遺傳實(shí)驗(yàn)word版

1、實(shí)驗(yàn)五細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取一實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諌A裂解法提取質(zhì)粒的方法。二 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 本實(shí)驗(yàn)涉及細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒的提取方法。三. 實(shí)驗(yàn)要求 采用集中授課、學(xué)生自主訓(xùn)練并重的模式組織教學(xué)。四. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備學(xué)生需要與質(zhì)粒相關(guān)的知識(shí)。五. 實(shí)驗(yàn)原理、方法和手段質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從l-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán) 的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì) 胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒泄的拷貝數(shù)并表達(dá)所攜帶的遺傳 信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能 存活。質(zhì)粒通常含有編碼某

2、些酶的基因，如抗生素抗性基因、大腸桿菌素基因.腸毒素基因 某些限制性內(nèi)切酶與修飾酶基因等，因而它的存在使宿主具有一些額外的特性。F質(zhì)粒(又 稱F因子或性質(zhì)粒).R質(zhì)粒(抗藥性因子)和Col質(zhì)粒(產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見 的天然質(zhì)粒。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型：緊密控制型(Stringent control)和松馳控制 型(Relaxed control)。前者只在細(xì)胞周期的一立階段進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)染色體不復(fù)制時(shí)，它 也不能復(fù)制，通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有1個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子，如F因子。后者的質(zhì)粒在整個(gè) 細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制，在每個(gè)細(xì)胞中有許多拷貝，一般在20個(gè)以上，如ColEl質(zhì)粒。 在使用蛋

3、白質(zhì)合成抑制劑氯霊素時(shí)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、染色體DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂均受 到抑制，緊密型質(zhì)粒復(fù)制停止，而松馳型質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制質(zhì)粒拷貝數(shù)可由原來的20多個(gè)擴(kuò)增 至1000-3000個(gè)，此時(shí)質(zhì)粒DNA占總DNA的含量可由原來的2$增加至40-50虬利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在，當(dāng)兩種質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入同 一細(xì)胞時(shí)，它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過程中彼此競(jìng)爭(zhēng)，在一些細(xì)胞中，一種質(zhì)粒占 優(yōu)勢(shì)，而在另一些細(xì)胞中另一種質(zhì)粒卻占優(yōu)勢(shì)。當(dāng)細(xì)胞生長幾代后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)丟失， 因而在細(xì)胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種，這種現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性(Incompat讓ility)。 但利用不同復(fù)制系統(tǒng)

4、的質(zhì)粒則可以穩(wěn)能地共存于同一宿主細(xì)胞中。把一個(gè)有用的目的DNA片段通過重組DNA技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工 具叫載體(Wctor) o細(xì)菌質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的 基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的匚一個(gè)理想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性：(1) 分子量小.多拷貝.松馳控制型；(2)具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)：(3) 能插入較大的外源D7A片段；(4)具有容易操作的檢測(cè)表型。常用的質(zhì)粒載體大小一般在 lkb至10kb之間，如PBR322. PUC系列、PGEM系列和pBS等。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載 體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基

5、因(如抗生素抗性基因)和一個(gè)人工合成的含有 多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可 能減少，以便于基因工程操作。大多數(shù)質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列，這些序列可用 于產(chǎn)生序列測(cè)左的單鏈DNA、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA.鑒左片段的插入方向.外源基因的大量表 達(dá)等a從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增：收集和裂 解細(xì)胞：分離和純化質(zhì)粒DNAo采用溶菌酶可以破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基磺酸鈉(SDS) 和Triton X-100可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或Triton X-100處理后，細(xì)菌染色體 DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同

6、時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核 酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色 體 DNA 變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA (covalently closed circular DNA 簡(jiǎn)稱 cccDNA)的 兩條鏈不會(huì)相互分開，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DA片段難以復(fù)性而是與變 性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起。而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋 分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺旋DA 外，還會(huì)產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA*如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)

7、生一處或多處斷裂， 分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀分子，稱開環(huán)DNA (Open circular DNA, 簡(jiǎn)稱ocDNA):如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DA (Linear DNA)o當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí)，同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開環(huán)和線 狀分子的泳動(dòng)速度快。六、實(shí)驗(yàn)條件(一) 菌株含PUCm-T質(zhì)粒的大腸桿菌(E. coli ) DH5a菌株。(二) 實(shí)驗(yàn)儀器及用具1. 5 mL Eppendorf離心管，微量取液器，臺(tái)式髙速離心機(jī)，恒溫振蕩搖床，髙壓蒸汽 消毒器(滅菌鍋)，渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。(三)

8、藥品和試劑1. LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani):稱取蛋白腺(Tryptone) 10 g,酵母提取物(Yeast extract) 5 g NaCl 10 溶于800 mL去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7. 5,加去離子水 至總體積1 L,髙壓下蒸氣滅菌20分鐘。2. LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加12呂瓊脂粉，髙壓滅菌。3-氨節(jié)青霊素(Ampicillin, Amp)母液：配成5 mg/ml水溶液，-20C保存?zhèn)溆谩?. 溶菌酶溶液:用10 mmol/L Tris HC1 (pH8. 0)溶液配制成10 mg/mL,并分裝成小 份保存于-209,每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。

9、5 3 mol/L NaAc (pH5.2) :50 mL 水中溶解 40.81 g NaAc 3H20,用冰醋酸調(diào) pH至5.2,加水定容至100 mL,分裝后髙壓滅菌，于4C貯存?zhèn)溆谩?溶液 I ： 50 mmol/L 匍萄糖,25mmol/L Tris-HCl (pH8. 0) , 10 mmol/LEDTA (pH8.0)o 溶液I可成批配制，每瓶100 mL,壓滅菌15分鐘，于4C貯存?zhèn)溆谩?溶液 II： 0.2 mol/L NaOH (臨用前用 10 mol/L NaOH 母液稀釋)，1% SDS.8溶液【：5 mol/L KAc 60 mL,冰醋酸115 mL, H20 28.5

10、 mL,左容至100 mL,并 高壓滅菌。9 RNA 酶 A 母液：將 RNA 酶 A 溶于 10 mmol/L Tris-HCl (pH7. 5) , 15 mmol/L NaCl 中，配成10 mg/mL的溶液,于100C加熱15分鐘，使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5mL Eppendorf管分裝成小份保存于-2OC。10. Tris飽和酚：市售酚中含有醍等氧化物，這些產(chǎn)物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo) 致RNA和DNA的交聯(lián)，應(yīng)在160C用冷凝管進(jìn)行重蒸。重蒸酚加入0. 1%的8-疑基唾咻(作 為抗氧化劑),并用等體積的 0.5 mol/L Tris-HCl (pH8. 0)和 0. 1

11、 mol/L Tris-HCl 1 (pH8. 0) 緩沖液反復(fù)抽提使之飽和并使其pH值達(dá)到7.6以上，因?yàn)樗嵝詶l件下DA會(huì)分配于有機(jī)相。11. 按氯仿：異戊醇=24 : 1體積比在氯仿中加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于 液相與有機(jī)相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。按體積/體積=1 ： 1混 合上述飽和酚與氯仿即得酚/氮仿(1 ： 1) o酚和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性，操作時(shí)應(yīng)戴手套。12. TE 緩沖液:10 mmo/L Tris-HCl (pH8.0) , 1 mmol/L EDTA (pH8.0)。髙壓滅菌 后儲(chǔ)存于4C。13. STET： 0. 1 mol/L NaCl,

12、 10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) , 10 mmol/L EDTA (pH8.0), 5% Triton X-100o14. STE： 0. 1 mol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl (pH8. 0) , 1 mmol幾 EDTA(pH80)。(-)細(xì)菌的培養(yǎng)和收集期。將含有質(zhì)粒pUCm-T的DH5(】菌種接種在LB固體培養(yǎng)基(含50 Mg/mLAmp)中，37C 培養(yǎng)12-24小時(shí)。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 Ug/mL Amp) 中，37C振蕩培養(yǎng)約12小時(shí)至對(duì)數(shù)生長后期。(二)質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒DNA小量提取

13、法對(duì)于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒DNA十分有用這 些方法共同特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速能同時(shí)處理大量樣品，所得DNA有一左純度，可滿足限制 酶切割、電泳分析的需要。1. 煮沸法(1) 將 1. 5 mL 培養(yǎng)液倒入 Eppendorf f于中，4C 卜 12 000 rpm (revolutions per minute,轉(zhuǎn)/分)離心30秒。（2）棄上淸，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。（3）將菌體沉淀懸浮于120 u L STET溶液中，渦旋混勻。（4）加入10 UL新配制的溶菌酶溶液（10 mg/mL）,渦旋振蕩3秒鐘。（5）將Eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。（6

14、）用微量離心機(jī)49下12 000 rpm離心10分鐘。（7）用無菌牙簽從Eppendorf管中去除細(xì)菌碎片。（8）取20 uL進(jìn)行電泳檢查。注意（1）對(duì)大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒DNAo（2）提取的質(zhì)粒DA中會(huì)含有RNA,但RNA并不干擾進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，如限制性內(nèi)切酶消 化,，亞克隆及連接反應(yīng)等。2. 堿法（乙醇沉淀）（1）取 l5mL 培養(yǎng)液倒入 1. 5mL Eeppendorf 管中,4*C b 12000 rpm 離心 30 秒。（2）棄上淸，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體流盡。（3）菌體沉淀重懸浮于100 uL溶液I中（需劇烈振蕩），室溫下放置5-10分

15、鐘。（4）加入新配制的溶液H200 UL,蓋緊管口，快速溫和顛倒Eppendorf 數(shù)次，以混 勻內(nèi)容物，冰浴5分鐘。（5）加入150 uL預(yù)冷的溶液I山 蓋緊管口，并倒置離心管.溫和振蕩10秒，使沉淀 混勻，冰浴中5-10分鐘，4C下12 000 rpm離心5-10分鐘。（6）上淸液移入干凈的Eppendorf管中，加入等體積的酚/氮仿，振蕩混勻，4C下 12 000 rpm離心5分鐘。（7）將水相移入干凈Eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻后置于-20C 冰箱中20分鐘，然后4C下12 000 rpm禽心10分鐘。（8）棄上淸，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加

16、入lmL70%乙醇洗沉淀 一次，4C下12 000 rpm離心5-10分鐘（9）吸除上淸液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥。（10）將沉淀溶于20 u L TE緩沖液（pH8. 0,含20 u g/mL RNase A）中，儲(chǔ)于-20C冰 箱中。注意（1）提取過程應(yīng)盡量保持低溫。（2）提取質(zhì)粒DNA過程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨(dú)用酚或 氮仿好，要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。（3）沉淀DA通常使用冰乙醇在低溫條件下放置時(shí)間稍長可使DNA沉淀完全。沉 淀DNA也可用異丙醇（一般使用等體積），且沉淀完全，速度快，但常把鹽沉淀下來，所 以多數(shù)還是用乙醇。

17、3. 堿法（離心柱型質(zhì)粒提取試劑盒，TIANGEN）（1）柱平衡步驟：將吸附柱CP4放入收集管,加入500 UL的平衡液BLJ2000 rpm離 心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。（2）取4mL過夜培養(yǎng)的菌液，加入干凈的離心管中，12000 rpm離心1分鐘，盡量吸 除上淸。（3）向留有菌體沉淀的離心管中加入500 n 1溶液P1 （含RNaseA,同溶液I）,使用 移液器或渦旋箴蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。（4）向離心管中加入500 nL溶液P2 （同溶液II）,溫和地上下翻轉(zhuǎn)4-6次使細(xì)菌細(xì) 胞膜充分裂解（劇烈震蕩將打斷細(xì)菌基因組，造成提取的質(zhì)粒混有基因組），此時(shí)藹心管中

18、的菌液變得淸亮粘稠。（5）加入700 uL溶液P3 （同溶液III）,將管溫和顛倒6-8次混勻,充分混勻，此時(shí) 將岀現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000 rpm離心10分鐘。（6）將上一步收集的上淸液分次加入過濾柱CS （過濾柱放入收集管中），12000 rpm 離心2分鐘，小心將離心后收集到的溶液分次加入吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）。（7）12000rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP4重新放入收集管中。（8）向吸附柱CP4中加入500 uL去蛋白液PD. 12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中 的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。（9）向吸附柱CP4中加入600 uL漂洗液PW

19、（含乙醇），12000rp m離心1分鐘，倒掉 收集管中的廢液.將吸附柱重新放入收集管中。（10）向吸附柱CP4中加入600 u L漂洗液PW, 12 000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管 中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。（11）將吸附柱CP4重新放入收集管中，12 000 rpm 心2分鐘以除去吸附柱殘余的 漂洗液：八（12）將吸附柱CP4放入干凈的離心管中，向吸附柱的中間部位滴加100 uL洗脫緩沖 液TB緩沖液，室溫靜置2分鐘，12 000 rpm離心1分鐘，離心管中的溶液即為質(zhì)粒溶液。注意（1）離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNAo八. 實(shí)驗(yàn)作業(yè)1.在堿法提取質(zhì)粒DM操

20、作過程中應(yīng)注意哪些問題？2. 染色體DNA與質(zhì)粒DNA分離的主要依據(jù)是什么？九、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求包括實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、 結(jié)果分析及思考題。實(shí)驗(yàn)六DNA的瓊脂糖凝膠電泳一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二實(shí)驗(yàn)內(nèi)容三. 實(shí)驗(yàn)要求四. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備掌握瓊脂糖凝膠電泳的方法。本實(shí)驗(yàn)涉及DNA的水平槽電泳檢驗(yàn)方法。采用集中授課、學(xué)生自主訓(xùn)練并重的模式組織教學(xué)。 學(xué)生需要掌握DNA的相關(guān)知識(shí)概念。五、實(shí)驗(yàn)原理.方法和手段瓊脂糖（agarose）是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，常作為電泳支持物。瓊脂 糖凝膠電泳是常用的核酸、蛋白質(zhì)分離與鑒上方法，它具有操作方便，設(shè)備簡(jiǎn)單，需樣品量 少及電泳速

21、度快等優(yōu)點(diǎn)。瓊脂糖凝膠電泳對(duì)核酸的分離作用主要是依拯它們的相對(duì)分子量質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時(shí) 與凝膠的濃度也有關(guān)系。在瓊脂糖凝膠（堿性溶液）中，DNA帶有負(fù)電荷，在電場(chǎng)作用下朝 正極移動(dòng)，其遷移距離（遷移率）與堿基對(duì)數(shù)的對(duì)數(shù)成反比，因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物務(wù) 動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離時(shí)行比較，便可測(cè)出未知片段的大小。因此，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離（表6-1）.但是當(dāng)DA分子大小超過20kb 時(shí)，DM的電泳遷移率不再依賴于分子大小，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。表6-1 DNA在瓊脂糖凝膠中的有效分離范用瓊脂糖濃度（%）0.30.60.70.91.21.52.0線

22、狀DNA相對(duì)分 子質(zhì)量（kb）60-520-110-0.87-0.56-0.44-0. 23-0. 1不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度不同，其次序?yàn)椋汗矁r(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed circular cccDNA） 直線DMA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當(dāng)瓊脂糖濃度太髙時(shí)，環(huán)狀DNA （般為球形） 不能進(jìn)入膠中，相對(duì)遷移率為0,而同等大小的直線雙鏈DNA （剛性棒狀）則可以長軸方向 前進(jìn)。浪化乙錠可插入到DNA分子的雙鏈中。在紫外光的照射下，插入淚化乙錠的DNA呈橙紅 色熒光.所以浪化乙錠可以作熒光指示劑指示DNA含量（檢測(cè)限約為10 ng）和位置。用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直

23、型及水平型。由于水平型凝膠具有制膠和加 樣方便的優(yōu)點(diǎn)，因而使用更多。水平型電泳時(shí)，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2 mm, 故又稱為潛水式。六. 實(shí)驗(yàn)條件（一）材料質(zhì)粒DMA或其它分子量不同的DNA片段。（二）實(shí)驗(yàn)儀器及用具電泳儀、電泳槽、膠帶.微波爐、凝膠成像儀（或紫外燈）等。（三）藥品和試劑1. TBE 緩沖液（5X）：稱取 Tris 54g,硼酸 27. 5g,并加入 0. 5MEDTA （pH8. 0） 20mL, 定溶至lOOOmLo注意：緩沖液中缺少離子時(shí)，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強(qiáng)度的緩沖液由于 電流太大會(huì)大量產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)，會(huì)造成膠熔化和DNA的變性。2. 上樣緩沖

24、液（6X）： 0.25%浪酚藍(lán)，40% （w/v）蔗糖水溶液。3. 10 Ug/mL浪化乙錠（EB）或者GoldenView溶液。注意：浪化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑并有中度毒性。使用含有該染料的溶液時(shí)必須戴手 套。使用完后應(yīng)該進(jìn)行凈化處理。通常用水配制成lOmg/mL的貯存液在室溫下避光儲(chǔ)存. 使用終濃度為。七. 實(shí)驗(yàn)步驟（一）瓊脂糖凝膠的制備1 用膠帶將洗凈.干燥的玻璃板的邊緣（或電泳裝置所配備的塑料盤的開口）封住， 形成一個(gè)膠膜。將膠膜放在工作臺(tái)的水平位宜上。在距離底板0. 5-1. 0 mm的位置上放宜梳 子，以便加入瓊脂糖后可以形成完好的加樣孔。如果梳子距禽玻璃板太近，則拔出梳子時(shí)孔 底

25、有破裂的危險(xiǎn)，最后導(dǎo)致樣品滲漏。2. 配制一左濃度的凝膠。在電泳緩沖液中加入瓊脂糖在沸水浴或微波爐中將懸浮液 加熱至瓊脂糖溶解。3使溶液冷卻至60C,加入浪化乙錠（終濃度0.5 ug/mL）,迅速充分混勻后倒入 膠膜中。檢査一下梳子的齒下或齒間是否有氣泡。4在凝膠完全凝固后，小心移去梳子和膠帶，將凝膠放入電泳槽中。5. 在電泳槽中加入沒過膠面1 mm以上的足夠的電泳緩沖液（0. 5XTBE）o（二）點(diǎn)樣與電泳1. DNA樣品與加樣緩沖液混合后，用微量取液器一次加入樣品槽中。一般DA樣品最 好控制在0.5：L0 ug之間。2. 加完所有樣品后，蓋上電泳槽蓋并通電，使DNA向陽極移動(dòng)匚采用一宦電壓

26、（按照 兩極間距離汁算，2-4V/cm）,幾分鐘后，浪酚藍(lán)從加樣孔中移出。繼續(xù)電泳，直至浪酚藍(lán) 在凝膠中遷移出適當(dāng)?shù)木嚯x。3. 切斷電流.打開槽蓋，在紫外燈下檢査凝膠。 丿I、實(shí)驗(yàn)作業(yè)1.圖示電泳檢測(cè)結(jié)果并分析。九、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求包括實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、 結(jié)果分析及思考題。實(shí)驗(yàn)七 同功酶遺傳標(biāo)記分析一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)；2.同工酶遺傳標(biāo)記的分析。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 本實(shí)驗(yàn)涉及同工酶槪念，遺傳標(biāo)記知識(shí)，鯽魚解剖及組織提取、和蛋白垂 直電泳分離檢驗(yàn)方法。三. 實(shí)驗(yàn)要求 釆用集中授課、學(xué)生自主訓(xùn)練并重的模式組織教學(xué)。四. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 學(xué)生需要蛋白質(zhì)

27、結(jié)構(gòu)知識(shí)以及酶反應(yīng)相關(guān)知識(shí)。五. 實(shí)驗(yàn)原理.方法和手段同工酶是一類由具有不同分子結(jié)構(gòu)和大小但具有相同催化功能的酶。同工酶分子的多種 形式是由基因決左的，也即同工酶是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物。由同一基因座的不同等位基因編 碼的各種同工爾又稱為等位酶，它們從分子水平上反映了等位基因的相對(duì)差異。因此，同工 酶不僅是一種生理生化指標(biāo)，而且也是一種可靠的遺傳標(biāo)記。在同工酶分析和鑒上中，電泳法是最為廣泛應(yīng)用.它能簡(jiǎn)便.快捷地分離某類酶的各同 工酶組分，而不破壞酶的活力。電泳的支持介質(zhì)一一聚丙烯酰胺是目前最常用的。是由丙烯 酰胺（acrylamide）單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（bisacrylamide）在催化

28、劑的作用卜聚 合成含酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈，相鄰的兩個(gè)鏈通過甲叉橋交鏈起來，鏈縱橫交錯(cuò)，形成三 維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。丙烯酰胺的單體和雙體的聚合有兩種類型，一種是化學(xué)聚合，常采用過硫酸胺 四甲基乙二胺（TEMED）催化系統(tǒng)。過硫酸胺是引發(fā)基團(tuán)，供給游離氧基，TEMED是催 化加速劑。另一種是光照聚合，常采用核黃素一一TEHED催化系統(tǒng)。核黃素在光下形成無色 基，TEHED放氧再氧化，產(chǎn)生自由基，從而引發(fā)聚合作用。制備丙烯酰胺凝膠時(shí)其凝膠的孔 徑由凝膠濃度決左。當(dāng)采用垂直平板不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳體系時(shí)，一般上層是大孔徑 的濃縮膠（pH 6.7）,下層為小孔徑的分離膠（pH 8.9）,電泳緩沖液為Tri

29、s-甘氨酸緩 沖液（pH&3） 0在這種不連續(xù)系統(tǒng)里，存在著電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)。蛋白質(zhì) （酶）按英電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)而被分離在凝膠的不同位置上。用此凝膠板與爾反應(yīng)底物 進(jìn)行催化反應(yīng)，再用生物染料染色便形成肉眼可見的各種酶帶。COOHHOCH+ NAD+I CH3LDH COOHpH7. 4-7. Bv上 C 二0 + NADH 十 HpH8. 8-9. 8CH3圖7-1乳酸脫氫酶催化的反應(yīng)乳酸脫氫酸（lactate dehydrogenase LDH）同工酶催化生物體內(nèi)丙酮酸與乳酸之間的 相互轉(zhuǎn)化，是參與糖酵解途徑的關(guān)鍵性酶，它在機(jī)體中的基本功能是調(diào)肖$AD+（煙酰胺腺 噪吟二核

30、苜酸，氧化型輔酶I）和NADH （煙酰胺腺瞟吟二核昔酸磷酸，還原型輔酶I）的比 率（圖7-1），從而對(duì)細(xì)胞的一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)起調(diào)控作用。不同樣品間譜帶的差異， 反映了基因產(chǎn)物的差異。六. 實(shí)驗(yàn)條件（-）材料鯽魚（市售）。（二）實(shí)驗(yàn)儀器及用具直流穩(wěn)壓電泳儀（VIAII型）,垂直平板電泳槽及附件，磨口梨形真空抽氣瓶，20 mL 玻璃勻漿器，微量進(jìn)樣槍，藹心機(jī)（3500 rpm），吸管，燒杯等。（三）藥品和試劑A、凝膠組成液：1. 30%凝膠貯液：取30g丙烯酰胺、0.8 g甲叉雙丙烯酰胺，加水立容至100mb過濾 后至棕色瓶中，于4C保存?zhèn)溆茫?. N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）,避光

31、保存：3. 10%過硫酸彼（APS）溶液：取lg過硫酸彼溶解后，泄容至10mL （現(xiàn)配現(xiàn)用）：4分離膠緩沖液（1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.8）:取18. 15 g三羥甲基氨基 甲烷（Tris）溶解后，加6 mol/L HC1溶液4 mL,調(diào)pH至8.8,定容至100 mL：5.濃縮膠緩沖液（05 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH6. 8）：取6 g Tris溶解后，加6 mol/L HC1溶液8 mL,調(diào)pH至6.8,定容至100 mL：B、電極緩沖液（0. 05 mol/L Tris, 0. 384 mol/L 甘氨酸,pH二8.3）：取6 g Tris. 2

32、8.8 g甘氨酸加水溶解后，調(diào)pH至83,左容至1000 mL：C、樣品勻漿液：100 mL 0.1 H磷酸緩沖液（pH7.2 ）,加入20$的蔗糖攪拌混勻后，加入1-2滴兢基圖7-2乳酸脫氫酶顯色反應(yīng)D、染色液：1 M dl-乳酸鈉溶液（pH=7.0） 5 mL, pH8. 0 Tris-HCl 緩沖液 10 mL,蒸館冰 35 mL, NBT （氯化氮藍(lán)四哇）15 mg, PMS （吩嗪硫酸甲酯）1 mg, NAD 25 mg,溶解后即為染液。顯 色原理及反應(yīng)如圖7-2o七. 實(shí)驗(yàn)步驟（-）樣品制備將鯽魚解剖，取其腎、腦.心放于培養(yǎng)皿上稱重，在低溫下按1 ：6加入緩沖液樣品進(jìn) 行組織勻漿，

33、宜于4C冰箱中靜置沉淀。4C下10000 rpm離心20分鐘，取上淸液為樣品。（二）電泳1. 配膠根據(jù)所測(cè)上的蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的范帀，選擇適宜的分離膠。本實(shí)驗(yàn)分離膠濃度選用 8汕濃縮膠濃度選用4虬 按表7-1進(jìn)行配制。2. 凝膠的灌制分離膠的配制：將已裝好的垂直板制膠玻璃板模具（1 mm厚）傾斜45 ,小心傾入配 制好的混勻的分離膠，至適當(dāng)?shù)捏{度后，用微量注射器沿玻璃板內(nèi)壁緩慢注入1 cm左右的 蒸佛水進(jìn)行水封。水封的目的是隔絕空氣中的氧，并消除凝膠表面的彎月面，使凝膠頂部的 表面平坦。室溫靜置凝膠液進(jìn)行聚合反應(yīng)，凝膠與水的界而由清晰到逐漸消失，0. 5-lh后 聚合反應(yīng)完成，水膠界而重新淸晰

34、出現(xiàn)，再靜置30min使聚合完全，傾岀凝膠層上方的水;濃縮膠的配制：分離膠聚合好后，除去水層，并用濾紙吸干。然后用凝膠液漂洗一下分 離膠頂部，去除漂洗膠液后，按同樣的方法加入濃縮膠05-10 cm,排除氣泡，快速插入 樣品槽模板梳子，靜垃聚合約60min待凝膠聚合后取下樣品刷，安裝到電泳槽上：表7-1聚丙烯酰胺凝膠電泳所需溶液及其配比試劑8%分離膠用量 （20 mL）4%濃縮膠用疑（10 mL）凝膠貯液（mL）5.31.3分離膠緩沖液（mL）14.5濃縮膠緩沖液（mL）1.3TEMED ( uL)2515水(mL)6. 3410%AP 溶液(uL)75503.加樣排除加樣孔內(nèi)氣泡，用微量加樣器

35、按編號(hào)向加樣孔中加入酶液樣品，加樣體積為16 AL, 然后用注射器向加樣孔加入電極緩沖液至滿，以防止電泳時(shí)鄰近孔中酶液的擴(kuò)散：4. 電泳將電泳槽一端稍傾斜（以排除電泳槽底部與電極緩沖液之間的氣泡），輕輕放入盛有 500 mL的電泳緩沖液的緩沖液槽中，電泳槽的底部要與電極液相連，且不留氣泡。然后， 在上部緩沖液槽中加入約500 mL電泳緩沖液。插入電源接頭，正極在下，負(fù)極在上。恒壓 110 V電泳至樣品進(jìn)入分離膠后，再恒壓200 V電泳大約3h后。5. 染色.脫色電泳結(jié)束后，移去玻璃板.取出凝膠平板，將凝膠浸沒于染色液中.37C保溫染色約 0. 5h,然后取岀用蒸懈水沖洗，條帶淸晰后照相，最后制

36、版保存或放入固左液中保存。八、實(shí)驗(yàn)作業(yè)1繪岀務(wù)種樣品中同工酶譜，并說明酶譜差異。九、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求包括實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、 結(jié)果分析及思考題。實(shí)驗(yàn)八人類ABO血型測(cè)定與群體分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 學(xué)習(xí)辨別血型的方法。2. 觀察紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，掌握ABO血型鑒定的原理。3. 推測(cè)個(gè)自的基因型，并能對(duì)群體是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡泄律進(jìn)行檢驗(yàn)。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容本實(shí)驗(yàn)涉及ABO血型，復(fù)等位基因間的互作，群體遺傳，卡平方檢驗(yàn)。三、實(shí)驗(yàn)要求采用集中授課、學(xué)生自主訓(xùn)練并重的模式組織教學(xué)。四、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備學(xué)生需要復(fù)習(xí)ABO血型系統(tǒng)，等位基因間的互作，卡平方檢驗(yàn)，預(yù)

37、習(xí)群體遺傳學(xué)等方而 的內(nèi)容。五、實(shí)驗(yàn)原理、方法和手段血型是指紅細(xì)胞的血型，是根據(jù)紅細(xì)胞膜外表而存在的特異性抗原（鑲嵌于紅細(xì)胞膜上 的糖蛋白和糖脂）來確左的，這種抗原或凝集原是由遺傳決定的?？贵w或凝集素存在于血淸 中，它與紅細(xì)胞的不同抗原起反應(yīng)，產(chǎn)生凝集，最后溶解。人類ABO血型抗原就是是根據(jù)紅細(xì)胞膜上有無特異性抗原（凝集原）A或B來劃分的血 液類型系統(tǒng)，將血型分為A型、B型、AB型、0型四種。ABO血型系統(tǒng)是1900年奧地利蘭茨 泰納發(fā)現(xiàn)和確左的人類第一個(gè)血型系統(tǒng)。所謂A型指紅細(xì)胞膜上存在A抗原，其血淸中存在 抗B抗體（凝集素），B型指紅細(xì)胞膜上存在B抗原，其血淸中存在抗A抗體，AB型指紅細(xì)

38、胞膜上存在A和B抗原，其血清中沒有抗A或抗B抗體，0型則紅細(xì)胞膜上沒有A和B抗原, 血淸中同時(shí)存在抗A抗B抗體。具有A抗原的紅細(xì)胞可被抗A抗體凝集；抗B抗體可使含B 抗原的紅細(xì)胞發(fā)生凝集。輸血時(shí)若血型不合會(huì)使紅細(xì)胞發(fā)生凝集，引起血管阻塞和溶血反應(yīng), 造成嚴(yán)重后果。所以在輸血前必須做血型鑒定。血型鑒泄可用紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，通過正、反左型準(zhǔn)確確NABO血型。所謂正立型：即血 淸試驗(yàn)，用已知抗A、抗B分型血淸來確泄紅細(xì)胞上有無相應(yīng)的A抗原和B抗原：所謂反左 型：即細(xì)胞試驗(yàn)，是用已知A細(xì)胞和B細(xì)胞來測(cè)左血淸中有無相應(yīng)的抗A或抗B。ABO血型鑒定診斷血淸+待測(cè)者紅細(xì)胞受檢者血型待檢者血淸+診斷紅細(xì)胞抗A血清抗B血淸A紅細(xì)胞B紅細(xì)胞0紅細(xì)胞0+一+一A一+一+B+一+AB一哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg）法則是群體遺傳中最重要的原理，它解釋了繁殖如何 影響群體的基因和基因型頻率。這個(gè)法則是用Hardy,G.H （英國數(shù)學(xué)家）和Weinberg, W.（徳國醫(yī)生）兩位學(xué)者的姓來命名的，他們于同一年（1908年）各自發(fā)現(xiàn)了這一法則。他 們提岀在一個(gè)不發(fā)生突變、遷移和選擇的無限大的