真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式

1、真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式大腸桿菌被內(nèi)膜和外膜隔成 3 個(gè)腔：胞內(nèi)、周質(zhì)和胞外，表達(dá)的蛋白定位于這 3 個(gè)腔 內(nèi)。真核基因在大腸桿菌的表達(dá)形式根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的定位一般可分為兩類：胞內(nèi)表達(dá)和蛋 白分泌表達(dá)。胞內(nèi)表達(dá)是最主要的表達(dá)形式，表達(dá)產(chǎn)物以可溶性蛋白和 / 或不溶性的包涵體 形式存在于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。而根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物本身的性質(zhì)又分為融合表達(dá)和非融合表達(dá)。一、胞內(nèi)表達(dá)1、非融合表達(dá)非融合表達(dá)即直接表達(dá)天然蛋白， 所表達(dá)的真核生物蛋白肽鏈的 N端不含有任何原核肽 段。真核基因通常缺乏能被原核生物的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)識(shí)別的序列，包括啟動(dòng)子、有效地 核糖體結(jié)合位點(diǎn)，有時(shí)還缺乏 ATG起始密碼子和轉(zhuǎn)錄終止

2、子，因此必須插入帶有這些調(diào)控 序列的表達(dá)載體方能表達(dá)。有時(shí)，非融合表達(dá)不能產(chǎn)生目的蛋白，尤其是目的蛋白的氨基酸含有甲硫氨酸時(shí)。由 于甲硫氨酸是由 ATG編碼的，在大腸桿菌中，氨基端的甲硫氨酸會(huì)被不同程度地去除。此 外，非融合蛋白易被宿主蛋白酶破壞，產(chǎn)生無(wú)活性的蛋白，這是影響表達(dá)效率的重要因素。 克服的方法有：采用 Ion -營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主。大腸桿菌蛋白酶的合成主要依賴于黃嘌呤核 苷（ Ion ），用 Ion -宿主，使蛋白酶不能合成，從而保護(hù)真核蛋白；克隆 Pin 基因。T4 噬 菌體 Pin 基因產(chǎn)物為細(xì)菌蛋白酶抑制劑，將 Pin 基因克隆到質(zhì)粒上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，可 保護(hù)真核蛋白。2、融合

3、表達(dá)融合表達(dá)即表達(dá)的真核蛋白肽鏈 N 端含原核生物肽段，融合表達(dá)的方法是將真核基因 插入啟動(dòng)子后已證實(shí)能高效表達(dá)的原核結(jié)構(gòu)基因的下游，以產(chǎn)生融合蛋白的方式表達(dá)目的 基因。由于融合基因 5 端為表達(dá)載體中的原核基因序列，已優(yōu)化的翻譯起始區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu) 不受插入外源基因的干擾，因此，融合表達(dá)的效率高。需要注意的是，插入基因的轉(zhuǎn)錄方 向和閱讀框架必須與原核片段的閱讀框架相吻合，不能產(chǎn)生移碼，否則不能表達(dá)。融合蛋白需經(jīng)處理后方能釋放出真核蛋白， 常用的后處理方法有溴化氰和蛋白酶裂解， 這就要求融合蛋白在其原核肽段與目的蛋白間應(yīng)含有能被溴化氰和蛋白酶裂解的序列，而 且目的蛋白內(nèi)部不能含有溴化氰和蛋白酶切割

4、位點(diǎn)。溴化氰能切割蛋氨酸殘基后的肽鍵； 牛凝血因子 X 用 Russel 蝰蛇毒液活化成因子 Xa 后，能在四肽序列 Ile-Glu-Gly-Arg 中的精 氨酸（ Arg）后特異地切割肽鏈；凝血酶（ thrombin ）也能識(shí)別和切割特定的肽序列，這些 識(shí)別序列通常都已構(gòu)建于融合表達(dá)載體中。 融合表達(dá)有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)： 由于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始由正常的大腸桿菌序列調(diào)控，因此融合蛋白通常得到高效表 達(dá)； 真核基因與大腸桿菌基因的融合產(chǎn)物比天然真核蛋白更穩(wěn)定； 表達(dá)蛋白的純化較為困難，但與特定的原核蛋白融合后，可以利用識(shí)別原核肽段的 配體進(jìn)行親和層析純化。將真核基因與谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶 ( glutat

5、hione-S-transferase,GST )基因融合，表達(dá)的融合蛋白可用谷胱甘肽親 和柱純化。蛋白 A(protein A)是金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上的一種蛋白成分，能與 免疫球蛋白 IgG 結(jié)合，將目的基因與蛋白 A基因融合，產(chǎn)生的融合蛋白可以用偶聯(lián) 有 IgG 的瓊脂糖親和層析柱純化。目前許多融合表達(dá)載體已商品化，并且廠家提供 的產(chǎn)品中通常有針對(duì)融合蛋白的原核肽段的親和層析柱， 這樣可以方便地純化得到 融合蛋白； 許多蛋白與原核蛋白融合后，能保留原有的免疫原性，而一些免疫原性弱的多肽制 成融合蛋白后， 其免疫原性能得到加強(qiáng)， 如谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶具有較強(qiáng)的免疫原性， 可增強(qiáng)與之融合的蛋白

6、的免疫原性， 因此，可以用融合蛋白制備抗真核蛋白的抗體。因此，當(dāng)試驗(yàn)了很多條件還不能使外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)，融合表達(dá)可能 是最佳的選擇，因?yàn)檩d體中啟動(dòng)子下游已有的基因(或部分基因序列)往往是能高效表達(dá) 的，當(dāng)外源基因與其融合后，該已有的基因?qū)?dòng)下游的外源基因獲得高效表達(dá)，而且表 達(dá)產(chǎn)物較穩(wěn)定，不易被宿主降解。若要獲得天然產(chǎn)物，可通過(guò)合適的蛋白酶或化學(xué)切割融 合蛋白來(lái)達(dá)到目的。二、蛋白分泌型表達(dá) 蛋白分泌型表達(dá)根據(jù)表達(dá)場(chǎng)所的不同分為周質(zhì)分泌表達(dá)和胞外分泌表達(dá)。1、周質(zhì)分泌表達(dá) 是通過(guò)將外源基因融合到編碼原核蛋白的信號(hào)肽序列的下游而實(shí)現(xiàn)，當(dāng)?shù)鞍追置诘轿挥诖竽c桿菌細(xì)胞內(nèi)膜與細(xì)胞外膜之間的

7、周質(zhì)時(shí)，信號(hào)肽可被信號(hào)肽酶所切割，而獲得具有 天然一級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。信號(hào)肽通常由 1530 個(gè)氨基酸殘基組成，在 N端以帶正電荷的賴氨 酸和精氨酸為特征，隨后是一段以順?biāo)被釣橹鞯碾亩危徑懈钗稽c(diǎn)常有幾個(gè)側(cè)鏈較 短的氨基酸如甘氨酸、丙氨酸。帶正電荷的 N 端有助于新生肽段與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合，疏水肽 段能形成 -螺旋，在信號(hào)肽序列之后的一段氨基酸殘基也能形成 -螺旋，兩段 -螺旋以 反平行方式組合成發(fā)夾結(jié)構(gòu)后，容易進(jìn)入內(nèi)膜的雙脂層。鄰近切割位點(diǎn)的氨基酸傾向于形 成 -折疊，這可能是信號(hào)肽酶識(shí)別的結(jié)構(gòu)。當(dāng)然，信號(hào)肽后的氨基酸對(duì)穿膜及隨后的切割 也有影響。原核生物的脂蛋白、外膜蛋白 ompA和堿性磷酸

8、酶 phoA 的信號(hào)肽序列常用于構(gòu) 建周質(zhì)分泌型表達(dá)載體。周質(zhì)分泌表達(dá)有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)： 分泌后的蛋白產(chǎn)物不含氨基端甲硫氨酸； 原核生物細(xì)胞質(zhì)中的還原環(huán)境不利于蛋白二硫鍵的形成， 而氧化性的周質(zhì)間隙可以 模擬真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境，便于新生肽鏈折疊成天然結(jié)構(gòu)，從而獲得安全生物活 性的重組蛋白； 一些可被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶所降解的蛋白在外周質(zhì)中穩(wěn)定性提高。 周質(zhì)分泌亦存在一些問(wèn)題，如一些含有較長(zhǎng)疏水肽段的蛋白在穿膜時(shí)有可能滯留在質(zhì) 膜上，信號(hào)肽不被切割或不在特異位置切割，表達(dá)量低，僅占細(xì)菌總蛋白的%4%等。解決的途徑有： 在信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)兩側(cè)進(jìn)行點(diǎn)突變，使之形成穿膜所需的結(jié)構(gòu)，這種點(diǎn)突變最好 在信號(hào)肽中

9、進(jìn)行，避免改變目的蛋白的氨基酸序列； 信號(hào)肽下游一定間隔處融合目的蛋白； 試用不同種類的信號(hào)肽與目的蛋白融合。2、胞外分泌表達(dá) 重組蛋白分泌到胞外可以使二硫鍵正確折疊，避免蛋白在胞內(nèi)聚集，形成包涵體，而 且還可以使重組蛋白的下游純化較為簡(jiǎn)單，便于大規(guī)模放大處理。目前，使異源蛋白分泌 到培養(yǎng)基的系統(tǒng)主要有- 溶血素(haemolysinA,HlyA) 系統(tǒng)和細(xì)菌素釋放蛋白 (bacteriocin release protein,BRP)系統(tǒng)。 HlyA 系統(tǒng)是將真核基因融合在 HlyA 的 N端，利用 HlyA 能直接從胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外的特點(diǎn)，將重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中。有人將胰島素原 基因融合到

10、金葡菌蛋白 A 的基因上，構(gòu)建成大腸桿菌中基因融合的胞外分泌表達(dá)載體，它 能高效表達(dá)且有效地分泌表達(dá)產(chǎn)物，利用親和層析能方便地從培養(yǎng)基中分離出融合蛋白。 融合蛋白經(jīng)溴化氰裂解后，經(jīng)反相 HPLC分析，分離得到具有天然結(jié)構(gòu)的胰島素原。表達(dá)蛋白的提取和純化、提取胞內(nèi)表達(dá)是原核表達(dá)的主要方式，當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物多以可溶性蛋白的形式存在于菌體細(xì)胞 內(nèi)時(shí)，破碎菌體細(xì)胞后從裂解液的上清液中即可得到目的蛋白。但蛋白在大腸桿菌中高水 平表達(dá)時(shí)，常形成包涵體，這是蛋白在胞內(nèi)互相凝集而形成的無(wú)活性固體顆粒，具有很強(qiáng) 的折光性。形成包涵體的原因有：目的基因的過(guò)度表達(dá)，使蛋白無(wú)足夠時(shí)間進(jìn)行肽鏈折疊， 產(chǎn)生凝集；各種原因引起的

11、蛋白不能正確折疊；蛋白的性質(zhì)和穩(wěn)定、 pH 值等環(huán)境條件的影 響等。為了獲得可溶性的活性蛋白，必須從細(xì)胞裂解液中分離包涵體，將其溶解后進(jìn)行重 新折疊。1、包涵體的分離 為了獲得包涵體，常采用機(jī)械破碎菌體，也可加溶菌酶超聲破菌， 菌體破碎后，經(jīng)洗滌、離心分離，即得包涵體。2、包涵體的溶解 通常采用變性劑。對(duì)絕大多數(shù)包涵體而言，在條件下， 68mol/L 尿素或 58mol/L 鹽酸胍即可將其溶解。另外，去垢劑、有機(jī)溶劑、堿性環(huán)境 (pH也可使包 涵體溶解。如果包涵體中蛋白含 2 個(gè)以上二硫鍵，則還需要加入還原劑如 2-巰基乙醇或 2- 巰基蘇糖醇等，使二硫鍵處于可逆斷裂狀態(tài)。3、重組蛋白的復(fù)性

12、包涵體溶解后，結(jié)合的蛋白互相分離，呈變性狀態(tài)，即所有的氫 鍵、疏水鍵全被破壞，但一級(jí)結(jié)構(gòu)保持完好，因此去除變性劑時(shí)，一部分蛋白可自動(dòng)折疊 成具有活性的正確構(gòu)型，這一過(guò)程即復(fù)性。目前復(fù)性方法主要有稀釋法、透析法和層析法 (或超濾)。對(duì)于具有二硫鍵的重組蛋白，復(fù)性時(shí)還涉及到二硫鍵的正確形成。一般空氣中 的氧即可使還原型半胱氨酸殘基形成二硫鍵，也可加入微量硫化物如 2- 巰基乙醇、氧化型 或還原型谷胱甘肽，以促進(jìn)正確二硫鍵的形成。今年來(lái)對(duì)蛋白折疊理論的研究認(rèn)為， 許多蛋白的天然構(gòu)象并不是自發(fā)的一步折疊而成， 而是在一些輔助蛋白的協(xié)助下經(jīng)許多中間態(tài)逐步形成的。包涵體的形成，是由于肽鏈折疊 過(guò)程中部分折

13、疊的中間態(tài)之間的特異性錯(cuò)誤聚合，而不是形成成熟的天然態(tài)或完全解鏈的 蛋白。為克服包涵體的形成，常用的策略是在表達(dá)目的蛋白的同時(shí)，共表達(dá)分子伴侶 (chaperones) 和折疊群。 分子伴侶是細(xì)胞內(nèi)催化及維持其他蛋白正確構(gòu)象的一類蛋白分子， 它們識(shí)別、結(jié)合和穩(wěn)定部分折疊的蛋白中間體，避免不適當(dāng)?shù)姆肿娱g及分子內(nèi)作用，但不 催化二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。大腸桿菌的分子伴侶有 GroES/GroEL、Dnak/DnaJ、SecB、PapD等。 與分子伴侶不同，折疊酶具有催化異構(gòu)作用，限制蛋白變性速率。氧化還原酶DsbB及肽脯 氨酰異構(gòu)酶 (PPlase) 催化大腸桿菌中 x-pro 肽鍵的異構(gòu)反應(yīng)。非受體蛋白

14、酪氨酸激酶在大 腸桿菌中多形成包涵體，將酪氨酸激酶與 GroES、GroEL、Dnak、DnaJ、GrpE 等共表達(dá)，得 到了可溶蛋白。二、純化目前重組蛋白的純化方法主要是色譜法，如離子交換層析、疏水作用層析、凝膠過(guò)濾 層析、親和層析等，近年來(lái)出現(xiàn)的徑向色譜分離、灌注層析、旋轉(zhuǎn)等電聚集電泳及反膠團(tuán) 分離等技術(shù)也得到了廣泛應(yīng)用。純化過(guò)程中，合理的色譜分離次序也很重要。 ；例如，用鹽 酸胍溶解的包涵體不能首先使用離子交換層析；用 SDS溶解的包涵體第一步分離僅限于凝 膠過(guò)濾層析；用尿素溶解的包涵體則有多種選擇。此外，分離純化所用的緩沖液的各種參 數(shù)，如 pH值、溫度、離子強(qiáng)度等對(duì)生物活性的影響不易確定，一次分離純化操作帶有很大 的經(jīng)驗(yàn)成分。三、檢測(cè)真核基因在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)方法有以下 3 種：1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 用于確定所表達(dá)的目的蛋白是否存在以及蛋 白的相對(duì)分子量和純度。2、Western b