河鲀小鼠結(jié)合蛋白

1、摘 要本實驗以無特定病原體級（SPF）ICR品系性雄性健康小鼠為實驗對象。通過對小鼠灌胃法和腹腔注射TTX-重組蛋白混合液，研究重組蛋白對小鼠TTX中毒的解毒作用。結(jié)果表明灌胃劑量350 g/kg BW時2h內(nèi)小鼠死亡率為60%，與此作為對照組TTX濃度，灌胃毒素與蛋白孵化后混合液，所有小鼠均存活，表明TTX與蛋白體外孵育后，TTX呈無毒。而腹腔注射TTX濃度為7.5 g/kg BW小鼠生存延長，腹腔注射毒素與蛋白孵化后混合液，小鼠存活率顯著上升，表明TTX與蛋白體外孵育后，TTX的毒性顯著降低。關(guān)鍵詞：TTX；河鲀；小鼠；TTX結(jié)合蛋白AbstractIn this study, healt

2、hy male mice without specific pathogen grade (SPF) ICR strain were selected as subjects. The detoxification effect of recombinant protein on TTX intoxication in mice was studied by gavage and intraperitoneal injection of TTX- recombinant protein mixture. The results showed that the mortality rate of

3、 mice was 60% within 2h after gavage of 350 g/kg BW, which was used as the TTX concentration of the control group. All mice survived after gavage of the mixture of toxin and protein after incubation, indicating that TTX was non-toxic after in vitro incubation of TTX and protein. The survival of mice

4、 with intraperitoneal injection of TTX concentration of 7.5 g/kg BW was prolonged, and the survival rate of mice with intraperitoneal injection of the mixture of toxin and protein after incubation was significantly increased, indicating that TTX significantly decreased after in vitro incubation of T

5、TX and protein.Key words:TTX;Puffer fish;mice;TTX binding protein目 錄1 引 言11.1 TTX的概述11.2 TTX的起源11.3 河豚毒素在體內(nèi)的分布31.4 TTX的應(yīng)用31.5 TTX結(jié)合蛋白的研究31.6 研究意義42 材料與方法52.1 實驗材料52.1.1 實驗動物52.1.2 主要試劑52.2 實驗方法52.2.1 實驗設(shè)計52.2.2 利用灌胃法驗證重組蛋白對小鼠TTX中毒的解毒作用62.2.3 利用腹腔注射驗證重組蛋白對小鼠TTX中毒的解毒作用63 實驗結(jié)果及分析63.1 灌胃法63.2 腹腔注射74 結(jié)論8

6、參 考 文 獻10致 謝10河豚毒素的毒性效應(yīng)研究1 引 言1.1 TTX的概述河鲀也稱做氣泡魚，古人稱之為肺魚，其形狀長條形、頭部扁且橢圓 整體黑色，腹部白色或者黃白色。皮膚下有小白刺是一種變形的鱗片，在遭遇危險時河豚會大口的吞氣，使得全身鼓成一個球體，全身的刺狀鱗片也向四周豎起保護自己。鲀?nèi)鉂嵃兹缢?，鮮嫩可口、營養(yǎng)豐富。富含維身素B1 維身素B2等微量元素，具有增強人體免疫力，增強視力、補腦健腦等作用。俗語有說拼死吃河豚，由于加工不當或誤食河鲀而引起中毒甚至死亡等食品安全問題1-2。TTX(河豚毒素）是一種生物堿類非蛋白的天然神經(jīng)毒素，擁有劇毒，是最致命毒素之一，分子式：C11H17O8N

7、3，分子質(zhì)量：319.17，結(jié)構(gòu)特征：一個碳環(huán)，一個胍基，6個羥基，在C-5和C-10位。理化性質(zhì)穩(wěn)定，230左右碳化，300以上不分解在酸性情況下或者中性作用穩(wěn)定，但對堿性極不穩(wěn)定。在堿水中容易發(fā)生分解，不容于有機溶劑如：乙醚，乙醇等3。河豚毒素對動物體內(nèi)鈉通道有著阻斷作用，從而使神經(jīng)與肌肉產(chǎn)生的興奮活動阻斷，引起麻痹。且河豚毒素被人誤食用，會引起腸胃道刺激外，還會被吸收進血液里，隨著毒血蔓延全身，毒發(fā)速度快，最后最后會因為血管運動神經(jīng)及呼吸神經(jīng)神經(jīng)麻痹而運動障礙，呼吸困難，嚴重者會因為急呼吸衰竭而迅速死亡。1.2 TTX的起源最先開始，廣泛的認為只有河豚才擁有河豚毒素。后來Mosher等4

8、人在1964年從加州蠑螈中提取出了河豚毒素，這種想法才被打破。之后報道，發(fā)現(xiàn)紐蟲、海星、章魚科、織紋螺、蛙類、環(huán)節(jié)動物等生物體內(nèi)都含有河豚毒素。內(nèi)因說認為河豚毒素來源于生物刺細胞和毒腺的蛋白質(zhì)毒素。為了證實此種說法，相關(guān)研究人員隨之展開了實驗，他們在星點河豚身上提取出成熟的精子和卵細胞，進行受精培育在實驗過程中發(fā)現(xiàn)正在孵化中的胚胎內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了河豚毒素5。且隨著實驗過程增長而增長，而河豚受精卵實驗也驗證了增長的河豚來源于胚胎。也為內(nèi)因說增加了說服力，但始終找不到其相關(guān)的毒腺而缺乏廣大的認同。但之后研究者們經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)一些陸地生物體內(nèi)的TTX（河豚毒素）疑似自身合成。如：青蛙 蠑螈等。對此研究人員篩

9、選出蠑螈進行圈養(yǎng)實驗5。用不含河豚毒素的食物來給蠑螈作為食料，一段時間后，結(jié)果表明蠑螈有自生TTX（河豚毒素）的能力。因此也進一步證明了內(nèi)因說的可能性，但海星、扭蟲等動物是否擁有自產(chǎn)TTX的能力和TTX怎么在組織和器官之間轉(zhuǎn)移，還需要進一步的探究。有研究者認為捕食許多含有河豚毒素的生物是河豚廣集毒素的來源，河豚吞下之后在體內(nèi)吸收并存儲。為了驗證此種學(xué)說，主張外因的學(xué)者們進行了實驗。之后研究人員把河豚魚肝切成薄片后，放在含有TTX的培養(yǎng)液進行了實驗，結(jié)果表明：河豚魚肝具有吸收TTX的能力，通過對照，河豚魚肝比其他魚類吸收毒素的能力更強，這更加支持了河豚毒素是外因所導(dǎo)致的說法。據(jù)有關(guān)實驗研究6，將

10、河豚進行人工養(yǎng)殖一段時間后，在河豚體內(nèi)檢測不到河豚毒素或者幾乎無毒性。之后實驗者在喂食河豚的食物中加入了河豚毒素，過一段時間后，結(jié)果在河豚體內(nèi)又檢測出了河豚毒素。因此也證明了河豚本身不產(chǎn)河豚毒素，似乎也對河豚毒素的外因性添加了說服力。1985年Matsui7等相關(guān)研究人通過人工養(yǎng)殖河鲀實驗。從中得出河豚毒素的外源性，河豚通過捕食含有河豚毒素的海洋生物，并蓄存于體內(nèi)，但是海洋生物體內(nèi)的河豚毒素又從何而來。一些研究人員發(fā)現(xiàn)8在處于食物鏈下位的一些生物如：藻類、海螺等生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了河豚毒素，還有一些與河豚并無食物和親緣關(guān)系的動物體內(nèi)，也都檢測出河豚毒素。后來發(fā)現(xiàn)不同地理分布的同一種族生物，因為地理分

11、布不同，其體內(nèi)的毒素含量也有差異9-10。日本學(xué)者11曾在人工養(yǎng)殖河豚實驗之后，提出河豚毒素來源于細菌的設(shè)想，但當時并沒有相應(yīng)的證據(jù)來證明。后來隨研究進展，不僅從不同物種中發(fā)現(xiàn)了：溶藻弧菌、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、和鰻弧菌等能產(chǎn)河豚毒素的細菌外，還在河豚體內(nèi)器官中分離出20種能分泌河豚毒素的細菌12。從中得出毒素含量最高的是肝臟和卵巢，其次是腸道，根據(jù)毒素分布的情況，因此推斷，TTX的累積不僅可以在食物鏈中獲得，或者也可以從河豚自身腸道中分泌出河豚毒素。1.3 河豚毒素在體內(nèi)的分布通過人工養(yǎng)殖河豚的實驗，證明了河豚體內(nèi)TTX來源于食物鏈。那么河豚毒素又如何分布呢，在養(yǎng)殖實驗室中發(fā)現(xiàn)：在喂養(yǎng)含TT

12、X的食物后，河豚毒素在河豚體內(nèi)高濃度的積累在：肝臟、膽囊、脾臟和皮膚。與此相關(guān)的是野生河豚肝臟中的TTX的亞細胞分布，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)TTX廣泛的分布在肝細胞的各個隔間但主要分布在細胞質(zhì)部分。但是TTX怎樣分布在肝臟中的呢？結(jié)合目前研究信息：河豚毒素通過食物進入道腸道中，接著被腸道吸收，通過血液運輸?shù)缴眢w各個組織，并積累在細胞內(nèi)，而河豚毒素在河豚內(nèi)也有強弱的差異，其中卵巢和肝臟其分布的毒素最強，之后就是消化道、脾臟、血筋、皮膚。河豚種類繁多，因為品種的不同，分布在河豚體內(nèi)的毒素也有差異，不單單受品種的影響，甚至受地理分布和季節(jié)變化的影響。在南海分布的海豚橫紋東方豚，主要分布在卵巢和肝臟，在肌肉并沒有

13、檢測到TTX分布。而從分布在臺灣沿海的橫紋東方鲀不僅肌肉中檢測出河豚毒素，卵巢、皮膚、肝臟等均有分布。1.4 TTX的應(yīng)用河豚毒素（TTX）雖然是一種神經(jīng)性毒素。但是藥理的應(yīng)用上卻是一種十分珍貴的藥物資源?？捎糜阪?zhèn)痛、麻醉、戒毒、降低血壓等方面。一，在鎮(zhèn)痛方面的作用：河豚毒素主要用途是鎮(zhèn)痛，通過抑制神經(jīng)細胞內(nèi)的內(nèi)流，阻斷神經(jīng)與肌肉產(chǎn)生的興奮傳導(dǎo)而起到鎮(zhèn)痛的效果。TTX的鎮(zhèn)痛功效極其出色，比常規(guī)麻醉可卡因的高出16萬倍，是嗎啡的3200倍13。雖然發(fā)生的時間緩慢，但時間長?？捎糜谥委熒窠?jīng)痛，肌肉痛，創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)炎等。也可適用于癌癥晚期的鎮(zhèn)痛，但鎮(zhèn)痛時間可長達12個小時。二、在戒毒方面作用：對于海洛

14、因，嗎啡等引起的藥物成癮，具有神奇的療效。其優(yōu)點有：1、費用低僅需幾百元；2、痛苦小能快速戒斷；3、周期短僅用7-10天；4、且不會有成癮作用。另外，河豚毒素在治療癌癥、治療睡眠相關(guān)的疾病、高血壓、提高免疫力和延緩衰老等方面也取得了顯著的效果。1.5 TTX結(jié)合蛋白的研究通過研究發(fā)現(xiàn)一些體內(nèi)含有河豚毒素的生物。在對其體內(nèi)的河豚毒素（TTX）都有一定的抗性，并不會因為其體內(nèi)的河豚毒素而發(fā)生中毒。在小鼠腹部注射TTX結(jié)果數(shù)據(jù)的對比表明：無毒河豚對河豚毒素的耐受比小鼠高13倍15倍，有毒河豚對TTX的耐受達到了驚人的300750倍14-15。而在一些本身就含有河豚毒素的蟹類體內(nèi)注射河豚毒素，從中發(fā)現(xiàn)

15、16：中華絨鰲蟹對河豚毒素極強的抗性。后來據(jù)Yamanori 17 等人發(fā)現(xiàn)白紋方蟹它的神經(jīng)對河豚毒素高度敏感，也就是說白紋方蟹體內(nèi)應(yīng)該有一種中和河豚毒素的機制。有學(xué)者18認為：體內(nèi)含有TTX的生物體內(nèi)有一種蛋白質(zhì)與河豚毒素結(jié)合從而使TTX的毒素效應(yīng)降低，研究證明：在含有TTX的扇蟹19-20中提取出一種能中和具有致命效應(yīng)的河豚毒素的蛋白，這可能是能耐受體內(nèi)TTX動物的一種機制。因此認為這種蛋白對體內(nèi)含有河豚毒素的生物其體內(nèi)積累或者耐受河豚毒素起到了一定的作用。在研究食草蟹實驗中：YujiNagashima21等人在食草蟹的血淋巴中分離出一種酸性蛋白，得出結(jié)果這種酸性蛋白能夠結(jié)合河豚毒素或許就

16、是因為這種蛋白食草蟹才能對河豚毒素有一定的抗性。隨著研究發(fā)展：TakashiMatsui22等人在河豚體內(nèi)的血液中分離純化出一種可以與TTX特異結(jié)合的蛋白，該蛋白被稱之為結(jié)合蛋白。并對結(jié)合蛋白進行實驗，整理結(jié)合蛋白血清結(jié)合TTX的檢測數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)：不含TTX結(jié)合蛋白的血清不具有TTX的結(jié)合能力，而含有TTX結(jié)合蛋白的血清具有很強的TTX結(jié)合能力。因此也證明了血清中的某種物質(zhì)與河豚毒素可以特異結(jié)合。之后TakashiMatsui等人通過DEAE-纖維素處理、醋酸胺分餾、纖維柱層析等方法對含有TTX結(jié)合蛋白的血清進行分離純化。最后得出蛋白溶液的河豚毒素結(jié)合能力在66%，但這種結(jié)合又可以被破壞。加入0

17、.05%的醋酸時，河豚毒素就溶解于醋酸溶液中。當用氫氧化鈉綜合后，又恢復(fù)了結(jié)合能力。這種可逆性的反應(yīng)說明了：TTX結(jié)合蛋白在河豚體內(nèi)與河豚毒素進行結(jié)合和運轉(zhuǎn)時，又避免了河豚毒素對自身的傷害。1.6 研究意義河豚毒素是一種能夠與鈉離子通道結(jié)合，而阻止鈉離子進入細胞，阻斷神經(jīng)與肌肉的興奮傳導(dǎo)而引起麻痹23。中毒者會有呼吸困難，知覺麻痹，運動受到障礙，頭昏，頭痛，惡心，嘔吐等癥狀。每年都有很多人因食用，加工不當或者誤食而致人死亡，成為其嚴重的食品安全問題。而目前尚未發(fā)現(xiàn)能夠有效治療河豚毒素中毒的辦法。而通過對TTX（河豚毒素）的耐受作用的研究，可能找到一種高效的治療手段。本研究通過利用灌胃、腹腔注射

18、的方法，來驗證重組蛋白對小鼠TTX中毒的解毒作用，而為其研究TTX毒性的效應(yīng)研究提供理論參考。2 材料與方法2.1 實驗材料2.1.1 實驗動物19.021.0 g的無特定病原體級（SPF）ICR品系雄性健康小鼠由廈門大學(xué)實驗動物中心提供。成年雌性和雄性養(yǎng)殖菊黃東方鲀購自漳浦東方鲀養(yǎng)殖基地。2.1.2 主要試劑河豚毒素粗品購自泰州康特生物工程有限公司；TTX小鼠單克隆抗體以及河豚毒素結(jié)合蛋白（tfPSTBP1, tfPSTBP2, tfVWD）均為實驗室制備。2.2 實驗方法2.2.1 實驗設(shè)計選取19.021.0 g的無特定病原體級（SPF）ICR系雄性健康小鼠，稱量并記錄體重。隨機分為32

19、組，每組10只。對每只試驗小鼠灌胃/腹腔注射0.5 mL TTX溶液，肌肉注射TF_PSTBP1、TF_PSTBP2和TF_vWD重組蛋白溶液，或僅灌胃/腹腔注射TTX-重組蛋白混合液。若注射過程中注射液溢出，須將該只小鼠丟棄，并重新注射一只小鼠。記錄注射開始和完畢時間，仔細觀察并記錄小鼠停止呼吸時的死亡時間（到小鼠呼出最后一口氣為止）。小鼠中毒死亡癥狀：被注射了河豚毒素的小鼠初期安靜，隨后出現(xiàn)呼吸困難，急促，腹部收縮加快，反應(yīng)遲鈍，繼而出現(xiàn)突然疾走，急跑急跳，四處亂竄，東倒西歪，翻轉(zhuǎn)亂跳等掙扎動作，數(shù)十秒后，小鼠后腿劇烈抽搐，23次后爬臥不動，腹部呼吸逐漸微弱減慢，最后死亡。以停止呼吸作為判

20、斷死亡的標準。2.2.2 利用灌胃法驗證重組蛋白對小鼠TTX中毒的解毒作用對照組：準備20只小鼠，每只小鼠灌胃0.5 mL 9.28 g/mL和14 g/mL TTX，等待死亡，記錄在2 h內(nèi)生存時間及死亡數(shù)量。實驗組1：提前將14 g/mL TTX與相應(yīng)摩爾比的重組蛋白在15條件下孵育15 h。準備60只小鼠，隨機分為6組，每組10只，每只小鼠灌胃0.5 mL TTX與對應(yīng)摩爾比的目的重組蛋白混合液，等待死亡，記錄在2 h內(nèi)生存時間及死亡數(shù)量。實驗組2：提前將14 g/mL TTX與摩爾比為1：1的TTX-抗體在15 條件下孵育15 h。準備10只小鼠，每只小鼠灌胃0.5 mL TTX與TT

21、X-抗體混合液，等待死亡，記錄在2 h內(nèi)生存時間及死亡數(shù)量。2.2.3 利用腹腔注射驗證重組蛋白對小鼠TTX中毒的解毒作用對照組：準備30只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 mL 0.30、0.46 g/mL TTX，等待死亡，記錄在2 h內(nèi)生存時間及死亡數(shù)量。實驗組1：提前將0.3 g/mL TTX與相應(yīng)摩爾比的重組蛋白在15條件下孵育15 h。準備60只小鼠，隨機分為6組，每組10只，每只小鼠腹腔注射0.5 mL TTX與對應(yīng)摩爾比的重組蛋白混合液，等待死亡，記錄在2 h內(nèi)生存時間及死亡數(shù)量。實驗組2：提前將0.3 g/mL TTX與摩爾比為1：1的TTX-抗體在15 條件下孵育15 h。準備

22、10只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 mL TTX與TTX-抗體混合液，等待死亡，記錄在2 h內(nèi)生存時間及死亡數(shù)量。3 實驗結(jié)果及分析3.1 灌胃法對照實驗中，根據(jù)已有的研究結(jié)果，小鼠灌胃TTX的半數(shù)致死劑量（LD50）為232 g/kg BW。首先在灌胃劑量為232 g/kg BW TTX時2 h內(nèi)小鼠的死亡率為30%，死亡率較低，作為后續(xù)解毒實驗對照，解毒效果不易分析。因此，提高TTX濃度為350 g/kg BW，小鼠死亡率為60%，以此作為對照組TTX濃度。表1 灌胃河豚毒素（TTX）致小鼠死亡及其存活時間Table1 Mortality and survival time of mice

23、 induced by gavage TTXTTX劑量（g/kg）死亡率生存時間（min）2323/1054,81,983506/1042,44,55,56,56,92Fraction surviva灌胃毒素與蛋白孵育后混合液，所有小鼠均存活（圖1），且在2小時的實驗中未出現(xiàn)毒性臨床癥狀。表明TTX與蛋白體外孵育后，TTX呈無毒狀態(tài)。圖1 TTX與蛋白體外孵育后灌胃小鼠后的存活曲線Fig. 1 Survival curve of mouse after gavage with TTX and protein mixture3.2 腹腔注射當腹腔注射9 g/kg BW（1 MU/小鼠）TTX時，

24、小鼠在15分鐘內(nèi)10只小鼠死亡8只，致死速度較快，無法及時解毒。因此降低TTX濃度為7.5 g/kg BW，小鼠生存時間明顯延長，選擇在10 min后進行肌肉注射蛋白解毒。表2 腹腔注射TTX致小鼠死亡及其存活時間Table 2 Mortality and survival time of mice induced by intraperitoneal injection TTXTTX劑量（g/kg）死亡率生存時間（min）98/108,8,10,11,12,13,13,157.57/1013,13,17,18,21,29,47腹腔注射毒素與蛋白孵育后混合液，小鼠存活率顯著上升（圖2），表明T

25、TX與蛋白體外孵育后，TTX毒性顯著降低。圖2 TTX與蛋白體外孵育后腹腔注射小鼠后的存活曲線Fig. 2 Survival curve of mouse after gavage with TTX and protein mixture4 結(jié)論本研究通過小鼠生物測定法來驗證重組蛋白對小鼠TTX中毒的解毒作用，同時不需要復(fù)雜設(shè)備且操作程序簡便易行。能直接檢測出TTX的毒性，使用廣泛，可靠性強。在對照實驗中，根據(jù)研究結(jié)果，灌胃小鼠致死劑量為232 g/kg BW TTX。2小時內(nèi)死亡率為30%.因死亡率太低，提高TTX濃度到350 g/kg BW，死亡率為60%.做對照組TTX濃度根據(jù)對照組TT

26、X濃度。將毒素與相應(yīng)摩爾比的重組蛋白孵育后混合液，對小鼠進行灌胃。2小時實驗過程中，所有小鼠均存活，且無出現(xiàn)毒性臨床癥狀，表明TTX與重組蛋白體外孵育后，TTX呈無毒狀態(tài)。給小鼠進行腹腔注射TTX，濃度為9 g/kg BW實驗過程中15分鐘內(nèi)死亡8只。比之灌胃法腹腔注射致死速度更快，所以降低TTX濃度到7.5 g/kg BW結(jié)果顯示生存時間明顯延長，解決方案：選擇10分鐘后進行肌肉注射蛋白解毒，結(jié)果表明：給小鼠腹腔注射毒素與蛋白孵育后的混合液。小鼠存活時間提高，表明TTX與重組蛋白體外孵育后，TTX毒性顯著降低。參 考 文 獻1 王麗雅, 陶寧萍, 龔璽. 河豚的食用安全性及營養(yǎng)價值研究進展J

27、. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2012(02):129-134.2 殷芹, 劉巖, 宮慶禮. 河豚毒素的理論及應(yīng)用研究進展J. 海洋通報, 2008, 027(006):95-100.3 張璇. 利用共生微生物研究河豚毒素的生物合成途徑D. 國家海洋局第一海洋研究所, 2013.4 Mosher H S , Fuhrman F A , Buchwald H D , et al. Tarichatoxin-Tetrodotoxin: A Potent NeurotoxinJ. Science, 1964, 144(3622):1100-1110.5 黃軍, 嚴美姣, 陳國宏. 河豚毒素的起源及其研究進展J

28、. 生物技術(shù)通訊, 2006(06):163-165.6 LIUZ,DAIJ, CHEN Z, et al. Isolation and characterization of hainantoxin- IV, a novel antagonist of tetrodotoxin-sensitive sodium channels from the Chinese bird spider Selenocosmia hainanaJ. Cell Mol Life Sci, 2003, 60: 972-978. 7 Matsui T,Yamamori k, Chinone M,et al,Deve

29、lopment of toxicity in cultured puffer fish kept with wild puffer fish?I.Devlopment of toxicity in cultured kusahugu(Fuguni-phobles)J.jpn soc sci Fish, 1985,156.8 李德昆. 河豚毒素的快速檢測方法研究D. 中國海洋大學(xué)， 2004.9 楊曉東, 鄧峰, 劉子文,等. 廣東省常見河豚魚含毒狀況研究J. 廣東衛(wèi)生防疫, 1997(04):4-8.10 楊桂梅, 鮑寶龍. 河鲀和河鲀毒素之間關(guān)系的研究進展J. 上海海洋大學(xué)學(xué)報, 2008,

30、 017(006):734-739.11 陳永豪(譯). 河豚毒素起源的新學(xué)說: 通過高精度及高靈敏度分析, 初步證實毒素的微生物起源學(xué)說J. 海洋藥物, 1987(2): 53-54.12 邢磊. 1.橫紋東方鲀腸道內(nèi)產(chǎn)河豚毒素細菌的篩選 2.勝利油田原油組分的分析及石油降解菌的篩選D. 青島科技大學(xué), 2010.13 蔣政綱. 海安縣人群安全食用河豚魚的KAP調(diào)查D. 2010.14 王曉杰. 織紋螺(Nassarius spp.)體內(nèi)河豚毒素來源的研究D. 中國科學(xué)院海洋研究所, 2008.15 王曉杰, 于仁成, 周名江. 河豚毒素生態(tài)作用研究進展J. 生態(tài)學(xué)報, 2009(09):4

31、17-424.16 Koyama K, Noguchi T, Uzu A. Resistibility of toxic and nontoxic crabs against paralytic shellfish poisons and tetrodotoxin J. Nippon Suisan Gakkaishi, 1983, (49): 485-489. 17 Yamamori K, Yamaguchi S, Maehara E, et al. Tolerance of shore crabs to tetrodotoxin and saxitoxin and antagonistic effect of their body fluid against the toxins J. Nippon Suisan Gakkaishi, 1992, (58): 1 157-1 162. 18 Mats