真核基因在大腸桿菌中的表達形式

1、真核基因在大腸桿菌中的表達形式大腸桿菌被內(nèi)膜和外膜隔成 3 個腔：胞內(nèi)、周質(zhì)和胞外，表達的蛋白定位于這 3 個腔 內(nèi)。真核基因在大腸桿菌的表達形式根據(jù)表達產(chǎn)物的定位一般可分為兩類：胞內(nèi)表達和蛋 白分泌表達。胞內(nèi)表達是最主要的表達形式，表達產(chǎn)物以可溶性蛋白和 / 或不溶性的包涵體 形式存在于大腸桿菌細胞內(nèi)。而根據(jù)表達產(chǎn)物本身的性質(zhì)又分為融合表達和非融合表達。一、胞內(nèi)表達1、非融合表達非融合表達即直接表達天然蛋白， 所表達的真核生物蛋白肽鏈的 N端不含有任何原核肽 段。真核基因通常缺乏能被原核生物的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)識別的序列，包括啟動子、有效地 核糖體結(jié)合位點，有時還缺乏 ATG起始密碼子和轉(zhuǎn)錄終止

2、子，因此必須插入帶有這些調(diào)控 序列的表達載體方能表達。有時，非融合表達不能產(chǎn)生目的蛋白，尤其是目的蛋白的氨基酸含有甲硫氨酸時。由 于甲硫氨酸是由 ATG編碼的，在大腸桿菌中，氨基端的甲硫氨酸會被不同程度地去除。此 外，非融合蛋白易被宿主蛋白酶破壞，產(chǎn)生無活性的蛋白，這是影響表達效率的重要因素。 克服的方法有：采用 Ion -營養(yǎng)缺陷型宿主。大腸桿菌蛋白酶的合成主要依賴于黃嘌呤核 苷（ Ion ），用 Ion -宿主，使蛋白酶不能合成，從而保護真核蛋白；克隆 Pin 基因。T4 噬 菌體 Pin 基因產(chǎn)物為細菌蛋白酶抑制劑，將 Pin 基因克隆到質(zhì)粒上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，可 保護真核蛋白。2、融合

3、表達融合表達即表達的真核蛋白肽鏈 N 端含原核生物肽段，融合表達的方法是將真核基因 插入啟動子后已證實能高效表達的原核結(jié)構(gòu)基因的下游，以產(chǎn)生融合蛋白的方式表達目的 基因。由于融合基因 5 端為表達載體中的原核基因序列，已優(yōu)化的翻譯起始區(qū)的二級結(jié)構(gòu) 不受插入外源基因的干擾，因此，融合表達的效率高。需要注意的是，插入基因的轉(zhuǎn)錄方 向和閱讀框架必須與原核片段的閱讀框架相吻合，不能產(chǎn)生移碼，否則不能表達。融合蛋白需經(jīng)處理后方能釋放出真核蛋白， 常用的后處理方法有溴化氰和蛋白酶裂解， 這就要求融合蛋白在其原核肽段與目的蛋白間應含有能被溴化氰和蛋白酶裂解的序列，而 且目的蛋白內(nèi)部不能含有溴化氰和蛋白酶切割

4、位點。溴化氰能切割蛋氨酸殘基后的肽鍵； 牛凝血因子 X 用 Russel 蝰蛇毒液活化成因子 Xa 后，能在四肽序列 Ile-Glu-Gly-Arg 中的精 氨酸（ Arg）后特異地切割肽鏈；凝血酶（ thrombin ）也能識別和切割特定的肽序列，這些 識別序列通常都已構(gòu)建于融合表達載體中。 融合表達有以下幾個優(yōu)點： 由于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始由正常的大腸桿菌序列調(diào)控，因此融合蛋白通常得到高效表 達； 真核基因與大腸桿菌基因的融合產(chǎn)物比天然真核蛋白更穩(wěn)定； 表達蛋白的純化較為困難，但與特定的原核蛋白融合后，可以利用識別原核肽段的 配體進行親和層析純化。將真核基因與谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶 ( glutat

5、hione-S-transferase,GST )基因融合，表達的融合蛋白可用谷胱甘肽親 和柱純化。蛋白 A(protein A)是金黃色葡萄球菌細胞壁上的一種蛋白成分，能與 免疫球蛋白 IgG 結(jié)合，將目的基因與蛋白 A基因融合，產(chǎn)生的融合蛋白可以用偶聯(lián) 有 IgG 的瓊脂糖親和層析柱純化。目前許多融合表達載體已商品化，并且廠家提供 的產(chǎn)品中通常有針對融合蛋白的原核肽段的親和層析柱， 這樣可以方便地純化得到 融合蛋白； 許多蛋白與原核蛋白融合后，能保留原有的免疫原性，而一些免疫原性弱的多肽制 成融合蛋白后， 其免疫原性能得到加強， 如谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶具有較強的免疫原性， 可增強與之融合的蛋白

6、的免疫原性， 因此，可以用融合蛋白制備抗真核蛋白的抗體。因此，當試驗了很多條件還不能使外源基因在大腸桿菌中高效表達時，融合表達可能 是最佳的選擇，因為載體中啟動子下游已有的基因(或部分基因序列)往往是能高效表達 的，當外源基因與其融合后，該已有的基因?qū)酉掠蔚耐庠椿颢@得高效表達，而且表 達產(chǎn)物較穩(wěn)定，不易被宿主降解。若要獲得天然產(chǎn)物，可通過合適的蛋白酶或化學切割融 合蛋白來達到目的。二、蛋白分泌型表達 蛋白分泌型表達根據(jù)表達場所的不同分為周質(zhì)分泌表達和胞外分泌表達。1、周質(zhì)分泌表達 是通過將外源基因融合到編碼原核蛋白的信號肽序列的下游而實現(xiàn)，當?shù)鞍追置诘轿挥诖竽c桿菌細胞內(nèi)膜與細胞外膜之間的

7、周質(zhì)時，信號肽可被信號肽酶所切割，而獲得具有 天然一級結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。信號肽通常由 1530 個氨基酸殘基組成，在 N端以帶正電荷的賴氨 酸和精氨酸為特征，隨后是一段以順水氨基酸為主的肽段，鄰近切割位點常有幾個側(cè)鏈較 短的氨基酸如甘氨酸、丙氨酸。帶正電荷的 N 端有助于新生肽段與細胞質(zhì)膜結(jié)合，疏水肽 段能形成 -螺旋，在信號肽序列之后的一段氨基酸殘基也能形成 -螺旋，兩段 -螺旋以 反平行方式組合成發(fā)夾結(jié)構(gòu)后，容易進入內(nèi)膜的雙脂層。鄰近切割位點的氨基酸傾向于形 成 -折疊，這可能是信號肽酶識別的結(jié)構(gòu)。當然，信號肽后的氨基酸對穿膜及隨后的切割 也有影響。原核生物的脂蛋白、外膜蛋白 ompA和堿性磷酸

8、酶 phoA 的信號肽序列常用于構(gòu) 建周質(zhì)分泌型表達載體。周質(zhì)分泌表達有以下幾個優(yōu)點： 分泌后的蛋白產(chǎn)物不含氨基端甲硫氨酸； 原核生物細胞質(zhì)中的還原環(huán)境不利于蛋白二硫鍵的形成， 而氧化性的周質(zhì)間隙可以 模擬真核細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境，便于新生肽鏈折疊成天然結(jié)構(gòu)，從而獲得安全生物活 性的重組蛋白； 一些可被細胞內(nèi)蛋白酶所降解的蛋白在外周質(zhì)中穩(wěn)定性提高。 周質(zhì)分泌亦存在一些問題，如一些含有較長疏水肽段的蛋白在穿膜時有可能滯留在質(zhì) 膜上，信號肽不被切割或不在特異位置切割，表達量低，僅占細菌總蛋白的%4%等。解決的途徑有： 在信號肽酶切割位點兩側(cè)進行點突變，使之形成穿膜所需的結(jié)構(gòu)，這種點突變最好 在信號肽中

9、進行，避免改變目的蛋白的氨基酸序列； 信號肽下游一定間隔處融合目的蛋白； 試用不同種類的信號肽與目的蛋白融合。2、胞外分泌表達 重組蛋白分泌到胞外可以使二硫鍵正確折疊，避免蛋白在胞內(nèi)聚集，形成包涵體，而 且還可以使重組蛋白的下游純化較為簡單，便于大規(guī)模放大處理。目前，使異源蛋白分泌 到培養(yǎng)基的系統(tǒng)主要有- 溶血素(haemolysinA,HlyA) 系統(tǒng)和細菌素釋放蛋白 (bacteriocin release protein,BRP)系統(tǒng)。 HlyA 系統(tǒng)是將真核基因融合在 HlyA 的 N端，利用 HlyA 能直接從胞內(nèi)轉(zhuǎn)運到胞外的特點，將重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中。有人將胰島素原 基因融合到

10、金葡菌蛋白 A 的基因上，構(gòu)建成大腸桿菌中基因融合的胞外分泌表達載體，它 能高效表達且有效地分泌表達產(chǎn)物，利用親和層析能方便地從培養(yǎng)基中分離出融合蛋白。 融合蛋白經(jīng)溴化氰裂解后，經(jīng)反相 HPLC分析，分離得到具有天然結(jié)構(gòu)的胰島素原。表達蛋白的提取和純化、提取胞內(nèi)表達是原核表達的主要方式，當表達產(chǎn)物多以可溶性蛋白的形式存在于菌體細胞 內(nèi)時，破碎菌體細胞后從裂解液的上清液中即可得到目的蛋白。但蛋白在大腸桿菌中高水 平表達時，常形成包涵體，這是蛋白在胞內(nèi)互相凝集而形成的無活性固體顆粒，具有很強 的折光性。形成包涵體的原因有：目的基因的過度表達，使蛋白無足夠時間進行肽鏈折疊， 產(chǎn)生凝集；各種原因引起的

11、蛋白不能正確折疊；蛋白的性質(zhì)和穩(wěn)定、 pH 值等環(huán)境條件的影 響等。為了獲得可溶性的活性蛋白，必須從細胞裂解液中分離包涵體，將其溶解后進行重 新折疊。1、包涵體的分離 為了獲得包涵體，常采用機械破碎菌體，也可加溶菌酶超聲破菌， 菌體破碎后，經(jīng)洗滌、離心分離，即得包涵體。2、包涵體的溶解 通常采用變性劑。對絕大多數(shù)包涵體而言，在條件下， 68mol/L 尿素或 58mol/L 鹽酸胍即可將其溶解。另外，去垢劑、有機溶劑、堿性環(huán)境 (pH也可使包 涵體溶解。如果包涵體中蛋白含 2 個以上二硫鍵，則還需要加入還原劑如 2-巰基乙醇或 2- 巰基蘇糖醇等，使二硫鍵處于可逆斷裂狀態(tài)。3、重組蛋白的復性

12、包涵體溶解后，結(jié)合的蛋白互相分離，呈變性狀態(tài)，即所有的氫 鍵、疏水鍵全被破壞，但一級結(jié)構(gòu)保持完好，因此去除變性劑時，一部分蛋白可自動折疊 成具有活性的正確構(gòu)型，這一過程即復性。目前復性方法主要有稀釋法、透析法和層析法 (或超濾)。對于具有二硫鍵的重組蛋白，復性時還涉及到二硫鍵的正確形成。一般空氣中 的氧即可使還原型半胱氨酸殘基形成二硫鍵，也可加入微量硫化物如 2- 巰基乙醇、氧化型 或還原型谷胱甘肽，以促進正確二硫鍵的形成。今年來對蛋白折疊理論的研究認為， 許多蛋白的天然構(gòu)象并不是自發(fā)的一步折疊而成， 而是在一些輔助蛋白的協(xié)助下經(jīng)許多中間態(tài)逐步形成的。包涵體的形成，是由于肽鏈折疊 過程中部分折

13、疊的中間態(tài)之間的特異性錯誤聚合，而不是形成成熟的天然態(tài)或完全解鏈的 蛋白。為克服包涵體的形成，常用的策略是在表達目的蛋白的同時，共表達分子伴侶 (chaperones) 和折疊群。 分子伴侶是細胞內(nèi)催化及維持其他蛋白正確構(gòu)象的一類蛋白分子， 它們識別、結(jié)合和穩(wěn)定部分折疊的蛋白中間體，避免不適當?shù)姆肿娱g及分子內(nèi)作用，但不 催化二級結(jié)構(gòu)的形成。大腸桿菌的分子伴侶有 GroES/GroEL、Dnak/DnaJ、SecB、PapD等。 與分子伴侶不同，折疊酶具有催化異構(gòu)作用，限制蛋白變性速率。氧化還原酶DsbB及肽脯 氨酰異構(gòu)酶 (PPlase) 催化大腸桿菌中 x-pro 肽鍵的異構(gòu)反應。非受體蛋白

14、酪氨酸激酶在大 腸桿菌中多形成包涵體，將酪氨酸激酶與 GroES、GroEL、Dnak、DnaJ、GrpE 等共表達，得 到了可溶蛋白。二、純化目前重組蛋白的純化方法主要是色譜法，如離子交換層析、疏水作用層析、凝膠過濾 層析、親和層析等，近年來出現(xiàn)的徑向色譜分離、灌注層析、旋轉(zhuǎn)等電聚集電泳及反膠團 分離等技術也得到了廣泛應用。純化過程中，合理的色譜分離次序也很重要。 ；例如，用鹽 酸胍溶解的包涵體不能首先使用離子交換層析；用 SDS溶解的包涵體第一步分離僅限于凝 膠過濾層析；用尿素溶解的包涵體則有多種選擇。此外，分離純化所用的緩沖液的各種參 數(shù)，如 pH值、溫度、離子強度等對生物活性的影響不易確定，一次分離純化操作帶有很大 的經(jīng)驗成分。三、檢測真核基因在大腸桿菌中表達產(chǎn)物的檢測方法有以下 3 種：1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 用于確定所表達的目的蛋白是否存在以及蛋 白的相對分子量和純度。2、Western b