熏肉中亞硝酸鹽的測(cè)定設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、一、實(shí)驗(yàn)題目：熏肉制品中亞硝酸鹽含量的測(cè)定1. 摘要：以a-蔡胺為顯色劑，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，測(cè)定了廣州市售的熏肉中 亞硝酸鹽的含量。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究了實(shí)驗(yàn)的最佳條件：最大吸收波長(zhǎng)、參比溶 液、酸度、顯色劑的用量和顯色時(shí)間。結(jié)果表明:pH值在34之間，參比溶液為去 離子水時(shí)，顯色劑用量為2mL/50mL試液，顯色時(shí)間在15min時(shí)，顯色穩(wěn)定，樣品 吸光度達(dá)到最大值，實(shí)驗(yàn)?zāi)苓_(dá)到較理想的效果。2. 關(guān)鍵詞：熏肉；亞硝酸鹽；紫外-可見(jiàn)分光光度法三、引言亞硝酸鹽作為一種食品添加劑被廣泛用于肉制品加工中。它的發(fā)色、防腐、 抗微生物作用至今仍無(wú)法用其它的物質(zhì)所替代。但它對(duì)于人體健康的危害是眾所 周知的

2、。為了有效的控制其毒性，檢測(cè)其在食品中的殘留量，訂前常采用的測(cè)定 方法主要有光度法、色譜法、電化學(xué)法。其中光度法乂分為鹽酸蔡乙二胺法、格 里試劑比色法、催化光度法、紫外光度法；色譜法中有離子色譜法、高效液相色 譜法、氣相色譜法；電化學(xué)法乂分為示波極譜法、伏安法。還有一些新的方法如 化學(xué)發(fā)光法、熒光法、原子吸收光譜法等。而分光光度法以其設(shè)備簡(jiǎn)單、操作 快捷、靈敏度高、結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn)，深受歡迎1。本實(shí)驗(yàn)研究了以a -荼胺為 顯色劑，利用紫外可見(jiàn)分光光度訃測(cè)定肉制品中的亞硝酸鹽的含量的方法。結(jié)果 證明，此方法簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確，是一種食品檢測(cè)的好方法。1、光度法1. 1鹽酸蔡乙二胺法在弱酸性溶液中，N

3、O與對(duì)氨基苯磺酸反應(yīng)生成重氮化合物后，再與鹽酸蔡 乙二胺偶聯(lián)生成紫紅色的偶氮染料，用分光光度法在540 nm處測(cè)定，與標(biāo)準(zhǔn)曲線 比較定量。1. 2格里試劑比色法GB5009. 033-2003測(cè)定方法中，其中一種方法就是格里試劑比色法，其原 理是在弱堿性條件下，用熱水從樣品中提取NOJ,然后用亞鐵氛化鉀和乙酸鋅沉 淀蛋白，過(guò)濾后，在弱酸條件下，N0與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮化后，再和N1蔡基乙二胺耦合形成紅色偶氮染料，最大吸收波長(zhǎng)為538 nm,所選擇的顯色劑 不一樣，最大吸收波長(zhǎng)也有所不同。針對(duì)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定和工藝的不同，以及檢 測(cè)過(guò)程中pH、溫度、放置時(shí)間對(duì)顯色的影響，在檢測(cè)肉制品中NO時(shí)，格

4、里試劑 比色法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性均高于鹽酸荼乙二胺法。另外用對(duì)氨基苯磺酰胺代替對(duì) 氨基苯磺酸，其靈墩度、精密度均得到提高。1. 3催化分光光度法主要原理是在一定的溫度和酸性條件下，NO對(duì)KBOs氧化染料（或指示劑）而 褪色的反應(yīng)具有較明顯的催化作用，且在一定NOJ的濃度范圍內(nèi)，吸光度變化與 NO濃度成較好的線性關(guān)系，因此，可用該原理定量溶液中NO的濃度。1. 4紫外分光光度法在稀鹽酸介質(zhì)中，NOJ與堿性品紅發(fā)生重氮反應(yīng)，用8羥基唾咻作偶聯(lián)劑， 在弱堿性條件下，生成茶紅色偶氮染料來(lái)定量測(cè)定NOJ含量。光度法是測(cè)定NOJ的經(jīng)典方法，其檢測(cè)所需費(fèi)用較低，靈墩度較高，不經(jīng)分 離可直接同時(shí)測(cè)定樣品中NO和

5、NOJ,具有較好的選擇性，操作簡(jiǎn)便。2、色譜法2. 1離子色譜法主要原理是當(dāng)淋洗液攜帶樣品進(jìn)入分離柱后，樣品離子便與離子交換功能基 的平衡離子爭(zhēng)奪樹(shù)脂的離子交換位置。經(jīng)過(guò)多次競(jìng)爭(zhēng)達(dá)到交換平衡。山于不同離 子對(duì)樹(shù)脂固定相的親和力不同，通過(guò)淋洗液的不斷淋洗，各種離子便先后從色譜 柱上被洗脫下來(lái)，實(shí)現(xiàn)了分離。通過(guò)檢測(cè)器，即可經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)各種離子，得到一個(gè)個(gè)色譜峰，然后與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，根據(jù)保留時(shí)間定性，根據(jù)峰面積或峰 高定量。用紫外檢測(cè)離子色譜法對(duì)醬腌菜中的與進(jìn)行定量分析。樣品經(jīng)過(guò) 超聲提取后，以 1.8mmol/L NaCO3 及 1. 7mmol/L NaHC03為淋洗液，經(jīng)DIONEX Ionp

6、ac AS4A-SC分析柱分離，于210 nm處紫外檢測(cè)。該法可以采用其他類(lèi)型的色譜柱進(jìn) 行分離，所用的檢測(cè)器也可選用化學(xué)抑制型電導(dǎo)檢測(cè)器（可大幅度降低淋洗液的 電導(dǎo)值）。離子色譜法所用的化學(xué)試劑較少，并且實(shí)驗(yàn)耗時(shí)相對(duì)來(lái)說(shuō)較少。2. 2髙效液相色譜法食品中NOJ含量的重氮化耦合高效液相色譜法測(cè)定方法是將食品樣品中蛋口 質(zhì)、脂肪除去后，NOJ與對(duì)氨基苯磺酸重氮化，再與N1蔡乙二胺耦合之后， 進(jìn)行HPLC分析。若采用反相高效液相色譜法一二極管陣列檢測(cè)器法測(cè)定鹵肉制品 中NO及NOJ的含量，則該方法選擇四丁基澳化鍍作為離子對(duì)試劑，與NO和NOJ 陰離子形成中性締合物，在屮醇一混合磷酸鹽流動(dòng)相中，被非

7、極性鍵合相柱(ODS) 分離并定量檢測(cè)。該方法靈敏度高，并且樣品中其他成分如色素、動(dòng)物性蛋口等 對(duì)檢測(cè)不構(gòu)成干擾。2. 3氣相色譜法在硫酸介質(zhì)中，NO與環(huán)己基磺酸鈉反應(yīng)生成環(huán)己醇亞硝酸鈉，環(huán)己醇亞硝 酸鈉在常溫下成氣態(tài)，頂空進(jìn)樣，用FID檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。該方法的取樣量較少、 簡(jiǎn)單快速，抗其他離子干擾的能力強(qiáng)，提高了靈敏度和準(zhǔn)確度。也可利用NO用 DlnO,氧化為？0，用酸作催化劑，控制一定溫度，使NO與苯發(fā)生反應(yīng)生成硝基 苯，萃取，然后利用選擇性強(qiáng)的電子捕獲檢測(cè)器檢測(cè)該生成物，從而測(cè)出樣品中 NOJ的含量。3、電化學(xué)法3. 1示波極譜法GB5009. 033-2003測(cè)定方法中，另外一種方法是

8、示波極譜法，試樣經(jīng)沉淀 蛋口質(zhì)、除去脂肪后，在弱酸性的條件下，N0與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，在弱 堿性條件下再與8疑基卩奎咻耦合形成橙色染料，該染料在汞電極上還原產(chǎn)生電 流，電流與N0的濃度呈線性關(guān)系，可與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量。3. 2伏安法伏安法是在酸性介質(zhì)中以玻碳電極(GCE)為工作電極的鐵亂化鉀電催化還原 亞硝酸鹽的電化學(xué)行為及電分析方法。當(dāng)Kfe(CN)6濃度一定時(shí)，電催化還原峰電 流與N0濃度在4.0X10l.OXWmol/L范圍時(shí)有良好的線性關(guān)系，運(yùn)用方波 伏安法在優(yōu)化條件下測(cè)定了水樣中亞硝酸鹽含量，測(cè)定結(jié)果令人滿意。4、原子吸收光譜該方法是一種用原子吸收光譜法間接測(cè)定腌制食品和熏制食品

9、中亞硝酸鹽 含量的方法.在酸性條件下，用高猛酸鉀將食品中的亞硝酸鹽先轉(zhuǎn)化成二氧化鐳 沉淀,再用硫酸溶解沉淀，以原子吸收光譜法測(cè)定鐳的吸光度，從而間接得到亞硝 酸鹽的含量，回收率在97. 6%105. 2%之間.此方法簡(jiǎn)捷快速，適用于腌制食品和 熏制食品中亞硝酸鹽含量的測(cè)定.目前，還有一些新的方法已應(yīng)用于食品中NOJ含量的測(cè)定：如化學(xué)發(fā)光法、 熒光法、原子吸收光譜法等。光度法所用儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)廉、靈敬度較高，具有實(shí)用性和可操作性。曲 于NOJ在固體電極（如GCE, Au和Pt等）上氧化（或還原）一般需要較高的過(guò)電位，因 而不易直接發(fā)生電化學(xué)氧化（或還原）反應(yīng)，故電化學(xué)方法的使用范圍不如光度法

10、使用范圍廣。熒光法、化學(xué)發(fā)光法、原子吸收光譜法等對(duì)儀器的要求較高。綜上所述我們選定紫外分光光度法來(lái)測(cè)定熏肉中亞硝酸鹽的含量。實(shí)驗(yàn)原理如下：樣品經(jīng)沉淀蛋口質(zhì)、除去脂肪后，在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)生成重氮鹽，此重氮鹽再與a-荼胺試劑發(fā)生偶合反應(yīng)，生成紫 紅色偶氮化合物，其最大吸收波長(zhǎng)為547nm,可測(cè)定吸光度并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定 量。反應(yīng)式如下：NH29x500x107肉制品中亞硝酸鹽含量二二（mg/kg）nix 10式中：X為山測(cè)得的吸光度訃在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的亞硝酸鈉質(zhì)量濃度（ug/mL）；m為樣品質(zhì)量（g）o四、實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)儀器和試劑1、儀器 菜刀一把、砧板一個(gè)，UV1

11、700紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，分析天平，臺(tái)秤 ImL、2mL、5mL、20mL移液管各1支，50mL燒杯6個(gè)，lOOmL燒杯1個(gè)，25mL 容量瓶1個(gè)，500mL容量瓶4個(gè)，50mL容量瓶8個(gè)，lOOmL容量瓶4個(gè)， 濾紙、過(guò)濾裝置一套，比色皿2個(gè)。2、試劑 亞鐵氤化鉀溶液：稱(chēng)取10. 6190克亞鐵氤化鉀KFe(CN)6 3H：O溶于水，并 稀釋至100. OOmLo 乙酸鋅溶液：稱(chēng)取22.0克乙酸鋅Zn(CH3COO)2 *2H：0，加3mL冰醋酸溶于水， 并稀釋至100. OOmLo 飽和硼砂溶液：5. 0克硼酸鈉(Na:B0, - 10比0)溶于100. 00mL熱水中，冷卻 備用。 2

12、0%的鹽酸的配置：量取225. 6mL的37%的濃鹽酸于500. 00mL容量瓶中定容 到刻度。 0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液(4g/L)：稱(chēng)取2.0g對(duì)氨基苯磺酸溶于500. 00mL20% 鹽酸中，避光保存。 0.2%ci-荼胺溶液(2g/L):稱(chēng)取0. lg鹽酸蔡乙二胺，以水定容50. 00mL,避 光保存。 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(200.6 ug/mL)：精確稱(chēng)取0. 1003g于硅膠干燥器中干燥 24h的亞硝酸鈉(優(yōu)級(jí)純)，加水定容到500. OOmLo 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(5.015ug/mL)：臨用前，吸取此溶液2. 5mL于100mL容 量瓶中，用水定容到100. OOmLo實(shí)驗(yàn)步驟1、

13、樣品處理1) 把適量的熏肉依序放在砧板上，用菜刀剁碎。2) 稱(chēng)取經(jīng)剁碎混合均勻的試樣5g于50mL燒杯中，加入硼砂飽和溶液12. 5mL, 以玻璃棒攪和，繼之以70C左右重蒸鐳水約300mL將其洗入500. 00mL的容 量瓶中，置沸水浴中加熱15min,取出，一邊轉(zhuǎn)動(dòng)，一邊加入5mL亞鐵氤化 鉀溶液，搖勻，再加入5mL乙酸鋅溶液以沉淀蛋口質(zhì)。冷卻到室溫，定容， 搖勻，放置片刻，除去上層脂肪，過(guò)濾，棄去初濾液30mL,收集濾液備用。2、實(shí)驗(yàn)條件的選擇1) 最大吸收波長(zhǎng)的確定吸取濃度為5. 015 u g/m的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 80mL,置于50. 00mL容量瓶 中，加2. OmL 0.

14、4%對(duì)氨基苯磺酸溶液，搖勻，靜置35min,再加入2mL 0. 2% a -蔡胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15min,于lcm比色杯中，另以蒸憎水代替亞硝酸鈉，用同樣配制方法的溶液為空白。在610nm-450nm之間進(jìn)行掃描, 得到最大吸收波長(zhǎng)max=545nmo波長(zhǎng)/nm450460470480490500510520530535吸光度0. 0050. 0080.0110.0150. 0210. 0290. 0380. 0460. 0530. 057波長(zhǎng)/nm540545550555560570580590600吸光度0. 0590. 0590. 0590. 0580. 0560. 049

15、0. 0390. 0260. 014實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：反應(yīng)生成的紫紅色偶氮化合物在450-480nm波長(zhǎng)范圉內(nèi)的 吸收較小，小于0.020,而在540550nm波長(zhǎng)范圍間取得最大吸收波長(zhǎng)，在波 長(zhǎng)為550nm的波長(zhǎng)后該偶氮化合物的吸光度乂開(kāi)始下降，故本方法選取545nm 為實(shí)驗(yàn)中的最大吸收波長(zhǎng)。2）空口溶液的選擇分別對(duì)試劑空白（2.00ml對(duì)氨基苯磺酸溶液+2.00ml a 胺溶液）、5g氯化 鈉溶液分別加入50.00ml比色管中加水至刻度，在545nm處進(jìn)行了吸光度測(cè)試。 各種溶液的吸光度測(cè)定值溶液試劑空白氯化鈉去離子水吸光度A0.0080.0240.014實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：試劑空白在545nm下的

16、吸光度最低，說(shuō)明亞硝酸根與a -蔡 胺試劑的特征顯色反應(yīng)，在545nm波長(zhǎng)下光度測(cè)定亞硝酸根的方法是合理的，而 且該方法具有較好的選擇性，實(shí)驗(yàn)說(shuō)明試劑空白和去離子水的吸光度相差不大， 對(duì)于實(shí)驗(yàn)的參比溶液的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)方便原則選擇去離子水為參比溶液。3）酸度的選取因?yàn)閬喯跛猁}與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)生成重氮鹽的反應(yīng)需要在弱 酸條件下反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中分別釆用15%、20%、25%的鹽酸溶液溶解對(duì)氨基苯磺酸, 按上述條件測(cè)定試樣的吸光度，探究酸度對(duì)顯色反應(yīng)的影響。不同酸度對(duì)吸光度的影響：鹽酸含量15%HC12 0 %HC125%HC1吸光度A0.0580.0600.056實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：酸度對(duì)顯色反應(yīng)

17、的影響并不是很明顯，但是也有可能是因?yàn)? 反應(yīng)在稀釋時(shí)PH值變化不明顯導(dǎo)對(duì)顯色反應(yīng)的影響不明顯。實(shí)驗(yàn)中用20%的鹽 酸溶解對(duì)氨基苯磺酸測(cè)得的吸光度相對(duì)較大，所以選取20%的鹽酸溶解對(duì)氨基苯 磺酸。3）顯色劑用量的影響a-蔡胺作為亞硝酸根的顯色劑，靈敬度很高，且在反應(yīng)中顯色劑的用量對(duì) 反應(yīng)有一定影響，在545nm下，用20%的鹽酸溶解對(duì)氨基苯磺酸與亞硝酸鈉反應(yīng), 分別加入0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00ml的ci -蔡胺溶液進(jìn)行吸光度的比 較。不同顯色劑的用量對(duì)吸光度的影響:顯色劑用量（mL）0.501.001.502.002.503.00吸光度0.0600.0630.

18、0630.0650.0640.065實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著顯色劑用量的增加，吸光度逐漸升高，在顯色劑用量達(dá) 到2.00mL時(shí)，吸光度乂下降，但是在顯色劑增加到2.00mL時(shí)，吸光度乂達(dá)到 最大值0.065,故本實(shí)驗(yàn)選取50mL試液中加入2.0mL a -蔡胺溶液。4）顯色時(shí)間的選取顯色時(shí)間影響顯色反應(yīng)效果，為防止紫紅色重氮偶合物在放置過(guò)程中分解， 或發(fā)生其他反應(yīng)使吸光度測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確，本實(shí)驗(yàn)將同一份標(biāo)液，從加入鹽酸蔡 乙二胺試劑溶液時(shí)開(kāi)始計(jì)算，分別靜置不同時(shí)間后測(cè)定其吸光度。不同放置時(shí)間對(duì)吸光度的影響：時(shí)間（min）0510152025吸光度A0.0600.0620.0630.0650.0640.

19、064實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：剛加入時(shí)，因?yàn)轱@色劑還未與反應(yīng)物完全反應(yīng)，測(cè)得的吸光 度明顯較低，隨著放置時(shí)間的加長(zhǎng)，顯色劑和反應(yīng)物逐漸反應(yīng)，吸光度逐漸增加, 在放置時(shí)間為15分鐘是吸光度達(dá)到最大值，但是在15分鐘后略有下降并且趨于 穩(wěn)定，可能是因?yàn)樯晌飦V進(jìn)一步反應(yīng)，但是該反應(yīng)速率較慢，故其吸光度降低 但是不明顯。故本實(shí)驗(yàn)選擇顯色反應(yīng)時(shí)間為15分鐘。3、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用移液管精確吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液(5. 015 u g/mL) 0.00, 0.20, 0. 40, 0. 60, 0.80, 1.00, 1.50, 2. OOmL 于一組 50. 00 mL 容量瓶中，各加水至 25mL,分 別

20、加2. OOmLO. 4%對(duì)氨基苯磺酸溶液，搖勻，靜置35min后，各加入2. OOmL 0. 2%a 胺溶液，并用水定容到50. OOmL,搖勻。 靜置15min后，用lcm比色皿，用分光光度計(jì)在545nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度， 以蒸鐳水為空白。以測(cè)得的各比色液的吸光度對(duì)應(yīng)的亞硝酸濃度作曲線。比 色液中亞硝酸鈉濃度為00. 30 P g/mL時(shí)，兩者呈線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的線性相關(guān)系數(shù)R2= 0.9998,線性相關(guān)性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)中配制的標(biāo) 準(zhǔn)溶液濃度較準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的可信度。加入的NaNOz標(biāo) 準(zhǔn)洛液濃度的體 積0. 000. 200.400. 600. 801.001.

21、502. 00NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液 濃度(ug/mL)0. 000. 0200. 0400.0600. 0800. 1000. 1500. 201吸光度A0. 0080. 0210. 0360. 0510. 0660. 0810. 1190. 155圖二亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線0 1800 1600. 140y = 0. 7394x + 0. 007R： = 0. 99980 1200 1000 080吸光度A線性（吸光度A）0 0600. 0400 0200 0000. 0000. 0500. 1000. 1500. 2000. 250NaN02標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(ug/mL)4、亞硝酸鹽的測(cè)定取20mL待

22、測(cè)液于25mL容量瓶中，加ImLO. 4%對(duì)氨基苯磺酸溶液，搖勻。靜 置35分鐘后，加入l.OmLO. 2%a胺溶液，定容，搖勻，靜置15min。比色 測(cè)定，記錄吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算得相應(yīng)的亞硝酸鈉濃度（吒/mL）,計(jì) 算試樣中亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉訃）的含量。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論：1.本次實(shí)驗(yàn)探究結(jié)果顯示，用紫外分光光度法并以a蔡胺溶液為顯色劑測(cè)定 熏肉中亞硝酸鹽的含量的最佳條件是:最大吸收波長(zhǎng)545nm,以20%的鹽酸為酸度調(diào)節(jié)劑（洛液最后PH值約為3-4）比較合適，顯色劑用量為每 50. OOmL試液用2. OOmL比較合適，顯色時(shí)間為15分鐘比較合適。由于使用 了亞硝酸鹽的特效試劑a-蔡胺為顯色劑，成功的避免了實(shí)驗(yàn)中其它陰陽(yáng) 離子的影響，實(shí)驗(yàn)?zāi)苓_(dá)到較理想的效果。2.本次實(shí)驗(yàn)中，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9998,線 性相關(guān)性強(qiáng)，故而實(shí)驗(yàn)中配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度較準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的 可信度。3樣品中亞硝酸鹽含量測(cè)定結(jié)果樣品熏肉質(zhì)量(g)5.001g吸光度A0.030未知樣亞硝酸鹽含量ug/mL0.032熏肉中亞硝酸鹽的含量mg/kg4.0從本次實(shí)驗(yàn)來(lái)看，實(shí)驗(yàn)中所用熏肉的檢驗(yàn)結(jié)果(亞硝酸鹽含量為0. 004g/kg) 來(lái)看符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及肉制品中亞硝酸鹽添加量0