重樓總皂苷提取分離及其對人胃癌細(xì)胞BGC823的抑制作用

1、重樓總皂苷提取分離及其對人胃癌細(xì)胞bgc823的抑制作用簿嬲重樓總皂苷提取分離及其對人胃癌細(xì)胞bgc823的抑制作用吳夏慧薛嬌胡文靜禹立霞錢曉萍劉寶瑞(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院,江蘇南京210008)摘要目的:初步探索重樓總皂苷的提取分離方法,并通過比較重樓總皂苷與重樓醇提物,重樓皂苷i對人胃癌細(xì)胞bgc823生長抑制作用評價重樓總皂苷提取分離工藝和臨床應(yīng)用價值.方法:采用熱回流提取法得到重樓醇提物.再經(jīng)大孔吸附樹脂分離得到重樓總皂苷.采用噻唑藍(lán)染色法(mtt法)和集落形成實驗.比較重樓總皂苷與重樓醇提物,重樓皂苷i對人胃癌bgc823細(xì)胞增殖和集落形成的影響.結(jié)果:重樓總皂苷,重樓醇提物,

2、重樓皂苷i作用于人胃癌bgc823細(xì)胞48h的半數(shù)抑制濃度(ic50)分別為(8.63+0.30),(2.610.03),(1.970.o1)g/ml.在3.13,6.25,12.51xg/ml濃度下重樓醇提物組集落形成抑制率為30.84%,53.27%,100%,而重樓總皂苷組在各濃度范圍內(nèi)均無集落形成.結(jié)論:重樓總皂苷對人胃癌bgc823細(xì)胞生長抑制作用顯著優(yōu)于重樓醇提物,稍弱于重樓皂苷i,但二者ic5o數(shù)值接近且均較低,從而肯定重樓總皂苷提取分離工藝和臨床應(yīng)用潛能.關(guān)鍵詞重樓皂苷bgc823細(xì)胞細(xì)胞增殖病理學(xué)體外實驗中圖分類號r282.710.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼a文章編號1672397x(20

3、11)08008403中藥重樓(rhizomaparidis)為百合科植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖,具有清熱解毒,消腫止痛,涼肝定驚之功效,主治疔瘡癰腫,咽喉腫痛,毒蛇咬傷,跌撲傷痛,驚風(fēng)抽搐等癥田.實驗室前期研究表明,重樓復(fù)方及重樓醇提物對腫瘤生長有良好的抑制作用12-3.同時,國內(nèi)外大量文獻(xiàn)報道重樓皂苷具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)凋亡等作用,其中以重樓皂苷i抗腫瘤活性最強(qiáng).研究最為廣泛h_q.有效部位是中藥研究的一種新的思路,其既去除了中藥及其復(fù)方的雜質(zhì).又保留了化學(xué)成分相近,功效類似的藥效成分群.符合中藥多成分,多靶點,多效應(yīng)的作用特點,且提取分離工藝相對單體化合物簡單,便于研發(fā)和臨

4、床應(yīng)用.鑒于重樓良好的抗腫瘤活性和有效部位研究的優(yōu)勢,本實驗探索重樓抗腫瘤天然有效部位總皂苷的提取分離方法,并比較重樓總皂苷與其醇提物,重樓皂苷i體外直接細(xì)胞毒作用,從而進(jìn)一步評價重樓總皂苷提取分離工藝和臨床應(yīng)用價值.1實驗材料1.1藥材重樓.產(chǎn)地四jii,購自重慶重樓中藥飲片廠有限公司,批號100401;重樓皂苷標(biāo)準(zhǔn)品i,購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司,純度98%.1.2主要儀器r501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申順生物科技有限公司),olympus倒置顯微鏡(日本olympus公司),低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠),exl800自動酶標(biāo)儀(美國biotek公司),co:培養(yǎng)箱(日本sanyo公司),

5、超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司).1-3主要試劑rpmi1640培養(yǎng)液(美國gibco公司),新生小牛血清(蘭州民海生物公司),0.25%胰蛋白酶(美國sigma公司),m,iti(美國sigma公司),dmso(上海凌峰公司,分析純),d101型大孔吸附樹脂(上海振光樹脂廠),無水乙醇(南京化學(xué)試劑廠),其他試劑均為分析純.1.4細(xì)胞株人胃低分化腺癌細(xì)胞株bgc823(由南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院腫瘤中心實驗室保存)接種于完全培養(yǎng)液中.37恒溫,5%co:,飽和濕度培養(yǎng)箱中生長,23d消化傳代1次.取對數(shù)生長期細(xì)胞用于細(xì)胞毒實驗.2實驗方法2.1重樓醇提物的制備采用本實驗室通過正交實驗優(yōu)選的重樓

6、醇提物制備方法.將重樓粉碎過二號篩,置于干燥箱60過夜,稱取藥材粉末100g.加8倍量80%乙醇熱回流提取3次,每次2h,抽濾,濾液減壓濃縮,將濾液水浴蒸干后真空干燥制得干浸膏.將重樓醇提物用dmso溶解定容至200mg/ml,以3000r/min離心15min,取上清,過0.22m微孔濾膜過濾除菌,4冰箱保存,臨用時用完全培養(yǎng)液稀釋成所需濃度.dmso終濃度o.1%.2.2重樓總皂苷的制備稱取適量重樓醇提物用80%乙醇溶解,按體積比1:1加入dio1大孑l樹脂拌樣,蒸干后上樣于d101型大孔吸附樹脂.以57倍柱體積的純水,40%乙醇,70%乙醇,90%乙醇依次洗脫,流速:2bvfla,收集各

7、梯度濾液,其中70%乙醇部位濾液60減壓回收,將濾液水浴蒸干后真空干燥即得重樓總皂苷.將重樓總皂苷配制成200mg/ml的溶液,方法同重樓醇提物.基金項目:教育部高校博士點專項(200803150007);南京市衛(wèi)生局醫(yī)藥衛(wèi)生科(ykk09095,ykk09097);南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項目(zkxio011)團(tuán)!璺竺竺堂竺!塑中壓;52-3m1-r法比較重樓醇提物,重樓總皂苷,重樓皂苷i對bgc823細(xì)胞增殖的影響取對數(shù)生長期的人胃低分化腺癌bgc823細(xì)胞.加以每孔6.oxlo密度活細(xì)胞接種于96孔板,培養(yǎng)24h,棄培養(yǎng)液,加入含藥物的培養(yǎng)基(每組濃度設(shè)立3個復(fù)孔).藥物終濃度分別為25,l

8、2.5,6.25,3.13,1_56,0.781xg/ml.同時設(shè)立只加完全培養(yǎng)液的空白對照組.置于370c,5%co飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后每孔加入2om丌溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,棄上清,每孔加入dmso1501.ll,微型混合器震蕩10min,充分溶解結(jié)晶后,用自動酶標(biāo)儀雙波長(570/630nm)測定各孔的光密度值(opticaldensity,od值).按公式計算腫瘤細(xì)胞增殖抑制率:抑制率(%)=(1一實驗組0d值/對照組od值)10o%2.4集落形成實驗71取對數(shù)生長期的人胃低分化腺癌細(xì)胞bgc823,以io0/:l密度活細(xì)胞接種于24孔板,培養(yǎng)24h,棄培養(yǎng)液,加入含藥物的培養(yǎng)基

9、(每組濃度設(shè)立3個復(fù)孔),藥物終濃度分別為12.5,6.25,3.13p,g/ml,同時設(shè)立完全培養(yǎng)液的空白對照組.藥物作用48h,棄上清,換完全培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)7d,棄上清,經(jīng)95%酒精固定,結(jié)晶紫染色,在顯微鏡下計數(shù)含50個細(xì)胞以上的集落.按下式計算集落形成抑制率:集落形成抑制率(%)=(1一實驗組集落形成數(shù),對照組集落形成數(shù))xlo0%2.5統(tǒng)計學(xué)方法運用spss17.0統(tǒng)計軟件處理,采用t檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,所有數(shù)據(jù)用(礎(chǔ)s)表示.以p<0.05為有顯著性差異.3實驗結(jié)果3.1比較重樓醇提物,重樓總皂苷,重樓皂苷i對bgc823細(xì)胞增殖的影響從表1可以看出,經(jīng)不同濃度的重樓醇提物,

10、重樓總皂苷,重樓皂苷i作用后,人胃癌細(xì)胞bgc823的生長增殖受到不同程度的抑制.并呈濃度依賴性.除251xg/ml濃度外.重樓醇提物,重樓總皂苷在其余各濃度下組間抑制率比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(尸<0.05).在低濃度(o.783.13gml)范圍內(nèi).重樓總皂苷,重樓皂苷i組間抑制率比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<o.05).重樓醇提物,重樓總皂苷,重樓皂苷i作用于bgc823胃癌細(xì)胞48h的半數(shù)抑制濃度(ic50)分別為(8.63-z-0.30),(2.61_-+0,03),(1.97蝴.01)咖l,各組間ic50比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05).重樓總皂苷對人胃癌細(xì)

11、胞bgc823的增殖抑制作用顯著強(qiáng)于重樓醇提物,但弱于重樓皂苷i.表l重樓總皂苷,重樓醇提物,重樓皂苷i對bgc823細(xì)胞的增殖抑制作用(,n=3)注:與重樓醇提物組比較,p<0.05;與重樓皂苷i組比較.p<0.05.3.2重樓醇提物,重樓總皂苷,重樓皂苷i對人胃癌細(xì)胞bgc823形態(tài)的影響如圖1所示,以3.131g/ml濃度作用時,重樓總皂苷,重樓皂苷i組腫瘤細(xì)胞密度減低,分裂像減少,大部分細(xì)胞變圓皺縮,脫壁漂浮,而重樓醇提物組腫瘤細(xì)胞形態(tài)改變不明顯.以6.251xg/ml濃度作用時,重樓總皂苷,重樓皂苷i組腫瘤細(xì)胞形態(tài)相似,即碎裂成沙粒狀,而重樓醇提物組部分腫瘤細(xì)胞變圓皺縮,

12、無沙粒狀改變._a重樓醇提物3.13g/ml組b重樓總皂苷3.13g/ml組c重樓皂苷i3.13g/ml組_d重樓醇提物6.25g/ml組e重樓總皂苷6.25p/ml組f重樓皂苷i6.25g/ml組圖1重樓醇提物,重樓總皂苷,重樓皂苷i作用48h后bgc823細(xì)胞的形態(tài)變化(2oo)(本文彩圖刊登于http:/www.jstcm.en電子圖片欄目)3i3重樓醇提物,重樓總皂苷對人胃癌細(xì)胞bgc823集落形成的影響結(jié)果見表2.不同濃度下實驗組與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<o.05).重樓醇提物對bgc823胃癌細(xì)胞集落形成的影響呈劑量依賴性,在3.13,6.25,12.5txg/

13、ml濃度下重樓醇提物組集落形成抑制率為30.84%,53.27%,100%.而重樓總皂苷組在各濃度范圍內(nèi)均無集落形成.故重樓總皂苷抑制集落形成的作用顯著強(qiáng)于重樓醇提物.表2重樓醇提物,重樓總皂苷對人胃癌細(xì)胞bgc823集落形成的影響(互,n=3)注:與空白對照組比較,p.,0.05;與重樓醇提物組比較.p<0.05.4討論在我國,中藥是惡性腫瘤綜合治療的重要組成部分.隨著分子生物學(xué)的發(fā)展.藥物高通量高內(nèi)涵分析,篩選等技術(shù)平臺的不斷提升.逐漸認(rèn)識到有效部位是中藥生物學(xué)活性的物質(zhì)基礎(chǔ).中藥有效部位包含多種物質(zhì)成分,可作用多個靶點產(chǎn)生多種效應(yīng),較單個化合物的作用機(jī)制復(fù)雜,而提取分離工藝相對簡單

14、.同時區(qū)別于通過水煎,醇提等簡單提取方法得到的中藥粗提物,中藥有效部位可以進(jìn)一步提高藥物療效,降低藥物副反應(yīng).相對重樓皂苷單體化合物而言,重樓總皂苷具有提取工藝相對簡單和多組分,多靶點,多效應(yīng)的藥效優(yōu)勢.相對重樓醇提物而言,重樓總皂苷具有提高藥物療效,降低副作用等優(yōu)勢.本實驗采用熱回流提取和大孔吸附樹脂提取分離重樓總皂苷,大孑l吸附樹脂是一類新型的非離子型高分子吸附劑,具有分離效果好,操作簡單,有機(jī)溶劑使用少,可以再生中醫(yī)墜田補腎活血中藥對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠生殖功能干預(yù)研究夏親華沈明勤:張蕾:(1.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇南京210046;2.江蘇省中醫(yī)藥研究院,江蘇南京210028)摘要目的:探

15、討補腎活血中藥對調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜異位癥(ems)模型大鼠生殖功能的作用.方法:將ems模型大鼠分為模型組和補腎活血湯高,中,低劑量組及陽性藥組,另設(shè)假手術(shù)組.分別給藥8周后觀察在位內(nèi)膜的pr表達(dá)和排卵數(shù)目,剩余各組大鼠分別與雄性大鼠按2:1比例合籠.觀察孕鼠活胎數(shù).結(jié)果:陽性藥組和補腎活血湯中,高劑量組大鼠的在位內(nèi)膜pr表達(dá)與模型組比較明顯升高,陽性藥組和補腎活血湯各劑量組的排卵數(shù)與模型組比較明顯增多,補腎活血湯各劑量組的活胎數(shù)與假手術(shù)組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義.結(jié)論:補腎活血中藥能有效調(diào)節(jié)ems模型大鼠子宮內(nèi)膜孕激素受體的表達(dá).促進(jìn)卵泡發(fā)育,提高妊娠率,達(dá)到有效調(diào)節(jié)生殖功能的目的.關(guān)鍵詞子宮內(nèi)膜異位

16、癥補腎活血湯子宮卵巢病理學(xué)活胎數(shù)實驗研究中圖分類號r711.710.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼a文章編號1672397x(2ol1)o8008602目前.子宮內(nèi)膜異位癥(ems)已成為影響生育最主要的婦科疾病之一.中醫(yī)藥在緩解癥狀,調(diào)經(jīng)助孕等方面療效突出.有西藥不可比擬的優(yōu)勢.本研究通過觀察補腎活血湯對ems模型大鼠生殖功能的干預(yù),證實其有效調(diào)節(jié)ems模型大鼠生殖功能的作用,現(xiàn)報道如下.1實驗材料1.1實驗藥物補腎活血湯,處方:菟絲子log,紫河車10g,當(dāng)歸10g,川芎6g,生地10g,白芍log,山藥15g,柴胡10g,桑寄生10g,丹參10g,由江蘇省中醫(yī)藥研究院制劑室制備提供標(biāo)準(zhǔn)湯劑,每毫升藥液含生

17、藥材約1.63g.己烯雌酚:0.5mgx100片,合肥久聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn),批號:20080104.孕三烯酮(內(nèi)美通)膠囊:2.5mg/粒xl0粒,patheonu.k.limited生產(chǎn),批號:018445.枸櫞酸氯米芬片:50mgxl0片.codalsyntolimited生產(chǎn),批號:a1101.1.2儀器與試劑waters高效液相色譜儀.600泵,2996型檢測器.empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng).阿魏酸對照品:中國藥品生物制品檢驗所,供含量測定用,批號:07739809.其他試劑為市售分析純.和反復(fù)使用,便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點,是分離中藥有效成分的重要方法.同時.本實驗采用m1rr法和集落形成

18、實驗比較重樓總皂苷,重樓醇提物,重樓皂苷i對人胃癌bgc823細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):重樓總皂苷對人胃癌bgc823細(xì)胞的生長抑制作用顯著優(yōu)于重樓醇提物;重樓總皂苷和重樓皂苷i抗腫瘤的ic雖然差異有統(tǒng)計學(xué)意義,但數(shù)值相差不大且均較低.以上提示重樓總皂苷較重樓醇提物有效提高了對人胃癌bgc823細(xì)胞體外細(xì)胞生長抑制作用.相對重樓皂苷i而言,重樓總皂苷的提取分離工藝相對簡單而體外活性相似,肯定了重樓總皂苷的提取分離工藝.同時良好的直接細(xì)胞毒作用提示其具有一定的臨床應(yīng)用潛能,因而值得進(jìn)一步研究重樓總皂苷體內(nèi)外抗腫瘤作用和安全性,以及深入機(jī)理研究,明確其作用靶點和作用機(jī)理,為指導(dǎo)臨床用藥提供理論基礎(chǔ).5參考文獻(xiàn)1國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京:中國醫(yī)藥科技出版杜.2010:24321胡文靜,錢曉萍,鄒璽