不同位置土壤中枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活力的比較

1、不同位置土壤中枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活力的比較摘要：從月季花下、草坪上及大樹下采集土壤，然后 對(duì)其進(jìn)行分離得到枯草芽孢桿菌。通過對(duì)枯草芽苞桿菌利用 酪蛋白培養(yǎng)基產(chǎn)蛋白酶能力的比較，發(fā)現(xiàn)月季花下土壤中分 離得到的枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的能力最強(qiáng)。關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；蛋白酶；純化中圖分類號(hào)： S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1007-273X （2014）03-0012-02隨著飼用酶制劑應(yīng)用研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)了 蛋白酶在動(dòng)物營養(yǎng)上的獨(dú)特作用，蛋白酶也因此受到了越來 越多的關(guān)注。根據(jù)來源的不同，蛋白酶可分為動(dòng)物源性蛋白 酶、植物源性蛋白酶、微生物源性蛋白酶等 1 。其中微生物 蛋白

2、酶既有通過細(xì)菌（如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌）培 養(yǎng)提取的，也有通過真菌（如黑曲霉、酵母）發(fā)酵提取的。 微生物蛋白酶和植物蛋白酶由于生產(chǎn)成本相對(duì)低廉，在多種 工業(yè)（如飼料、食品等）上得到了廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)通過對(duì) 不同位置的新鮮土壤進(jìn)行分離，篩選出產(chǎn)蛋白酶活力較高的 菌株，為微生物蛋白酶的研究奠定了基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 土壤試驗(yàn)用 3 份新鮮土壤：采自黃淮學(xué)院某月季花下、草坪 上及大樹下，距土壤表層約10 cm。1.2 方法1.2.1 菌株分離 將土樣平攤于一干凈的四方紙上，從紙 的四角及中間各取適量的土樣，混勻。稱取 1.0 g 混勻土樣 與 20 mL 肉湯培養(yǎng)基于錐形瓶中混合，封口。

3、再將其放入80 C恒溫水浴鍋中加熱處理 10 min，然后于恒溫?fù)u床內(nèi)30 C, 150 r/min 振蕩培養(yǎng) 24 h。用接種環(huán)接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30 C條件下培養(yǎng)24 h2， 3。1.2.2 革蘭氏染色 將上述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行 涂片鏡檢。在已干燥的抹片上滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，染色 1min，水洗；加路戈碘液進(jìn)行媒染 2 min，水洗；加95%乙醇 進(jìn)行脫色30 s，水洗；加10倍稀釋的石碳酸復(fù)紅染液， 復(fù)染 1 min ，水洗；吸干、烘干，鏡檢。1.2.3 生化試驗(yàn)（1 ）接觸酶試驗(yàn)。用接種環(huán)取一小環(huán)符合上述要求的 菌落涂抹于已滴有 10%過氧化氫溶液的載玻片上， 觀察載

4、玻 片上是否有大量氣泡產(chǎn)生。（2）V-P 試驗(yàn)。將符合上述要求的菌落接種于V-P 反應(yīng) 培養(yǎng)液中，37 C培養(yǎng)4 d后，取2 mL培養(yǎng)液和等量的 40%NaOH 溶液混合，充分振蕩后觀察培養(yǎng)液是否呈紅色。（3）水解淀粉試驗(yàn)。取符合上述要求的菌落接種于淀 粉培養(yǎng)基上，于37 C培養(yǎng)4 d后，在平板上滴加盧氏碘液 （需鋪滿菌落） ，觀察平板是否呈藍(lán)色，菌落周圍有無無色 透明圈出現(xiàn)。（4）檸檬酸鹽試驗(yàn)。將符合上述要求的菌落接種于檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，37 C培養(yǎng)4 d,觀察平板是否呈現(xiàn)藍(lán)色或 桃紅色。（5）分解酪素試驗(yàn)。將符合各個(gè)生化鑒定結(jié)果的菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床機(jī)內(nèi)30 C、150 r

5、/min振蕩富集培養(yǎng)24 h。然后再將其置于 80C水浴鍋中加熱10 min。取1 mL處理液以10倍稀釋法分別稀釋為 10 4、10 5、 10 6。分別取 0.1 mL 菌液涂布于酪素培養(yǎng)基上。倒置于恒溫培養(yǎng)箱中30 C培養(yǎng)24 h。觀察酪素平板上菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈，挑 H/C （透 明圈直徑/菌落直徑）比值大的菌種接入斜面培養(yǎng)基上。30 C 培養(yǎng)24 h,備用。1.2.4 菌種純化 平板劃線分離法在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 上分離純化挑選出的菌株。2 結(jié)果與分析2.1 菌種分離革蘭氏染色陽性；鏡檢結(jié)果為短桿狀、芽孢端生,形狀橢圓2.2 菌種鑒定生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果見表 1。有表 1 可見，該菌

6、對(duì)接觸酶 試驗(yàn)、 V-P 試驗(yàn)、水解淀粉試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)均呈陽性。由表 2 可見，月季花下分離后菌株在酵素平板上的 H/C 值最大。該菌能分解酪素，在酪素平板上菌落周圍所形成的 透明圈 H/C 結(jié)果見表 2。根據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果，依照伯杰氏細(xì)菌鑒定手 冊(cè)，可以認(rèn)為篩選到的菌株為枯草芽孢桿菌 4 ，其中月季 花下純化的枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)，草坪上純化的 枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力次之，大樹下純化的枯草芽孢桿 菌產(chǎn)蛋白酶能力最弱。3 討論 催化蛋白質(zhì)水解的酶種類很多，重要的有胃蛋白酶、胰 蛋白酶、 組織蛋白酶、 木瓜蛋白酶和枯草芽孢桿菌蛋白酶等。 許多行業(yè)已開始大量利用蛋白酶，因?yàn)樗瓤?/p>

7、以節(jié)省時(shí)間， 又能改善勞動(dòng)衛(wèi)生條件。 蛋白酶可用于蠶絲脫膠、 肉類嫩化、 酒類澄清等。 臨床上可作藥用， 如用胃蛋白酶治療消化不良， 用酸性蛋白酶治療支氣管炎；加酶洗衣粉是洗滌劑中的新產(chǎn) 品，含堿性蛋白酶，能去除衣物上的血漬和蛋白污物，但使 用時(shí)應(yīng)注意不要接觸皮膚，以免損傷皮膚表面的蛋白質(zhì)，引 起皮疹、濕疹等過敏現(xiàn)象。本試驗(yàn)通過對(duì)菌株分離、鑒定的研究，得到了產(chǎn)蛋白酶 的枯草芽孢桿菌，為進(jìn)一步提高該菌產(chǎn)中性蛋白酶的能力奠 定了基礎(chǔ)，在接下來的試驗(yàn)中，計(jì)劃篩選出高產(chǎn)蛋白酶的枯 草芽孢桿菌菌株，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，提高酶活力，增強(qiáng)穩(wěn)定 性，使其作為酶制劑盡快應(yīng)用于飼料添加劑產(chǎn)業(yè)。參考文獻(xiàn)：1 郭興華，益生菌一基礎(chǔ)與應(yīng)用M.北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社， 2002.2 湯保貴， 徐中文， 張金燕， 等.枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件及對(duì)水質(zhì)的凈化作用J.淡水魚業(yè)