土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)導(dǎo)學(xué)案

1、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與激素NH3才能被植物吸收利用CO(NH2)2 + H 2。細(xì)菌脲酶 C0 2 +2NH1、尿素C0(NH2)2重要的農(nóng)業(yè)氮肥。只能被土壤中細(xì)菌分解為、研究思路(一) 篩選菌株1、實(shí)例-耐高溫DNA聚合酶的尋找美國科學(xué)家布魯克(1966年)-在美國黃石公園的一個(gè)熱泉中發(fā)現(xiàn)耐熱細(xì)菌。這說明尋找菌株要到期相應(yīng)中尋找2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長。要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等，采用 選擇培養(yǎng)分離 的方法,或抑制使大多數(shù)微生物不能生長，或造成有利于該菌

2、生長的環(huán)境，經(jīng)過一定時(shí)間培養(yǎng)后使該菌在群落中的數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對(duì)它進(jìn)行純培養(yǎng)分離。KHPO1.4gNaHPO 42.1gMgSO 4 H2O 0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g瓊脂15.0g3、篩選菌株的培養(yǎng)基思考：1、 該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分 別是什么物質(zhì)？碳源：葡萄糖、尿素氮源：2、此配方能否篩選岀產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌？為什么？能。只有產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌才能利用作為氮源而生存。將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到1000mL。思考：1、 1個(gè)菌落 1個(gè)活菌。2、 統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)實(shí)際活的細(xì)菌數(shù)。3、用稀釋涂布平板法一定要重復(fù)實(shí)驗(yàn)，一般 至少要涂布3個(gè)平板。4、重復(fù)

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果中小于 30菌落的不用。因此統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用 表示。4、選擇培養(yǎng)基：允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。(二) 、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：1、活體計(jì)數(shù)法-稀釋涂布平板法(1) 操作方法：稀釋涂布平板-統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。(2) 原理：1個(gè)菌落1個(gè)活菌。(3) 統(tǒng)計(jì)原則 、選一.30.二300 -個(gè)菌落的平板統(tǒng)計(jì) 、每個(gè)稀釋度取.3 .個(gè)平.板取其平均值。.(4) 統(tǒng)計(jì)結(jié)果：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目每克樣品中的菌株數(shù) =C:某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V:所用稀釋液的體積；M:稀釋倍數(shù)2、顯微鏡直接計(jì)數(shù)(三) 設(shè)置對(duì)照1、設(shè)置對(duì)照的目的：排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素

4、對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。2、對(duì)照實(shí)驗(yàn)是指除了被測試 的條件外，其他條件都相同 的實(shí)驗(yàn)。滿足該條件的稱為對(duì)照組，未滿足該條件的稱為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組： 配制土壤溶液 |系列稀釋|涂布平板與培養(yǎng)|菌落計(jì)數(shù)對(duì)照組：設(shè)置對(duì)照 -同等條件下，培養(yǎng)空白培養(yǎng)基。1四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（一）土壤取樣1 、土壤是天然培養(yǎng)基其微生物數(shù)量、種類2、土壤取樣:（1）取樣的位置：土壤中70-90%是細(xì)菌。在富含有機(jī)質(zhì)的土壤層的3 -8cm處中分布著絕大多數(shù)的細(xì)菌。（2）取樣要求：鏟去表層土。測細(xì)菌數(shù):(1 )、一般用104、（二）樣品稀釋(2 )、測放線菌:一般用103、(3 )、測真菌數(shù):一般用102、105、1

5、06稀釋液。104、105稀釋液。103、104稀釋液。.，原則：確保平板上的菌落數(shù)在之間。（三）微生物的培養(yǎng)與觀察接種:培養(yǎng):用適當(dāng)?shù)南♂屢鹤魍坎计桨寮?xì) 菌：30-37C, 1 -2d;放線菌：25吃8C , 5 -7d;菌:25 吃8C , 3 -4do觀察:a.每24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目原因：不同種類的微生物，往往需不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間，每隔24h統(tǒng)計(jì)1次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。b.以“穩(wěn)定菌落”為觀察對(duì)象。原因：不同種類的細(xì)菌形成的菌落，在大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作為菌種鑒

6、定的重要依據(jù)。（四）鑒定酚紅鑒別培養(yǎng)基：鑒定分解尿素的細(xì)菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨T培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)T 酚紅變紅T 結(jié)論：該細(xì)菌能分解尿素。、:I . 7.注意:1、 在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時(shí)間），同種微生物表現(xiàn)岀相同而穩(wěn)定的菌落特征。2、關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。五、實(shí)驗(yàn)的具體操作（一）、無菌操作1、土壤取樣從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌2、制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。3、樣品的稀釋：注意 、為了保

7、證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30 300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。 、為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三 個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算岀菌落平 均數(shù)。 、統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。這是 因?yàn)閮蓚€(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只 是一個(gè)菌落。因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活 菌數(shù)來表示。 、涂布平板法所選擇倒平板的稀釋度很重要， 一般以三個(gè)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板所出現(xiàn) 的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好。（1） 、應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。將稱好的土樣倒入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，塞好棉塞。（2）、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行。（3） ）分離不同的微

8、生物采用不同的稀釋度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計(jì)數(shù)的平板。（4） 、如果得到了 2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在 30 300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落 的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。（二）、做好標(biāo)記1、實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。2、裝系列稀釋菌的試管在試管架上最好由低到高放置。（三）、制定計(jì)劃六、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1. 通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏 高，難以選擇出分解尿素

9、的微生物。2. 提示：選擇每個(gè)平板上長有30 300個(gè)菌落的稀釋倍計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個(gè) 重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。注意：測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到伊紅美藍(lán)鑒別性 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得岀水樣中大腸桿菌的數(shù)量。例1:土壤中的細(xì)菌能分解尿素，是因?yàn)樗鼈兡芎铣梢环N（）A. 尿素酶B.脲酶C.蛋白酶 D 肽酶這種加入尿素的培養(yǎng)基在功能上屬于例2 :在培養(yǎng)基中加入尿素（惟一氮源），以分離岀能分解尿素的細(xì)菌,A. 選擇培養(yǎng)基 B 固體培養(yǎng)基C 液體培養(yǎng)基 D半固體培養(yǎng)基例3 :實(shí)驗(yàn)測

10、定鏈霉素對(duì) 3種細(xì)菌的抗生素效應(yīng)，用3種細(xì)菌在事先準(zhǔn)備好的瓊脂平板上畫3條等長的平行線（3條線均與圖中的鏈霉素帶接觸），將平板置于37 C條件下恒溫培養(yǎng) 3天，結(jié)果如圖所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，以下敘述不.正確的是（）A.鏈霉素能阻止結(jié)核菌的生長B. 鏈霉素對(duì)結(jié)核菌比對(duì)霍亂菌更有效C. 鏈霉素對(duì)結(jié)核菌比對(duì)傷寒菌更有效D. 鏈霉素可以用于治療傷寒病人例4 :測定土壤中細(xì)菌數(shù)量一般選用104、105和106倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，而測定真菌的數(shù)量一般選用102、103和104倍稀釋，其原因是（）A.細(xì)菌個(gè)體小，真菌個(gè)體大B.細(xì)菌易稀釋，真菌不易稀釋C.細(xì)菌在土壤中數(shù)量比真菌多D.隨機(jī)的，沒有原因5.未

11、接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基D.接種了的選擇培養(yǎng)基）細(xì)菌體積D細(xì)菌結(jié)構(gòu)（ ）尿素、瓊脂、水例5 :用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要設(shè)置的對(duì)照是（）A.未接種的選擇培養(yǎng)基BC.接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基例6 :通常用來作為菌種鑒定的重要依據(jù)是（A.菌落B.細(xì)菌形態(tài)C例7 :下列能選擇出分解尿素的細(xì)菌的培養(yǎng)基是A. KHPQ、NqHPQ MgSQ 7甩0、葡萄糖、B. KH2PQ、NmHPQ MgSQ 7H2O、葡萄糖、瓊脂、水C. KHPO、NqHPQ MgSO 7WO、尿素、瓊脂、水D. KHPO、NmHPQ MgSO70、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、水例 8 ：在涂布平板操作時(shí)錯(cuò)誤的是 ( )

12、A.將涂布器在酒精燈火焰上灼燒，直到燒紅B.取少量菌液滴加在培養(yǎng)基表面C. 將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃待酒精燃盡后，冷卻8 s10 s再用D. 涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻例 9：在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)能分解尿素的細(xì)菌后，指示劑的顏色是()A.藍(lán)色B.紅色C.黑色 D 棕色例 10：在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時(shí)又能抑制或者阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基稱A.鑒別培養(yǎng)基.加富培養(yǎng)基C.選擇培養(yǎng)基D.基礎(chǔ)培養(yǎng)基例 11 ：分離土壤中分解尿素的細(xì)菌，對(duì)培養(yǎng)基的要求是加尿素 不加尿素 加瓊脂 不加瓊脂加葡萄糖不加葡萄糖 加硝酸鹽 不加硝酸A.C.D.例 12：在尋找目的菌株時(shí)，要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找，下列不屬于厭氧細(xì)菌生存環(huán)境的是 ()A. 土壤深層B 人或動(dòng)物體內(nèi)寄生C.真空D.池塘淤泥例 13：下列是關(guān)于檢測土壤中細(xì)菌總數(shù)實(shí)驗(yàn)操作的敘述，其中錯(cuò)誤的是()A 用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板B 取 104、 105、 106倍的土壤稀釋液和無菌水各0.1 mL ，分別涂布于各組平板上C .將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平板倒置，37 C恒溫培養(yǎng)2448小時(shí)D 確定對(duì)照組無菌后，選擇菌落數(shù)在 300 以上的實(shí)驗(yàn)組平板進(jìn)行計(jì)數(shù)例 14：可以鑒定出分解尿素的細(xì)菌的方法是 ()A 以尿素為惟