蛋白質(zhì)各種定量方法的優(yōu)缺點(diǎn)的比較

1、蛋白質(zhì)各種定量方法的優(yōu)缺點(diǎn)的比較1蛋白質(zhì)的常規(guī)檢測方法1.1 凱氏（ Kjeldahl ）定氮法一種最經(jīng)典的蛋白質(zhì)檢測方法。原理 ：樣品中含氮有機(jī)化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化,含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生氨 ,氨又與硫酸作用變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨,氨用過量的硼酸溶液吸收 ,再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點(diǎn) ：范圍廣泛、測定結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好缺點(diǎn) ：操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)、試劑消耗量大1.2 雙縮脲法常用于需要快速但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)檢測。原理：雙縮脲（ NH3CONHCONH3）是 3 分子的脲經(jīng) 180左右加熱，放出 1 分子氨后得到 的產(chǎn)物。 在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與

2、硫酸銅形成紫色絡(luò)合物（肽鍵中的氮原子和銅 離子配價(jià)結(jié)合） ，稱為雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，因 此可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍： 110mg（有的文獻(xiàn)記載為 120mg）優(yōu)點(diǎn) ：較快速，干擾物質(zhì)少，不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生的顏色深淺相近缺點(diǎn) ：靈敏度差； 三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和 EDTA 等會(huì)干擾該反應(yīng)。1.3 Folin- 酚試劑法原理：Folin-酚法的原理與雙縮脲法大體相同，利用蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)。同時(shí)也由于 Folin-酚試劑中的磷鉬酸 -磷鎢酸試劑被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸 殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物。在一定的條件下,藍(lán)色深度

3、與蛋白的量成正比，由此可測定蛋白質(zhì)的含量。測定范圍： 20250ug優(yōu)點(diǎn) ：靈敏度高，對(duì)水溶性蛋白質(zhì)含量的測定很有效缺點(diǎn) ：費(fèi)時(shí)，要精確控制操作時(shí)間；Folin -酚法試劑的配制比較繁瑣 ,且酚類和檸檬酸、硫酸銨、 Tris 緩沖液、甘氨酸、 糖類、甘油、還原劑 （二硫代蘇糖醇、巰基乙醇 ）、 EDTA和脲素均會(huì)干擾反應(yīng)。1.4 紫外吸收法原理 ：蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、 苯丙氨酸和色氨酸殘基使其在 280nm 處具有紫外吸收， 其 吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比 ）。此外，蛋白質(zhì)溶液在 280nm 的吸光度值與肽鍵含量成 正比， 利用一定波長下蛋白質(zhì)溶液的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系可以測定蛋 白

4、質(zhì)含量。優(yōu)點(diǎn) ：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后能回收。缺點(diǎn) ：測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，專一性差； 干擾物質(zhì)多，若樣品中含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較 大的干擾。定氮法、雙縮脲法、 Filon- 酚試劑法和紫外吸收法為常用的4 種古老的經(jīng)典方法。1.5 考馬斯亮藍(lán)法原理 ：染料考馬斯亮藍(lán) G-250 在酸性溶液中與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸 （特別是精氨酸） 及芳 香族氨基酸殘基相結(jié)合，使染料最大吸收峰的位置由 465nm 變?yōu)?595nm ，溶液的顏 色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色，在 595nm 下測定的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度呈正比。優(yōu)點(diǎn) ：靈敏度高，測定快速、簡便，干擾物質(zhì)少

5、，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡(luò)合劑 的影響，適合大量樣品的測定。缺點(diǎn) ：由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同, 因此用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差。2. 蛋白質(zhì)的電化學(xué)檢測方法2.1 蛋白芯片技術(shù)原理 ：將各種蛋白質(zhì)有序地固定于載玻片等各種介質(zhì)載體上成為檢測的芯片，然后用標(biāo)記特定熒光物質(zhì)的抗體與芯片上的蛋白質(zhì)相匹配結(jié)合， 抗體上的熒光將指示對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì) 及其表達(dá)數(shù)量。優(yōu)點(diǎn) ：快速、低成本2.2 電化學(xué)免疫傳感器原理 ：電化學(xué)免疫傳感器是基于抗原抗體反應(yīng)， 可進(jìn)行特異性的定量分析的自給式的集成器 件， 抗原、抗體是分子識(shí)別元件，且與電化學(xué)傳感元件直接接觸，并通過傳感元件 把某種

6、化學(xué)物質(zhì)濃度信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的電信號(hào)。3. 蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)檢測方法3.1 鄰位連接技術(shù)原理：首先將不同的 DNA 單鏈分別與蛋白質(zhì)識(shí)別分子相結(jié)合 ,形成 PLA 探針，經(jīng)過類似酶 聯(lián)免疫吸附法（ ELISA）中的溫育過程， 2 條含有不同 DNA 序列的 PLA 探針會(huì)同時(shí)結(jié) 合到同一個(gè)待測蛋白質(zhì)分子上。此時(shí)， 2 條探針的 DNA 尾部便在空間上緊密靠近。 在過量的互補(bǔ)連接序列和 NDA連接酶的作用下， 2 條探針 DNA 尾部的游離 5端和 3端與互補(bǔ)序列雜交并發(fā)生連接反應(yīng)，形成一個(gè)環(huán)狀的蛋白質(zhì)-蛋白識(shí)別分子 -單鏈DNA 復(fù)合物。該復(fù)合物量的多少，完全取決于樣品中待測蛋白質(zhì)分子的量，故

7、可用 于蛋白質(zhì)的定量分析。優(yōu)點(diǎn) ：檢測靈敏度高、檢測特異性強(qiáng)、樣品損耗低、操作簡單、檢測設(shè)常見3.2 核酸適體原理 ：直接在核酸適體上共價(jià)修飾熒光基團(tuán)， 利用它與靶分子結(jié)合時(shí)熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì) 靶分子的檢測。 修飾有熒光熄滅基團(tuán)的核酸適體探針通過靜電作用與陽離子熒光共軛 聚合物結(jié)合，導(dǎo)致后者熒光熄滅，當(dāng)加入靶蛋白后，核酸適體探針與其特異性結(jié)合， 熒光熄滅基團(tuán)與陽離子熒光共軛聚合物遠(yuǎn)離，聚合物熒光信號(hào)得以恢復(fù)。優(yōu)點(diǎn) ：檢測限低，檢測線性范圍廣3.3 電泳法原理 ：電泳法 ,就是指帶電荷的供試品（如蛋白質(zhì)、核苷酸等）在惰性支持介質(zhì)（如濾紙、 醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，在電場的

8、作用下，向其對(duì)應(yīng)的電 極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)， 由于各組分之間的移動(dòng)速度不同， 使各組分分離成狹 窄的區(qū)帶，并用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量。優(yōu)點(diǎn) ：操作簡便、快速、樣品用量少、高自動(dòng)化。缺點(diǎn) ：存在核酸、多糖、脂類等干擾分子，影響檢測結(jié)果。3.4 二甲酸喹啉（ BCA）法原理：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)將 Cu2+還原成 Cu+，BCA與 Cu+結(jié)合形成穩(wěn)定的藍(lán)紫色復(fù)合物， 在 562nm 處具有最大吸收峰，在一定條件下，此復(fù)合物的吸光度與蛋白質(zhì)濃度成正比。 優(yōu)點(diǎn)：試劑單一， 終產(chǎn)物穩(wěn)定， 除對(duì)還原性糖類的干擾敏感外，對(duì)其他物質(zhì)包括常用蛋白質(zhì) 增溶的表面活性物質(zhì)如 SDS等

9、均無影響。缺點(diǎn) ：反應(yīng)時(shí)間長且蛋白質(zhì)也會(huì)發(fā)生不可逆的變性。4. 免疫法4.1 免疫擴(kuò)散法原理 ：環(huán)狀免疫單擴(kuò)散法，將一定量的抗體 （一般常用單價(jià)抗血清） 與含緩沖液的瓊脂糖 凝膠混勻鋪成適當(dāng)厚度的凝膠板，再把抗原滴進(jìn)凝膠板的小孔中，在合適的濃度和濕 度環(huán)境中， 經(jīng)過一定的時(shí)間，抗原由小孔向四周擴(kuò)散（呈輻射狀） ，與已沉勻在瓊脂糖 凝膠中的抗體相互作用。 當(dāng)抗原擴(kuò)散到一定的距離， 并見抗原抗體的濃度比例合適時(shí)， 形成濃沉淀環(huán)，這一沉淀是一種抗原抗體復(fù)合物。抗體的濃度一定，抗體向瓊脂糖凝 膠擴(kuò)散形成的沉淀不再增大，這時(shí)沉淀環(huán)的大?。娣e ）與抗原濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，這樣即可定量測定抗原物質(zhì) -待測樣品中蛋白質(zhì)的含