分子診斷學(xué)：α-地貧瓊脂糖凝膠電泳及結(jié)果分析

1、LOGO 地中海貧血基因檢測(cè)地中海貧血基因檢測(cè) -地貧地貧瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 及結(jié)果分析及結(jié)果分析 v1 學(xué)習(xí)與掌握瓊脂糖凝膠電泳原理和學(xué)習(xí)與掌握瓊脂糖凝膠電泳原理和 方法。方法。 v2 利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和凝膠成利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和凝膠成 像系統(tǒng)判斷像系統(tǒng)判斷地貧的基因類型。地貧的基因類型。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模?原理原理 v在在pHpH值為值為8.0-8.38.0-8.3時(shí)，核酸分子堿基幾乎不時(shí)，核酸分子堿基幾乎不 解離，磷酸解離，磷酸基團(tuán)基團(tuán)全部解離，核酸分子帶負(fù)全部解離，核酸分子帶負(fù) 電，在電泳時(shí)向電，在電泳時(shí)向正極正極移動(dòng)。移動(dòng)。 v采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支

2、持物，采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物， 在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不 同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異，從同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異，從 而能達(dá)到分離核酸片段檢測(cè)其大小的目的。而能達(dá)到分離核酸片段檢測(cè)其大小的目的。 v核酸分子中嵌入熒光染料（如核酸分子中嵌入熒光染料（如EBEB）后，在）后，在 紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。 瓊脂糖瓊脂糖是從海藻中提取的、是從海藻中提取的、 由由D-D-和和 L- L-半乳糖殘基通過(guò)半乳糖殘基通過(guò) 和和糖苷鍵交替構(gòu)成的線糖苷鍵交替構(gòu)成的線 狀聚合物。瓊脂糖鏈形成螺

3、狀聚合物。瓊脂糖鏈形成螺 旋纖維，然后再聚合成半徑旋纖維，然后再聚合成半徑 為為20-30nm20-30nm的超螺旋結(jié)構(gòu)。的超螺旋結(jié)構(gòu)。 瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過(guò)瓊脂糖的最初濃度來(lái)控瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過(guò)瓊脂糖的最初濃度來(lái)控 制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊 脂糖形成較小的孔徑。脂糖形成較小的孔徑。 原理原理 干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，加熱煮沸變?yōu)槌吻?，干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，加熱煮沸變?yōu)槌吻澹?室溫冷卻、凝聚，即成瓊脂糖凝膠。室溫冷卻、凝聚，即成瓊脂糖凝膠。 影響影響 瓊脂糖濃度與線性瓊脂糖濃度與線性DNA分離范圍參數(shù)分離范圍參

4、數(shù) 相同大小的線狀相同大小的線狀 DNADNA片斷在不同濃度的瓊片斷在不同濃度的瓊 脂糖凝膠中遷移率不同脂糖凝膠中遷移率不同. .在一定濃度的瓊脂在一定濃度的瓊脂 糖凝膠中，不同大小的糖凝膠中，不同大小的DNADNA片段的遷移率也片段的遷移率也 是不同的。是不同的。 瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度(%)(%)分離范圍（分離范圍（kbkb） 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 DNA分子的大小分子的大小 v雙鏈雙鏈DNADNA分子在凝膠中遷移的速率與其分子在凝膠中遷移的速率與其 堿基數(shù)的常用對(duì)數(shù)成反比堿基

5、數(shù)的常用對(duì)數(shù)成反比。 v分子越大，遷移越慢。一是摩擦阻力分子越大，遷移越慢。一是摩擦阻力 越大，二是大分子通過(guò)凝膠孔徑的效越大，二是大分子通過(guò)凝膠孔徑的效 率低于較小的分子。率低于較小的分子。 DNA的構(gòu)象的構(gòu)象 DNA的構(gòu)象的構(gòu)象 v不同構(gòu)象不同構(gòu)象DNADNA分子在電場(chǎng)中移動(dòng)的距離分子在電場(chǎng)中移動(dòng)的距離 不同。具有相同分子量的線狀、開(kāi)環(huán)狀不同。具有相同分子量的線狀、開(kāi)環(huán)狀 和超螺旋和超螺旋DNADNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度 不同。不同。 v遷移速度：遷移速度： 超螺旋的超螺旋的DNADNA線狀線狀DNA DNA 開(kāi)環(huán)開(kāi)環(huán)DNA DNA 。 緩沖液緩沖液 vDNA的泳動(dòng)

6、受緩沖液的組成和離子強(qiáng)的泳動(dòng)受緩沖液的組成和離子強(qiáng) 度的影響度的影響。 缺乏離子，電導(dǎo)率嚴(yán)重降低，電泳遷移率很缺乏離子，電導(dǎo)率嚴(yán)重降低，電泳遷移率很 慢；離子強(qiáng)度過(guò)高，電導(dǎo)率升高，極易產(chǎn)生大量慢；離子強(qiáng)度過(guò)高，電導(dǎo)率升高，極易產(chǎn)生大量 的熱能，最嚴(yán)重的結(jié)果是凝膠熔化，的熱能，最嚴(yán)重的結(jié)果是凝膠熔化，DNADNA變性變性 v最常用的緩沖液是最常用的緩沖液是1TAE(Tris-醋酸- EDTA)和和TBE(Tris-TBE(Tris-硼酸硼酸-EDTA)-EDTA)。 電泳電壓電泳電壓 v低壓條件下，線狀低壓條件下，線狀DNADNA在瓊脂糖凝膠上在瓊脂糖凝膠上 泳動(dòng)速度和電壓成正比。隨著電壓升高，

7、泳動(dòng)速度和電壓成正比。隨著電壓升高， 高分子量的高分子量的DNADNA片段泳動(dòng)速度和電壓不片段泳動(dòng)速度和電壓不 成正比關(guān)系，分辨率下降了，因此為了成正比關(guān)系，分辨率下降了，因此為了 得到良好的分離效果，電場(chǎng)電壓不宜超得到良好的分離效果，電場(chǎng)電壓不宜超 過(guò)過(guò)5V/CM5V/CM。 指示劑指示劑 v常用的電泳上樣緩沖液常用的電泳上樣緩沖液 含溴酚藍(lán)，有的還含有含溴酚藍(lán)，有的還含有 二甲苯青，這些指示劑二甲苯青，這些指示劑 可以指示電泳的速度，可以指示電泳的速度， 也可以利用其遷移率大也可以利用其遷移率大 致估計(jì)致估計(jì)DNADNA的分子量，的分子量， 而與瓊脂糖濃度無(wú)關(guān)。而與瓊脂糖濃度無(wú)關(guān)。 v （

8、本試劑已包含指示劑，電泳（本試劑已包含指示劑，電泳 時(shí)無(wú)需另加）時(shí)無(wú)需另加） 染色染色 v溴化乙淀（溴化乙淀（EBEB）是核酸）是核酸 的染色劑，能插入的染色劑，能插入DNADNA分分 子中形成熒光結(jié)合物，子中形成熒光結(jié)合物， EBEB在紫外線照射下的發(fā)在紫外線照射下的發(fā) 射熒光。熒光的強(qiáng)度與射熒光。熒光的強(qiáng)度與 DNADNA的含量成正比，從而的含量成正比，從而 可以確定可以確定DNADNA片段在凝膠片段在凝膠 中的位置及估計(jì)出待測(cè)中的位置及估計(jì)出待測(cè) 樣品的濃度樣品的濃度 v EB是強(qiáng)致癌劑是強(qiáng)致癌劑. v 今天采用的是廠家提供的替今天采用的是廠家提供的替 代染料代染料 染色劑即可以在電泳前

9、染色劑即可以在電泳前 加入樣液，又可以電泳加入樣液，又可以電泳 后再對(duì)凝膠染色后再對(duì)凝膠染色 材料和設(shè)備 v材料：材料：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物 v設(shè)備：微量移液器，電泳儀，瓊脂糖設(shè)備：微量移液器，電泳儀，瓊脂糖 平板電泳裝置，微波爐，凝膠成像系平板電泳裝置，微波爐，凝膠成像系 統(tǒng)等。統(tǒng)等。 試劑準(zhǔn)備 1. TAE電泳緩沖液：電泳緩沖液： 50X TAE 1X TAE ：取取5050TAETAE緩沖液緩沖液20ml20ml，加水，加水 至至1000ml1000ml 2 . DNA Marker標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)準(zhǔn)分子量 電泳操作步驟電泳操作步驟 2 2、膠槽準(zhǔn)備膠槽準(zhǔn)備 取出膠板和梳子，將膠板放入膠槽

10、中取出膠板和梳子，將膠板放入膠槽中; ; 將梳子垂直插入到膠槽的小凹槽內(nèi)，梳齒底將梳子垂直插入到膠槽的小凹槽內(nèi)，梳齒底 端和板面有端和板面有1mm1mm的間隙的間隙; ; 將膠槽放在調(diào)整好的水平臺(tái)上。將膠槽放在調(diào)整好的水平臺(tái)上。 一、瓊脂糖凝膠的制備（示教視頻）一、瓊脂糖凝膠的制備（示教視頻） 1 、電泳緩沖液準(zhǔn)備電泳緩沖液準(zhǔn)備 取取5050TAETAE緩沖液緩沖液20ml20ml，加水至，加水至1000ml1000ml，配，配 制成制成1 1TAETAE稀釋緩沖，待用。稀釋緩沖，待用。 電泳操作步驟電泳操作步驟 v3、凝膠準(zhǔn)備凝膠準(zhǔn)備 用用1 1TAETAE配制配制1 1瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝

11、膠。 稱稱1g1g瓊脂糖置三角瓶中，加瓊脂糖置三角瓶中，加100ml100ml 1 1TAE; TAE; 微波爐加熱大約微波爐加熱大約3-53-5分鐘，熔化瓊脂糖分鐘，熔化瓊脂糖; ; 熔化的瓊脂糖自然冷卻到熔化的瓊脂糖自然冷卻到50506060時(shí)，輕輕混時(shí)，輕輕混 勻準(zhǔn)備鋪膠勻準(zhǔn)備鋪膠。 4、鋪膠：鋪膠：將冷卻致將冷卻致6060的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠槽的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠槽 內(nèi)，內(nèi)，凝膠厚度凝膠厚度3 35mm,5mm,室溫下靜置半小時(shí)左右，凝室溫下靜置半小時(shí)左右，凝 膠固化。膠固化。 5 5、輕輕拔出固定在凝膠中的梳子。將帶凝、輕輕拔出固定在凝膠中的梳子。將帶凝 膠的膠板置于電泳槽中，并使膠

12、的膠板置于電泳槽中，并使樣品孔位于樣品孔位于 電場(chǎng)負(fù)極電場(chǎng)負(fù)極，向電泳槽中加入向電泳槽中加入1 1TAETAE電泳緩電泳緩 沖液，越過(guò)凝膠表面即可沖液，越過(guò)凝膠表面即可。 6 6、原梳齒處、原梳齒處( (樣品孔樣品孔) )即被緩沖液充滿，如即被緩沖液充滿，如 發(fā)現(xiàn)有發(fā)現(xiàn)有氣泡氣泡，應(yīng)設(shè)法去除應(yīng)設(shè)法去除。 電泳操作步驟電泳操作步驟 二二 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 1 1、加樣：加樣： 直接從直接從PCRPCR擴(kuò)增后的反應(yīng)管中取擴(kuò)增后的反應(yīng)管中取5l5l紅色液體加入紅色液體加入 電泳孔中，注意不要加到孔外；電泳孔中，注意不要加到孔外； markermarker：5ul5ul 2 2、電泳：電泳

13、：蓋上電泳槽，接通電源，開(kāi)始電泳蓋上電泳槽，接通電源，開(kāi)始電泳 開(kāi)始電泳前，再次確認(rèn)凝膠樣品孔處于電場(chǎng)的負(fù)極。開(kāi)始電泳前，再次確認(rèn)凝膠樣品孔處于電場(chǎng)的負(fù)極。 電泳條件：電壓電泳條件：電壓120-130V120-130V；時(shí)間；時(shí)間20-3020-30分鐘左右分鐘左右 電泳操作步驟電泳操作步驟 分組實(shí)驗(yàn) v1-4號(hào)號(hào)第一個(gè)槽，第一個(gè)槽， 5-8號(hào)號(hào)第二個(gè)槽第二個(gè)槽 v 樣品樣品 加樣孔加樣孔 陽(yáng)性陽(yáng)性 1 2 marker 3 4 陰性陰性 對(duì)照對(duì)照 陽(yáng)性陽(yáng)性 5 6 marker 7 8 陰性陰性 對(duì)照對(duì)照 3 3、電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠、電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠 4 4、電泳結(jié)

14、果分析：、電泳結(jié)果分析： 紫外檢測(cè)儀直接觀察電泳條帶紫外檢測(cè)儀直接觀察電泳條帶 凝膠成像系統(tǒng)拍照凝膠成像系統(tǒng)拍照 觀察電泳帶及其位置，并與核酸分觀察電泳帶及其位置，并與核酸分 子量標(biāo)準(zhǔn)子量標(biāo)準(zhǔn)MarkerMarker比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小， 判斷基因型。判斷基因型。 電泳操作步驟電泳操作步驟 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 （- 3.7/-3.7） （-4.2/ -4.2） （- 3.7 / -SEA ) （-3.7/ -4.2） （- 4.2 / -SEA ) （ - - / - 4.2) （ - - / -3.7) （ - - /-SEA

15、 ) 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 1 1 實(shí)驗(yàn)用具和溶液均有可能受到實(shí)驗(yàn)用具和溶液均有可能受到染料染料的污染，的污染， 操作過(guò)程應(yīng)操作過(guò)程應(yīng)戴手套戴手套! ! 2 2 加樣時(shí)小心操作加樣時(shí)小心操作, , 槍頭伸入孔中緩慢加入，槍頭伸入孔中緩慢加入， 避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。 3 3 本體系含有正常對(duì)照條帶，無(wú)論有無(wú)發(fā)生缺本體系含有正常對(duì)照條帶，無(wú)論有無(wú)發(fā)生缺 失，每個(gè)樣本至少應(yīng)有一條電泳條帶，否則，失，每個(gè)樣本至少應(yīng)有一條電泳條帶，否則， 提示擴(kuò)增失敗，應(yīng)重新檢測(cè)提示擴(kuò)增失敗，應(yīng)重新檢測(cè) -地貧地貧實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 v考慮到四對(duì)引物要在同一管擴(kuò)增并通 過(guò)電

16、泳來(lái)判斷結(jié)果，設(shè)計(jì)引物位置時(shí) 各PCR產(chǎn)物的條帶大小要有區(qū)別，最 終-3.7、-4.2和SEA的擴(kuò)增 條帶分別約為：2.0kbp、1.7kbp、 1.4kbp和1.2kbp 電泳條帶與基因型的對(duì)應(yīng)關(guān)系 v條帶大小條帶大小 基因型基因型基因型基因型條帶大小條帶大小 v2.0 kb -3.71.4 kb-4.2 v1.7 kb 1.2 kb-SEA 電泳條帶與基因型判斷 v出現(xiàn)電泳條帶出現(xiàn)電泳條帶 基因型基因型 v1.7Kb (- /- ) v1.7Kb 2.0Kb (- / -3.7) v1.7Kb 1.4Kb (-/ -4.2) v1.7Kb 1.2Kb (-/-SEA ) v2.0Kb 1.

17、2Kb (-3.7 / -SEA ) v2.0Kb 1.4Kb （-3.7/ -4.2） v1.4Kb 1.2Kb (- 4.2 / -SEA ) v2.0Kb （- 3.7/- 3.7） v1.4 kb （-4.2/ -4.2） v1.2Kb （- SEA /- SEA ）。）。 地中海貧血的血液學(xué)表型特征地中海貧血的血液學(xué)表型特征 RBC 參數(shù)參數(shù) MCV MCH 細(xì)胞形態(tài)變化細(xì)胞形態(tài)變化 Hb電泳分析電泳分析 Hb A2 () 或或 ( ) Hb Barts Hb H () Hb E ( ) a地貧的基因型與表現(xiàn)型地貧的基因型與表現(xiàn)型 Normal (/) 正常正常 + thal tra

18、it (/- 3.7) (/- 4.2) 靜止型單一靜止型單一基因缺失或喪失功能基因缺失或喪失功能 臨床無(wú)任何癥狀，一般血液學(xué)檢查無(wú)異樣，僅 平均紅細(xì)胞體積(MCV) 位于正常值下限。 a地貧的基因型與表現(xiàn)型地貧的基因型與表現(xiàn)型 Hb H disease (- 3.7/-SEA) (- 4.2/-SEA) o Thal trait ( /-SEA) ( - / - ) 血紅蛋白血紅蛋白H病病3個(gè)個(gè)基因缺失或喪失功能基因缺失或喪失功能 肝脾腫大，中度貧血。小細(xì)胞，低色素，HbH含 量較高，易發(fā)生溶血，有些病例需不定期輸血， 癥重者甚至需切除脾臟。 標(biāo)準(zhǔn)型標(biāo)準(zhǔn)型2個(gè)個(gè)基因缺失或喪失功能基因缺失或喪失功能 臨床無(wú)癥狀，血液學(xué)檢查出現(xiàn)輕微貧血，紅細(xì) 胞大小不均一，平均紅細(xì)胞體積(MCV) 及平均 血紅蛋白含量(MCH)明顯偏低。 a地貧的基因型與表現(xiàn)型地貧的基因型與表現(xiàn)型 Hb Barts Hydrops (-SEA/-SEA) Hb Barts Hb Barts 水腫胎兒綜合癥水腫胎兒綜合癥 4個(gè)基因缺失或喪失功能 患胎于妊娠晚期或產(chǎn)后數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡，全身水 腫，肝脾腫大。 評(píng)價(jià)評(píng)價(jià) v1 1、本實(shí)驗(yàn)的局限性為本方法僅檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)的局限性為本方法僅檢測(cè)3 3種中種中