人表達于SiSo細胞系的受體結合型腫瘤抗原(RCAS1)重點

1、人表達于 SiSo 細胞系的受體結合型腫瘤抗原（ RCAS1）試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用產品編號： CSB-E12153h檢測范圍： 0.6 ng/ml, - 40ng/ml,最低檢測限： 0.15 ng/ml,特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人 RCAS1，且與其他相關蛋白 無交叉反應。有效期： 6 個月預期應用： ELISA 法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關生 物液體中RCAS1.含量。說明試劑盒保存：-20C（較長時間不用時）；2-8C（頻繁使用時）。 濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為

2、準。 剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質， 此為正?，F象， 不會對實 驗結果造成任何影響。實驗原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗RCAS1.抗體的微孔 中依次加入標本或標準品、生物素化的抗 RCAS1.抗體、HRP標記的親和素， 經過徹底洗滌后用底物 TMB 顯色。 TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色， 并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的RCAS1.呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。試劑盒組成及試劑配制1. 酶聯板 (Assay plate )：一塊( 96 孔)。2. 標準品 (Standard)：2 瓶(凍干

3、品 )。3. 樣品稀釋液(Sample Diluent):1 X20ml/瓶。4. 生物素標記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent):1x10ml/瓶。5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液(HRP-avidin Diluent):1 xiOml/瓶。6. 生物素標記抗體(Biotin-antibody):1 x 120 併瓶 (1 : 100)。7. 辣根過氧化物酶標記親和素(HRP-avidin):1x 120併瓶 (1:100)。8. 底物溶液(TMB Substrate) :1 X10ml/瓶。9. 濃洗滌液(Wash Buffer): 1 X20ml/瓶，使用時每

4、瓶用蒸餾水稀釋25倍。10. 終止液(Stop Solution :1 X0ml/瓶(2N H2SO4)。需要而未提供的試劑和器材1. 標準規(guī)格酶標儀2. 高速離心機3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱4. 干凈的試管和 Eppendof 管5. 系列可調節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器6. 蒸餾水，容量瓶等標本的采集及保存1. 血清：全血標本請于室溫放置 2小時或4C過夜后于1000 x g離心20分 鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20 C或-80C保存，但應避免反復凍 融。2. 血漿 可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后 30 分鐘內于 2 - 8C 1000 x g離心

5、15分鐘，或將標本放于-20 r或-80 r保存，但應避免反復凍 融。3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢 測，或將標本放于-20r或-80r保存，但應避免反復凍融。注 標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。標本的稀釋原則： 首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。 只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應 做好詳細的記錄。最后計算濃度時，稀釋了 “N倍，標本的濃度應再乘以“N。 標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后 靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓

6、動以助溶解，其濃度為40 ng/ml,，做系 列倍比稀釋后，分別稀釋 40ng/ml, 20ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml, 2.5 ng/ml, 1.2 ng/ml, 0.6 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度 0 ng/ml,，臨用前15分鐘內配 制。如配制20ng/ml,標準品：取0.5ml （不要少于0.5ml） 40 ng/ml,的上述標準品加 入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendof管中，混勻即可，其余濃度以此類推。 生物素標記抗體的稀釋原則： 臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所 需的總量配制（每孔100卩），實際配制時應多配

7、制0.1-0.2ml。女口 10卩生物素 標記抗體加990卩,生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前 一小時內配制。辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則： 臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的 每次實驗所需的總量配制（每孔 100卩），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。女口 10卩辣根過氧化物酶標記親和素加 990卩辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。操作步驟實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻 時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品 稀釋液進行稀釋，以

8、使樣品符合試劑盒的檢測范圍。1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00卩, 余孔分別加標準品或待測樣品100叮 注意不要有氣泡，加樣將樣品加于 酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜， 37C反應120分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100取1卩1 生物素標記抗體加99 1生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻， 在使用前一小時內配制），37C,60分鐘。3. 溫育 60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡 1-2分鐘， 200卩每孔，甩干。4

9、. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液）100 卩，37C，60 分鐘。5. 溫育 60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板 5次，每次浸泡 1-2分鐘， 200卩每孔，甩干。6. 依序每孔加底物溶液90卩，37 C避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標 準品的前 3-4孔有明顯的梯度藍色，后 3-4 孔梯度不明顯，即可終止） 。7. 依序每孔加終止溶液50卩，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加 入順序應盡量與底物液的加入順序相同。 為了保證實驗結果的準確性， 底 物反應時間到后應盡快加入終止液。8. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液

10、后 15分鐘以內進行檢測。實驗備注用戶在初次使用試劑盒時， 應將各種試劑管離心數分鐘， 以便試劑集中到 管底。每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶 液及2NH2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。為防止樣品蒸發(fā)， 試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內， 酶標板加上 蓋或覆膜。未使用完的酶標板或者試劑，請于 2-8 C保存。標準品、生物素標記抗體 工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用。 請 勿重復使用已稀釋過的標準品、 生物素標記抗體工作液、 或辣根過氧化物 酶標記親和素工作液。建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。洗板方法 手工

11、洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上 鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少 0.3ml 注入孔內，浸泡 1-2 分鐘。根據需要，重復此過程數次。 自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。 計算 以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標） ，OD 值為縱坐標（普通坐標） ，在半對 數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度； 再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標準曲線的直線回歸方 程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即 為樣品的實際濃度。注意事項底物請避光保存。 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。