開“ Run Method ”窗口設(shè)置循環(huán)條件：50 C 15 min , 1 個循環(huán)；95 C 5min , 1 個循環(huán)；94 C 15s t 55 C 45 s (收集熒光)，45個循環(huán)； 保存文件，運行儀器。8. 結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后，操作人員可根據(jù)實際情況自行調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值以及Threshold值。Start值可以在3-15, End值可設(shè)在5-20。在Log圖譜窗口設(shè)置的 Threshold的Value值，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期，調(diào)整陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線。點擊Analysis自動獲得分析結(jié)

10、果,在 Report 界面查看結(jié)果，記錄樣本數(shù)值(C)。VIC檢測通道有對數(shù)增長期，則FAM檢測通道CTW 45;或者擴增如果反應(yīng)體系擴增曲線在 FAM檢測通道無明顯對數(shù)增長期，且在判定樣品的HCV RNA陰性。如果反應(yīng)體系擴增曲線在FAM、VIC檢測通道均有對數(shù)增長期且曲線在FAM檢測通道有對數(shù)增長期且 CTW 45，在VIC檢測通道無對數(shù)增長期，則判定樣品的 HCVRNA陽性性。9. 質(zhì)量控制每次實驗均需檢測陰性質(zhì)控品、 HCV強陽性質(zhì)控品、HCV臨界陽性質(zhì)控品。質(zhì)控品結(jié)果滿足質(zhì) 量控制要求時方可進行檢測結(jié)果的判斷。試劑盒自帶質(zhì)控(1) 陰性質(zhì)控品：FAM檢測通道擴增曲線無明顯對數(shù)增長期，

11、VIC檢測通道擴增曲線有明顯對數(shù)增長期。FAM檢測(2) HCV陽性質(zhì)控品：FAM檢測通道擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，且強陽性質(zhì)控品 通道CTW30,臨界陽性質(zhì)控品 FAM檢測通道w 36。(3) 陽性定量參考品：增長曲線呈 S型曲線，且w rw 1。室內(nèi)質(zhì)控每次實驗應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)?HCV RNA質(zhì)控品做室內(nèi)質(zhì)控。以上要求(和)需在同一次實驗中同時滿足,否則,本次試驗無效,需從新進行。10. 干擾因素環(huán)境中存在RNase,可降解RNA,導(dǎo)致實驗結(jié)果假陰性， 因此實驗過程應(yīng)戴手套， 帽子，防止皮屑、 毛發(fā)等的RNase,實驗用品需高壓滅菌后使用，盡量避免污染。臨床標本中內(nèi)源性抑制物：血紅蛋白、免疫球

12、蛋白、白細胞內(nèi)乳鐵蛋白、脂類、等都可抑制PCR反應(yīng),標本應(yīng)避免溶血、脂血、黃疸等。外源性抑制物：肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、手套上的滑石粉、標本容器上的抑制物等,標 本應(yīng)按采集要求采集,操作中應(yīng)小心謹慎,標本容器及實驗用具應(yīng)鑒定合格。標本的交叉污染：操作過程中應(yīng)細心認真,防止交叉污染,盡量使用帶鑒定合格的濾芯吸頭,陰性 對照品應(yīng)與標本一起提取,以及時發(fā)現(xiàn)交叉污染。11. 生物參考區(qū)間： x l0lU/ml x 1(U/ml12. 警示/危急值：HCV RNA檢測無警示/危急值。13. 異常結(jié)果處理如遇HCV RNA檢測結(jié)果與臨床診斷或資料，或與近期歷史檢測結(jié)果不相符合，應(yīng)及時與臨床醫(yī) 生聯(lián)

13、系、溝通,查找原因并采取措施,于疑問報告發(fā)放處理記錄表中記錄處理過程。如需復(fù)查, 需及時保存標本。14. 臨床意義HCV感染診斷的指標，指導(dǎo)臨床治療。15. 變異的潛在來源標本保存不當(dāng)或反復(fù)凍融,都會影響檢測結(jié)果的準確。16. 注意事項實驗過程中必須穿專用工作服、戴手套、口罩、帽子、必要時戴防護眼罩,接觸標本后必須及時更換手套。陽性質(zhì)控品和檢測樣本均應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，應(yīng)避免接觸到皮膚和粘膜。實驗過程必須嚴格分區(qū)操作，各區(qū)物品均為專用，不得交叉使用。樣品的處理操作應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進行。所用檢測試劑使用前應(yīng)完全解凍，瞬時離心后使用，應(yīng)避免反復(fù)凍融。樣本核酸提取后，建議馬上進行下一步實驗，否則請保存于-20 C待用（24 h ）。操作過程中應(yīng)防止交叉污染，盡量使用鑒定合格的濾芯吸頭，陰性對照品應(yīng)與標本一起提取。加樣時應(yīng)使樣品完全落入反應(yīng)液中， 不應(yīng)有樣品粘附于管壁上， 盡快蓋緊管蓋。 上機前注意檢查各 反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。標本制備區(qū)所用到的試管、吸頭等需打入盛有消毒劑的容器，并與廢物一起滅菌后方可丟棄。擴增完畢立即取出反應(yīng)管，密封在專用塑料袋內(nèi)，丟棄于指