土壤中細菌總數(shù)的測定實驗

1、實驗四細菌總數(shù)的測定純種分離一、目的1. 掌握從環(huán)境（土壤和活性污泥等）微生物群體中獲得純種微生物的分離和 培養(yǎng)技術(shù)。2. 掌握無菌操作技術(shù)。二、材料和器皿1. 扭力天平、取土樣工具、涂布棒 （接種棒 ）。2. 無菌三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、移液管、玻璃珠。3. 無菌水。4. 培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。三、實驗操作步驟1、取土樣選定取樣點，按對角交叉（五點法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取 210cm處的土壤。盛土的容器應(yīng)是無菌的。將5點樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等。土樣取回后應(yīng)盡快投入實驗，同時取 10-15g,稱重后經(jīng)105oC烘干8h,置于干燥器中

2、冷卻后再次稱重，計算含水量。2、倒平板熔化已滅菌的上述4種培養(yǎng)基并冷卻至45oC左右倒平板，凝固待用，每種培養(yǎng)基每個稀釋度各三只平板。3、編號取5支無菌空試管（15X 150mm依次編號為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。4、分裝無菌水按無菌操作用5mL移液管分別吸取4.5mL無菌水于編號的 各無菌空試管中。5. 制備土壤稀釋液稱土樣 1g 于盛有 99mL 無菌水或無菌生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩1020min，使土樣中的菌體、芽孢 或孢子均勻分散，此即為 10-2濃度的菌懸液。用無菌移液 管吸取懸液0.5mL于4.5mL無菌水試管中，用移液管吹吸三 次、搖勻，此即為

3、 10-3濃度。同樣方法，依次稀釋到 10-7。 稀釋過程需在無菌室或無菌操作條件下進行。環(huán)境要求：瓊脂平板在工作臺暴露 15 分鐘，每個平板不得超過 15 個菌落。代表性：取固體樣品時需多采幾個部位，且經(jīng)過均質(zhì)或研磨；液體樣品須經(jīng)過振搖，以獲得均勻稀釋液。減少誤差：每遞增稀釋一次即換用 1 支 1ml 滅菌吸管，將吸管內(nèi)液體沿管壁流入，勿 使吸管尖端伸入稀釋液內(nèi)，并且稀釋液應(yīng)充分振搖。6、培養(yǎng)及計數(shù)培養(yǎng)條件：倒置于361 xx箱內(nèi)培養(yǎng)48士 2h計數(shù)時間：到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應(yīng)立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應(yīng)將平板放置于0 4C,但不得超過24h。計平皿中菌落數(shù)：肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。記

4、下各平板的菌落總數(shù)，求出同稀 釋度的各平板平均菌落數(shù)。規(guī)律：不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個平板的菌落 數(shù)應(yīng)基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗中的差錯（有的食品有時可能出現(xiàn)逆反現(xiàn) 象，如酸性飲料等），不應(yīng)作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。當平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限， 則應(yīng)作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個菌落 計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數(shù)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平 板的菌落數(shù)乘 2 代

5、表全平板的菌落數(shù)。當計數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度均大于 300 時），但分布很均 勻，可取平板的一半或計數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。計數(shù)原則：選平均菌落數(shù)在 30300 之間者進行計算1. 僅 1 個稀釋度的平均菌落數(shù)在此范圍時，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù) 報告之。2. 若有 2 個稀釋度的平均菌落數(shù)在 30300之間時，則按兩者的菌落總數(shù)之 比來決定，若比值小于 2應(yīng)報告兩者的平均數(shù)；若大于 2 則報告其中較小的菌落 總數(shù)。3. 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于稀釋倍數(shù)報告之。4. 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于 乘以稀釋倍數(shù)報告之。5. 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在

6、 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。300，以稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)30300之間，則以最接近 300或 306. 若所有的菌落數(shù)勻為 “無法計數(shù) ”時，應(yīng)注明水樣的最大稀釋倍數(shù)。7. 在求同稀釋度的平均數(shù)時，若其中 1 個平板上有較大片狀菌落生長時，則 不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀 菌落約為平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均勻，則可按半平板上的菌 落計數(shù)，然后乘以 2 作為整個平板的菌落數(shù)。報告原則例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個稀釋度菌菌落數(shù)報告方式10-110-210-3 落數(shù)之比（個/mL）（個/mL）20

7、00 或 1.6 X 104461.000 或 3.8 X 104602.000或 2.7 X1044 無法計數(shù) 00或 5.1 X 1055271 15270或 2.7 X 1026 無法計數(shù) 305 1200或 3.1 X 1047 無法計數(shù) 10-3無法計數(shù)7、菌落總數(shù)報告方式菌落數(shù)的報告，按國家標準方法規(guī)定菌落數(shù)在 1100 時，按實有數(shù)字報 告，如大于 100 時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計算。為 了縮短數(shù)字后面的零位，可用 10的指數(shù)來表示。固體檢樣以克（g）為單位報告，液體檢樣以毫升（mL）為單位報告，表面 涂擦則以平方厘米（cm2）報告。8. 計數(shù)選菌落分散、菌落數(shù)適量且各平行皿菌落數(shù)接近的稀釋度的平皿計數(shù)，通常細菌和放線菌選取菌落數(shù)在30300之間的平皿，霉菌選菌落數(shù)在10100