組織酪氨酸酶(tyrosinase)活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品

1、組織酪氨酸酶(tyrosinase)活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(中文版) 主要用途 組織酩堿酸m (tyrosinase)活性比色法定雖檢測(cè)試劑是一種旨在通過酪氨酸酶反應(yīng)系統(tǒng)中底物酪窓酸氧化 后，產(chǎn)生女巴色素.呈現(xiàn)吸光峰值的變化.即采用比色法來(lái)測(cè)定組織裂解懸液樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典 的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種人體和動(dòng)物組織，尤其是皮膚、眼睛 和黑色素瘤組織裂解懸液樣品中酪抵酸酶的活性檢測(cè).以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用.操作 簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。 技術(shù)背景 酪氨酸韻(tyrosinase： EC1.14.18.1)是一種單酚單加氧酶(monoph

2、enol monooxygenase) 又稱為玳酚酶 (monophenolase)或做酚 二疑基苯丙氨酸：0?氧化還原酶(monophenol dihydroxyphenylalanin： 02 oxidoreduclase).具有雙功能的含銅糖蛋白,廣泛存在于植物、酵母和動(dòng)物組織中其蛋白結(jié)構(gòu)、大小. 糖基化方式、激活特征等都不同。人體酪氨酸酶是一個(gè)跨膜蛋白，而催化結(jié)構(gòu)域在黑色素細(xì)胞(melanocyte) 或色素細(xì)胞的黑色素器(melanosome)里。酪氨酸胡通過催化L酪氨酸(Lyrosine)等的o規(guī)基化 (o-hydroxylation)反應(yīng)變成L多巴(L-dopamine) 進(jìn)而氧

3、化產(chǎn)生黑色素底物多巴醍(dopaquinone) 從而由多巴色素(dopachrome)轉(zhuǎn)化為黑色素(melanin)中的真黑素(eumelanin).以及其它色素，包括 毛發(fā)和眼睛色素。紫外線可以激活酪抵酸的活性，嚴(yán)重時(shí).會(huì)引起色素沉著(hyperpigmentation)。酪氮酸 酶基因突變將導(dǎo)致I型眼皮膚白化病(oculocuumeousalbinism)。酪氨酸酹抑制劑成為增白化妝品的重要 元素?；诘孜锢业炙?在酪氨酸酶的催化下，產(chǎn)生多巴色素，通過其吸光值的變化(475nm波長(zhǎng))，來(lái)定 雖測(cè)定酪抵酸張的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為： 產(chǎn)品內(nèi)容 清理液(ReagentA) 裂解液(Reagent

4、 B) 毫升 亳升 緩沖液(Reagent C) 毫升 底物液(ReagenlD) 毫升 陰性液(Reagent E) 微升 產(chǎn)品說(shuō)明書 1份 保存方式 保存裂解液(ReagcmB)和底物液(Re遵emD)在一20C冰箱里，其余的保存在4冰箱里：底物液 (Reagent D)避免光照，有效保證6丿J 用戶自備 15毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器 15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容湍 微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備 比色1111或96孔板：用于比色的容器 分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)開始前，將一20C冰箱里的試劑盒中的試劑迓入冰椚里融化。底物液（Reagent D）避免

5、光照。然后 進(jìn)行下列操作。 一、樣品準(zhǔn)備 1于術(shù)収出動(dòng)物組織.并秤重以確定500亳克組織重雖 2. （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管 3（選擇步驟）加入xx毫升 清理液（Reagent A）淸洗1次 4. 移入到一個(gè)液氮凍存管 5. 即刻放進(jìn)液氮罐過夜 6. 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒眼碎組織成粉末狀（注總:：切莫使組織凍砂 7. 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管 8. 加入預(yù)冷的xx微升 裂解液（Reagent B） 9. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5亳升離心管 10. 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻 11宜于冰槽里孵育30分鐘期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫肘停止,放

6、進(jìn)TOC冰箱 里儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?12.放進(jìn)4微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘.速度為16000g （或13000RPM.例$11 eppendorf 5415） 13小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5亳升離心管 14.移取10微升進(jìn)行蛋白定雖:檢測(cè)（注惡：建議使用BwEord蛋白質(zhì)濃度定雖試劑盒一 HL300302 15即刻放進(jìn)一709保存或宜于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作 二、測(cè)定準(zhǔn)備 1. 準(zhǔn)備好上述待測(cè)樣品，宜于冰槽里 2. 設(shè)定好分光光度儀（溫度為25C）：波長(zhǎng)475nm 3 緩沖液（Ra棗ntC）室溫下均衡溫度 三、背最對(duì)照測(cè)定 1. 移取xx微升緩沖液（Regent C）到新的比色1111 2.

7、 加入xx微升 底物液（Reagent D） 3針頭法充入氣氣2分鐘 4. 加入xx微升 陰性液（Reagent E） 5. 上下傾倒數(shù)次，混勻 6. 室溫下（25C）孵育60分鐘 7. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景讀數(shù) 四、樣品測(cè)定 1. 移取XX微升 緩沖液（Regent C）到新的比色1111 2. 加入xx微升底物液（R俎gent D） 3. 針頭法充入氣氣2分鐘 4. 加入50微升待測(cè)樣品（注總：50微克蛋白總雖） 5. 上下傾倒數(shù)次.混勻 6. 室溫下（25C）孵育60分鐘 7. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè).此為樣品讀數(shù) 五、計(jì)算樣品活性 六、酶標(biāo)儀測(cè)定 1. 在96孔板上做好相應(yīng)

8、標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品 2. 分別移取xx微升 緩沖液（R俎geiUC）到所有孔里 3分別加入xx微升底物液（Reagent D） 4. 針頭法充入氣氣2分鐘 5. 分別加入xx微升陰性液（聘entE）或待測(cè)樣品（50微克貴白總址） 6. 輕輕搖動(dòng)96孔板 7. 室溫下（25C）孵育60分鐘 8. 即刻放進(jìn)的標(biāo)儀檢測(cè)，獲得背景和樣品讀數(shù) 9. 活性計(jì)算 注意事項(xiàng) 1. 木產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對(duì)照 2. 操作時(shí).須戴手套 3系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次 4. 測(cè)定值由低到商變化：測(cè)定持續(xù)60分鐘 5. 比色測(cè)定后，比色皿須淸洗徹底 6. 樣木讀數(shù)商于背景讀數(shù)表明具有酶活性 7. 建議待測(cè)樣木蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過碼 則可以增加或降低樣木址（木 公司提供Bradford蛋白質(zhì)濃度定址試劑盒HL3OO3O） 8. 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低.可以調(diào)整樣品濃度 9. 可以使用酪氨酸酶抑制劑曲酸（Kojica