_水中總大腸菌群的測定—多管發(fā)酵法

1、水中總大腸菌群的測定 多管發(fā)酵法一原理總大腸菌群可用多管發(fā)酵法或?yàn)V膜法檢驗(yàn)。多管發(fā)酵法的原理是 根據(jù)大腸菌群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，以及具備革蘭氏染色陰性， 無芽孢， 呈桿狀等有關(guān)特性， 通過三個(gè)步驟進(jìn)行檢驗(yàn)求得水樣中的總 大腸菌群數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果以最可能數(shù)(most probable numbe),簡稱MPN 表示。三儀器(1) 高壓蒸氣滅菌器。(2) 恒溫培養(yǎng)箱、冰箱。(3) 生物顯微鏡、載玻片。(4) 酒精燈、 3mm 接種環(huán)。(5) 培養(yǎng)皿(直徑 100mm)、試管(5 x150mm),吸管(1、5、10mL)、 燒杯(200、500、2000mL)、錐形瓶(500、1000mL )、采樣

2、瓶、移 液槍。四培養(yǎng)基及染色劑的制備1. 乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：將10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g 氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液pH為7.27.4,再 加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混勻，分裝于試管中，于121C 高壓滅菌器中滅菌15min，貯存于冷暗處備用。2. 三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的制 備方法配制。除蒸餾水外,各組份用量增加至三倍。3伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基： 貯備培養(yǎng)基的制備：于 2000mL燒杯中，先將20g瓊脂加到 900mL 蒸餾水中，加熱溶解。再加 2.0g 鄰酸二氫鉀及 10g 蛋白胨， 混合使之溶解，用蒸餾水補(bǔ)充至1000mL

3、,調(diào)節(jié)溶液pH值為7.27.4。 趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加入 10g 乳糖，混勻后定量分裝于 250mL或500mL錐形瓶內(nèi)，于121C高壓滅菌15min,貯于冷暗處備 用。 平皿培養(yǎng)基的制備：將上述制備的貯備培養(yǎng)基融化。根據(jù)錐形 瓶內(nèi)培養(yǎng)基的容量，用滅菌吸管按比例分別吸取一定量已滅菌的 2% 伊紅水溶液（ 0.4g 伊紅溶于 20mL 水中）和一定量已滅菌的 0.5%美 藍(lán)水溶液（ 0.065g 美藍(lán)溶于 13mL 水中），加入已融化的貯備培養(yǎng)基 內(nèi)，并充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡） ，立即將此培養(yǎng)基適量傾入已滅菌 的空平皿內(nèi)，待冷卻凝固后，置于冰箱內(nèi)備用。4革蘭氏染色劑： 結(jié)晶紫染色液：將2

4、0mL結(jié)晶紫乙醇飽和溶液（稱取 48g結(jié) 晶紫溶于100mL95%乙醇中）和80mL 1%草酸銨溶液混合、過濾。該 溶液放置過久會產(chǎn)生沉淀，不能再用。 助染劑：將1g碘與2g碘化鉀混合后，加入少許蒸餾水，充分 振蕩，待完全溶解后，用蒸餾水補(bǔ)充至 300mL。此溶液兩周內(nèi)有效。 當(dāng)溶液由棕黃色變?yōu)榈S色時(shí)應(yīng)棄去。 為易于貯備， 可將上述碘與碘 化鉀溶于 30mL 蒸餾水中，臨用前再加水稀釋。 脫色劑： 95%乙醇 復(fù)染劑：將0.25g沙黃加到10mL95%乙醇中，待完全溶解后， 加 90mL 蒸餾水。五測定步驟水源水 于各裝有 5mL 三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的 5 個(gè)試管中（內(nèi)有 倒管），分別

5、加入10mL水樣；于各裝有10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5 個(gè)試管中（內(nèi)有倒管），分別加入 1mL 水樣；再于各裝有 10mL 乳糖 蛋白胨培養(yǎng)液的5個(gè)試管中（內(nèi)有倒管）分別加入1mL 1 : 10稀釋的 水樣。共計(jì)15管，三個(gè)稀釋度。將各管充分混勻，置于 37 C恒溫箱 內(nèi)培養(yǎng) 24h。 平板分離：上述各發(fā)酵管經(jīng)培養(yǎng) 24h后，將產(chǎn)酸、產(chǎn)氣及只產(chǎn) 酸的發(fā)酵管分別接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基培養(yǎng)基上，置于 37C恒溫箱 內(nèi)培養(yǎng)24h，挑選符合下列特征的菌落：a. 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色， 不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紫紅色，中心色較深的菌落。 取上述特征的群落進(jìn)行革蘭氏染色

6、：a. 用以培養(yǎng)1824h的培養(yǎng)物涂片，涂層要薄；b. 將涂片在火焰上加溫固定，待冷卻后滴加結(jié)晶紫溶液，1min 后用水洗去；c. 滴加助色劑，1min后用水洗去；d. 滴加脫色劑，搖動(dòng)玻片，直止無紫色脫落為止（約 2030s）, 用水洗去；e. 滴加復(fù)染劑，1min后用水洗去，晾干、鏡檢，呈紫色者為革 蘭氏陽性菌，呈紅色者為陰性菌。 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)：上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿 菌，則挑選該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液 的試管中（內(nèi)有倒管） ，每管可接種分離自同一初發(fā)酵管（瓶）的最 典型菌落13個(gè)，然后置于37C恒溫箱中培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣 者（不論倒管內(nèi)氣

7、體多少皆作為產(chǎn)氣論） ，即證實(shí)有大腸菌群存在。 根據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數(shù)查附表1“大腸菌群檢數(shù)表”，報(bào)告每升水樣中的大腸菌群數(shù)。結(jié)果與分析：初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)10ml原水+5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：5管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象1ml原水+10ml普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：2管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn) 象， 1 管有產(chǎn)酸現(xiàn)象1ml1: 10稀釋水樣+10ml普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：1管有產(chǎn) 酸產(chǎn)氣現(xiàn)象復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：10ml原水+5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：5管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象 1ml原水+10ml普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：2管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象 1ml1： 10稀釋水樣+10ml普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：1

8、管有產(chǎn) 酸產(chǎn)氣現(xiàn)象結(jié)論：從最可能數(shù)（MPN ）表中查檢驗(yàn)結(jié)果521,得知100mL 水樣中的總大腸菌群數(shù)為 70個(gè)，故1L水樣中的總大腸菌群數(shù)為 70X10=700 個(gè)。對污染嚴(yán)重的地表水和廢水，初發(fā)酵試驗(yàn)的接種水樣應(yīng)做1 ： 10、1 ： 100、1 : 1000或更高倍數(shù)的稀釋，檢驗(yàn)步驟同 水源水”檢驗(yàn)方法。如果接種的水樣量不是10mL、1mL和0.1mL,而是較低或較高 的三個(gè)濃度的水樣量，也可查表求得 MPN指數(shù)，再經(jīng)下面公式換算 成每100mL的MPN值：附表1大腸菌群檢數(shù)表接種水樣總量300mL（ 100mL2份，10mL10份）10mL水量的陽100mL水量的陽性瓶數(shù)性管數(shù)012

9、1L水樣中大腸菌群數(shù)1L水樣中大腸菌群數(shù)1L水樣中大腸菌群數(shù)0230附表2最可能數(shù)（MPN ）表（接種5份10mL水樣、5份1mL水樣、5份0.1mL水樣時(shí)，不同陽性及陰性情況下100mL水樣中細(xì)菌數(shù)的最可能數(shù)和95%可信限值）出現(xiàn)陽性份數(shù)每95%可出現(xiàn)陽性份數(shù)每95%可信100m信限值100m限值10m10.1L水下上10m10.1L水下上L管mm樣中限限L管mm樣中限限LL細(xì)菌LL細(xì)菌管管數(shù)的管管數(shù)的最可最可能數(shù)能數(shù)00020.72017117001257210711701020.112119221020457220922110020.11230123281014515300811911040.153011122511165153101122512060.13311144342005546320144343