非抗性篩選生長抑素基因疫苗對育肥豬的免疫應(yīng)答研究畢業(yè)論文

1、本科畢業(yè)論文 題 目非抗性篩選生長抑素基因疫苗對育肥豬的免疫應(yīng)答研究姓 名學(xué) 號專 業(yè)動物科學(xué)指導(dǎo)教師職 稱中國武漢目 錄摘 要i關(guān)鍵詞iabstractikeywordsi前言11 材料與方法21.1 材料21.1.1 質(zhì)粒和菌株21.1.2 實驗試劑21.1.3 實驗儀器21.1.4 實驗動物21.2 疫苗準(zhǔn)備和免疫方法21.2.1 疫苗準(zhǔn)備21.2.2 免疫方法21.3血樣制備31.4 抗生長抑素抗體檢測32 結(jié)果與分析32.1非抗性篩選生長抑素免疫育肥豬后試驗組與對照組抗體水平比較32.2 不同劑量的pgs/2ssasd質(zhì)粒免疫各組育肥豬抗體水平43 討論43.1非抗性篩選生長抑素試驗

2、組與對照組之間的抗體效價比較。43.2免疫劑量對免疫效果的影響54 小結(jié)5參考文獻(xiàn)6致 謝7摘 要 將90只60日齡育肥豬均分為6組，t1-t4組用非抗性篩選生長抑素基因疫苗pgs/2ss-asd免疫，劑量濃度分別是2108 cfu/ml，2109 cfu/ml，21010 cfu/ml，21011 cfu/ml；c1和c2組為對照組，分別免疫c500空菌和pbs。整個試驗共免疫三次，每次免疫間隔4周。elisa抗體檢測結(jié)果顯示：試驗組在免疫初期抗體水平高于對照組，但是免疫后期差異不明顯，不同免疫劑量組之間的抗體水平差異不明顯?？傊眯滦蜕L抑素基因疫苗免疫育肥豬在免疫初期可以檢測到高水平的

3、抗生長抑素抗體，推測出此dna疫苗免疫大動物可以很好地促進(jìn)動物的生長。關(guān)鍵詞pgs/2ss-asd；生長抑素；減毒沙門氏菌；基因疫苗；育肥豬abstract a total of 90 commercial pigs at the age of 60 days were divided into 6 groups. animals in groupc2 were orally administered with pbs as a black control,what were administered groupc1 is c500-salmonella.groupt1 to groupt4

4、were immunized with pgs/2ss-asd ,the density of dos of groupt1 is 2108 cfu/ml,groupt2 is 2109 cfu/ml，groupt3 is 21010 cfu/ml and groupt4 is 21011 cfu/ml；three times immunizing,the interval of immunizing toties quoties is 4 weeks.the results of elisa antibody detection show that:the test group have a

5、 higher level of anitiboty in the initial stage of immunization. but the difference with them were not obviously in the later stage.the difference of the level of anitibody that from groupt1 to groupt4 is not obviously too.in all, use the gene vaccine of pgs/2ss-asd can get high abtibody of the ss f

6、rom the analyze of the elisa results. conclude that this kind of dna vaccine can accelerate the growth rate of the big animal.keywordspgs/2ss-asd; somatostatin; attenuated salmonella; genetic vaccine ; pig前言生長抑素（somatostatin，ss）是下丘腦釋放的14肽激素，在動物體內(nèi)具有廣泛的抑制作用，特別是對生長及免疫反應(yīng)具有明顯的影響1，應(yīng)用生長抑素主動或被動免疫動物，所產(chǎn)生的抗體與s

7、s結(jié)合，能阻斷ss與受體作用；同時在肝臟的作用下，加速循環(huán)中ss的清除，從而促進(jìn)gh等多種激素的釋放，加快動物的生長2-5。國外已報道應(yīng)用ss抗血清被動免疫或化學(xué)合成ss制成免疫原主動免疫牛、綿羊等家畜，可以顯著提高增重效果。國內(nèi)杜念興等已完成了在大腸桿菌中表達(dá)的基因工程亞單位苗、痘苗病毒表達(dá)的活載體苗等ss基因工程苗的制備，其中由痘苗病毒表達(dá)的ss基因工程苗已開發(fā)成為激生i號、激生ii號等商品化產(chǎn)品。激生i號苗對肉豬、肉羊、肉牛均有一定的增重效應(yīng)，可使肉豬增重提高5%-10%，飼料報酬提高5%-20%，肉羊平均體重提10%-12%。6-7然而，以上合成肽及活載體苗都存在免疫持續(xù)時間短，生產(chǎn)成

8、本高，基因工程表達(dá)產(chǎn)物純化繁雜等不足，此外痘苗病毒還有可能產(chǎn)生毒力回升，造成極大的安全隱患。由于生長抑素分子量小(1658 kda)，免疫原性弱，生長抑素常規(guī)免疫時都要與蛋白載體偶聯(lián)或與蛋白基因等重組以增強生長抑素的免疫原性。近來，大量的研究證實乙肝表面抗原（hbsag）s區(qū)的第112與l13氨基酸密碼之間可以插入10-20個氨基酸殘基的dna片段，s區(qū)的3末端也可以嵌合外源基因片段，都不影響多聚體顆粒的形成，并且能將外源抗原決定簇呈現(xiàn)在顆粒外表面8-9。鑒于此，曹少先構(gòu)建了雙拷貝生長抑素dna疫苗pcs/2ss，免疫后大鼠后，抗體陽性率達(dá)到60%10。但是該表達(dá)載體都是以抗性基因作為選擇壓力

9、的，雖然在體外的分子生物學(xué)研究中非常有用，但在人和動植物體內(nèi)無法實現(xiàn)，而且含抗藥基因的質(zhì)粒是導(dǎo)致臨床抗藥菌株播散的主要原因之一；同時抗生素的使用是基因工程產(chǎn)品制備過程中造成潛在痕量過敏現(xiàn)象發(fā)生的重要來源。染色體-質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)的出現(xiàn)很好的解決了這個難題，它的宿主菌通常是一類染色體突變體，突變的基因是細(xì)菌的管家基因，因其編碼的產(chǎn)物為細(xì)菌生長繁殖所必需，故該基因的缺陷必然導(dǎo)致細(xì)菌死亡，該缺陷型菌株表現(xiàn)為不能在基本培養(yǎng)基上生長12-13；當(dāng)導(dǎo)入帶有其完整基因的互補質(zhì)粒后，質(zhì)粒與缺陷型菌株即以遺傳互補的方式共同構(gòu)成染色體-質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)，含有互補質(zhì)粒的缺陷菌可在基本培養(yǎng)基上生長14。此時，互補質(zhì)粒

10、對其宿主菌的生長成為必需，一旦質(zhì)粒丟失，細(xì)菌則由于不能合成必需物質(zhì)而死亡，因此，凡是能在基本培養(yǎng)基上生長的缺陷菌株必定含有重組質(zhì)粒。鑒于此，本實驗室將平衡致死體系引入生長抑素基因疫苗，構(gòu)建了非抗性篩選的生長抑素真核表達(dá)質(zhì)粒pgs/2ss-asd，并轉(zhuǎn)化至缺失asd基因的減毒豬霍亂沙門氏菌c500中。本研究的目的就是將該新型疫苗免疫育肥豬，通過間接elisa法檢測抗生長抑素抗體，探討其免疫效果15。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 質(zhì)粒和菌株 缺失asd基因的減毒豬霍亂沙門氏菌c500和pgs/2ss -asd質(zhì)粒11均由實試驗室保存。pgs/2ss -asd質(zhì)粒的構(gòu)建圖如下： 1.1.2

11、實驗試劑 pbs溶菌液為ph 7.4、10mmol/l的磷酸鹽緩沖液，lb培養(yǎng)基為胰化蛋白胨、酵母提取物和氯化鈉組成的液體培養(yǎng)基，dap（二氨基庚二酸）過濾除菌，包被緩沖液為ph 9.6、50 mmol/l碳酸鹽緩沖液，封閉液為5%的脫脂牛奶溶液，pbs稀釋液為ph 7.2、10mmol/l的磷酸鹽緩沖液，兔抗豬igg-hrp，洗滌液為0.05%吐溫-20水溶液，tmb顯色液，2 mol/l硫酸終止液。1.1.3 實驗儀器 恒溫水浴搖床；酶標(biāo)儀；恒溫培養(yǎng)箱；冷凍離心機；微量加樣器。1.1.4 實驗動物 60日齡育肥豬，選自武漢附近商品化豬場。1.2 疫苗準(zhǔn)備和免疫方法1.2.1 疫苗準(zhǔn)備 挑取

12、pgs/2ss asd和c500單菌落分別接種于液體lb培養(yǎng)基，37，200 r/min振搖培養(yǎng)至od600為0.3-0.4，4 3000 r/min離心10 min，棄上清，用滅菌的pbs調(diào)整細(xì)菌濃度至21011 cfu/ml，備用。1.2.2 免疫方法 選60日齡育肥豬90只，均分為6組，每組15只。第1組（t1）灌注pgs/2ss -asd菌液，濃度為2108 cfu/ml，第2組（t2）灌注pgs/2ss-asd菌液，濃度為2109 cfu/ml，第3組（t3）灌注pgs/2ss -asd菌液，濃度為21010 cfu/ml，第4組（t4）灌注pgs/ss -asd菌液，濃度為2101

13、1 cfu/ml，第5組（c1）灌注c500空菌組，第6組（c2）為空白對照組，灌注滅菌pbs溶液。分別于免疫前12h和4h禁食、禁水，并在免疫前30 min，預(yù)先灌注（5ml/只）7.5%的nahco3以中和胃酸，然后進(jìn)行免疫，劑量為10ml/只。初次免疫4周后以相同劑量、相同方法加強免疫一次，再次免疫4周后以相同劑量、相同方法再加強免疫一次。待添加的隱藏文字內(nèi)容11.3血樣制備每次免疫1周后對育肥豬進(jìn)行頸靜脈采血，血液收集后，室溫靜置3 h，4冰箱過夜，然后3000 r/min離心30 min，分離血清，分裝后置于20 冰箱備用16。1.4 抗生長抑素抗體檢測包被生長抑素抗原每孔100ng

14、/100l，4過夜，棄反應(yīng)液，用pbst液洗3次；加封閉液100l/孔，37反應(yīng)1.5h，棄反應(yīng)液，用pbst洗滌3次；1/25,1/50,1/100, 1/200,1/400, 1/800,1/1600的濃度梯度（用封閉液稀釋）加待測血清100l/孔，同時設(shè)對照孔（調(diào)零孔：不加任何反應(yīng)液；非特異性吸附孔：用pbs緩沖液代替血清，37反應(yīng)1 h，棄反應(yīng)液，洗滌3次；加兔抗豬igg-hrp（1：2000稀釋），每孔100l，37反應(yīng)1 h，棄反應(yīng)液，洗滌3次；加底物液，每孔150l，37 反應(yīng)25 min；加2 mol/l硫酸終止反應(yīng)，每孔50l；od450讀數(shù)。2 結(jié)果與分析 2.1非抗性篩選

15、生長抑素免疫育肥豬后試驗組與對照組抗體水平比較 通過間接elisa法對各個試驗組和對照組的血樣進(jìn)行檢測，用滴度倒數(shù)的平均值來表示。由圖1可以看出：初免后一周，試驗組的抗體效價水平明顯高于對照組，第二次免疫后，試驗組的抗體效價水平下降，水平在c2對照組與c1對照組之間。第三次免疫后，試驗組的抗體效價水平繼續(xù)下降，最終下降到與對照組幾乎同一水平。 圖1 試驗組與對照組抗ss抗體水平檢測說明：t1-4為試驗組分別免疫不同濃度的生長抑素（ss）基因融合真核表達(dá)質(zhì)粒pgs/2ss asd，c1,c2組為對照組，分別免疫c500空菌與pbs，每組結(jié)果均用滴度的倒數(shù)平均值表示。2.2 不同劑量的pgs/2s

16、sasd質(zhì)粒免疫各組育肥豬抗體水平通過間接elisa法對不同免疫劑量的血樣進(jìn)行檢測，用滴度倒數(shù)的平均值來表示。圖2顯示：初次免疫一周后，t1組抗體效價最高，第二次加強免疫之后，t3和t4組的抗體效價有所提高，效價水平在t1,t2組之上。在初次免疫一周至五周的這段時間里，t3,t4組的抗體效價表現(xiàn)出較明顯的上升趨勢，t1和t2組的抗體效價表現(xiàn)出下降的趨勢，特別是t1組。第三次免疫后，4組抗體效價均呈現(xiàn)下降趨勢，初免后第九周，t1,t2組效價水平最低，t3組效價水平高于t2組。 圖2不同劑量試驗組抗ss抗體水平檢測說明：t1-t4為實驗組分別免疫不同濃度的生長抑素（ss）基因融合真核表達(dá)質(zhì)粒pgs

17、/2ss asd，濃度依次為：2108 cfu/ml；2109 cfu/ml；21010 cfu/ml；21011 cfu/ml，每組結(jié)果均用滴度的倒數(shù)平均值表示。3 討論3.1非抗性篩選生長抑素試驗組與對照組之間的抗體效價比較。從試驗結(jié)果圖1可以看出，非抗性篩選生長抑素pgs/2ss-asd作為一種重組型的基因疫苗能夠有效的刺激生長育肥豬產(chǎn)生抗生長抑素的抗體。從而在理論與實際上驗證了生長抑素的促生長工作原理.從試驗分析圖中得出：所有試驗組的抗體水平在生長初期即70日齡-90日齡期間能夠有效的刺激機體產(chǎn)生抗體且高于試驗對照組的平均水平，而在90日齡-150日齡即出欄前期，生長抑素抗體效價出現(xiàn)回

18、落，且低于試驗對照組的平均水平。原因可能有以下主要兩點：1，育肥豬在生長后期可能自身生長激素增加，因此相對于外源性基因免疫而引起的反應(yīng)應(yīng)答不明顯。2，免疫劑量不夠。我們的育肥豬免疫試驗是在大量的實驗室模式動物（小白鼠）的基礎(chǔ)之上而進(jìn)行的擴(kuò)大性生產(chǎn)試驗，舒鄧群等17利用gm-csf與ss的融合表達(dá)質(zhì)粒在大鼠與小鼠的動物試驗基礎(chǔ)上已經(jīng)確定了2108 cfu/ml是比較合適的免疫劑量。而未有試驗提及育肥豬生長試驗，加之本身研究生長抑素基因疫苗的研究較少。而未有文獻(xiàn)提及適合的免疫劑量，因此此次試驗也是為以后的擴(kuò)大性生產(chǎn)試驗摸索條件。3.2免疫劑量對免疫效果的影響國外學(xué)者曾以減毒沙門氏菌為載體在真核細(xì)胞

19、中成功地表達(dá)了lacz基因、綠色熒光蛋白(gfp)基因、hiv-gp140基因、李斯特菌溶血素基因等18-21，結(jié)果證實：利用減毒沙門氏菌作為載體傳遞dna疫苗具有良好的免疫原性。本文正是以減毒的豬霍亂沙門氏菌為載體傳遞生長抑素基因，并取得了較理想的免疫效果?；蛎庖叩膭┝咳Q于疫苗的轉(zhuǎn)染效率和抗原提呈的效率，而它們又受多方面因素的影響。本研究表明劑量的不同在一定程度上增加了抗體水平，在前期即70日齡-90日齡期間t1組（2108 cfu/ml）抗體效價最高，而在后期降至低點。t3,t4組在后期免疫應(yīng)答水平達(dá)到較高。因此不能簡單的定論高劑量或者低劑量為育肥豬的合適免疫劑量。具體免疫條件與免疫周

20、期還需要進(jìn)一步的摸索。4 小結(jié)本研究表明用pgs/2ss-asd基因疫苗免疫育肥豬在免疫初期可以檢測到高水平的抗生長抑素抗體。進(jìn)一步推測出此dna疫苗免疫大動物可以很好地促進(jìn)動物的生長，在動物促生長方面具有相當(dāng)大的應(yīng)用前景，但是pgs/2ss-asd基因疫苗的安全性以及最適免疫劑量還有待進(jìn)一步的研究。參考文獻(xiàn)1. spencer gsg, garssen gj. increased growth in lambs following immunization against somatostatin: preliminary observations. anim prod, 1981, 32:

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