分子熒光分析法

1、分子熒光分析法 主講：王姣亮 第一節(jié) 基本原理 物質(zhì)分子的能級(jí)包括一系列電子 能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。 一、熒光的產(chǎn)生一、熒光的產(chǎn)生 圖1 熒光、磷光能級(jí)圖 分子吸收能量后，從基態(tài)最低振動(dòng)能 級(jí)躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)或更高電子 激發(fā)態(tài)的不同振動(dòng)能級(jí)（這一過程速 度很快，大約10-15 s），成為激發(fā)單 重態(tài)分子。激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，可以 通過以下幾種途徑釋放能量返回基態(tài)。 1. 振動(dòng)馳豫 這一過程只能發(fā)生在同一電子能級(jí) 內(nèi)，即分子通過碰撞以熱的形式損失部 分能量，從較高振動(dòng)能級(jí)下降到該電子 能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)上。由于這一部分 能量以熱的形式釋放，而不是以光輻射 形式發(fā)出，故振動(dòng)馳豫屬于無輻射躍遷

2、。 2. 內(nèi)轉(zhuǎn)換 即激發(fā)態(tài)分子將多余的能量轉(zhuǎn)變 為熱能，從較高電子能級(jí)降至較低的 電子能級(jí)。內(nèi)轉(zhuǎn)換也屬于無輻射躍遷。 3. 熒光 較高激發(fā)態(tài)分子經(jīng)無輻射躍遷降 至第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能 級(jí)后，仍不穩(wěn)定，停留較短時(shí)間后 （約10-8 s，稱作熒光壽命），以光 輻射形式放出能量，回到基態(tài)各振動(dòng) 能級(jí)，這時(shí)所發(fā)射的光稱為熒光。當(dāng) 然也可以無輻射躍遷形式返回基態(tài)。 4. 系間竄躍 有些物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子通過振動(dòng)馳豫和內(nèi) 轉(zhuǎn)換下降到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)后， 有可能經(jīng)過另一個(gè)無輻射躍遷轉(zhuǎn)移至激發(fā)三重 態(tài)，這一過程伴隨著自旋方向的改變，稱為系 間竄躍。對于大多數(shù)物質(zhì)，系間竄躍是禁阻的。 如果分

3、子中有重原子（如I、Br等）存在，由 于自旋-軌道的強(qiáng)偶合作用，電子自旋方向可 以改變，系間竄躍就變得容易了。 5. 磷光 經(jīng)系間竄躍的分子再通過振動(dòng)馳豫降至 激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，停留一段時(shí)間 （10-410 s，稱作磷光壽命），然后以光輻 射形式放出能量返回到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，這時(shí) 發(fā)出的光稱為磷光（phosphorescence）。由于 激發(fā)三重態(tài)能量比激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)能 量低，故磷光輻射的能量比熒光更小，即磷光 的波長比熒光更長。 二、激發(fā)光譜和熒光光譜 （一）熒光的檢測 光源發(fā)出的紫外可見光通過激發(fā) 單色器分出不同波長的激發(fā)光， 照射到樣品溶液上，激發(fā)樣品產(chǎn) 生熒光。樣品發(fā)出

4、的熒光為寬帶 光譜，需通過發(fā)射單色器分光后 再進(jìn)入檢測器，檢測不同發(fā)射波 長下的熒光強(qiáng)度F。由于激發(fā)光 不可能完全被吸收，可透過溶液， 為了防止透射光對熒光測定的干 擾，常在與激發(fā)光垂直的方向檢 測熒光（因熒光是向各個(gè)方向發(fā) 射的）。 （二）激發(fā)光譜與熒光發(fā)射光譜的形成 任何熒光物質(zhì)，都具有兩種特征 光譜，即激發(fā)光譜(excitation spectrum)和熒光發(fā)射光譜 (fluorescence emission spectrum)。 1. 激發(fā)光譜 保持熒光發(fā)射波長不變（即固定發(fā) 射單色器），依次改變激發(fā)光波長（即 調(diào)節(jié)激發(fā)單色器），測定不同波長的激 發(fā)光激發(fā)下得到的熒光強(qiáng)度F（即激發(fā)光

5、 波長掃描）。然后以激發(fā)光波長為橫坐 標(biāo)，以熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)作圖，就可得 到該熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。 激發(fā)光譜上熒光強(qiáng)度最大值所對 應(yīng)的波長就是最大激發(fā)波長，是激發(fā) 熒光最靈敏的波長。物質(zhì)的激發(fā)光譜 與它的吸收光譜相似，所不同的是縱 坐標(biāo)。 2. 熒光光譜 熒光光譜，又稱發(fā)射光譜。保持激發(fā) 光波長不變（即固定激發(fā)單色器），依次 改變熒光發(fā)射波長，測定樣品在不同波長 處發(fā)射的熒光強(qiáng)度F。以發(fā)射波長為橫坐 標(biāo)，以熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)作圖，得到熒 光發(fā)射光譜。熒光發(fā)射光譜上熒光強(qiáng)度最 大值所對應(yīng)的波長就是最大發(fā)射波長。 圖2 蒽在乙醇溶液中的激發(fā) 光譜（-）和發(fā)射光譜 （三）發(fā)射光譜與激發(fā)光譜的關(guān)系

6、1.發(fā)射光譜形狀與激發(fā)光波長無關(guān) 由 于熒光是分子從第一電子激發(fā)態(tài)的最 低振動(dòng)能級(jí)返回到基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí) 時(shí)釋放的光輻射，與分子被激發(fā)至哪 一個(gè)電子激發(fā)態(tài)無關(guān)。 2.發(fā)射光譜比激發(fā)光譜波長為長 由于分子吸收激發(fā)光被激發(fā)至較 高激發(fā)態(tài)后，先經(jīng)無輻射躍遷（振動(dòng) 馳豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換）損失掉一部分能量， 到達(dá)第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)， 再由此發(fā)出熒光。因此，熒光發(fā)射能 量比激發(fā)光能量低，發(fā)射光譜波長比 激發(fā)光波長長。 3.鏡像對稱 對于高度對稱的有機(jī)分子，其熒光發(fā) 射光譜與吸收光譜呈鏡像對稱關(guān)系。 解釋1：能級(jí)結(jié)構(gòu)相似性 熒光為第一電子激發(fā)單重態(tài)的最 低振動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能 級(jí)而形成，即其形狀

7、與基態(tài)振動(dòng)能級(jí) 分布有關(guān)。 激發(fā)光譜是由基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí) 躍遷到第一電子激發(fā)單重態(tài)的各個(gè)振 動(dòng)能級(jí)而形成，即其形狀與第一電子 激發(fā)單重態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布有關(guān)。 由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分 布具有相似性，因而呈鏡像對稱。 S1 S0 三、影響熒光產(chǎn)生及熒光強(qiáng)度的因素影響熒光產(chǎn)生及熒光強(qiáng)度的因素 （一）物質(zhì)產(chǎn)生熒光的必要條件 一種物質(zhì)能否發(fā)熒光以及熒光強(qiáng)度 的高低，與它的分子結(jié)構(gòu)及所處的環(huán)境 密切相關(guān)。能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)都應(yīng)同 時(shí)具備兩個(gè)條件： 1. 物質(zhì)分子必須有強(qiáng)的紫外吸收（有 *躍遷）； 2. 物質(zhì)具有較高的熒光效率 （fluorescence efficiency）。熒光效率 也稱熒光量子

8、產(chǎn)率，用f 表示。 可見，凡是使 kF 增加，使其它去活化 常數(shù)降低的因素均可增加熒光量子產(chǎn) 率。通常，kF 由分子結(jié)構(gòu)決定（內(nèi) 因），而其它參數(shù)則由化學(xué)環(huán)境和結(jié) 構(gòu)共同決定。 F f FVRICISCECP k kkkkkk 發(fā)射的熒光量子數(shù) 吸收的光量子數(shù) （二）影響熒光及其強(qiáng)度的因素。 躍遷類型：如上所述，物質(zhì)必須在紫 外可見區(qū)有強(qiáng)吸收和高熒光效率才能 產(chǎn)生熒光。具有* 躍遷的分子才 有強(qiáng)吸收。* 躍遷的大。 共軛效應(yīng)：大多數(shù)能產(chǎn)生熒光的物 質(zhì)都含有芳香環(huán)或雜環(huán)，具有共軛 的* 躍遷。其共軛程度愈大， 熒光效率也愈大，且最大激發(fā)和發(fā) 射波長都向長波長方向移動(dòng)，如苯、 萘、蒽三種物質(zhì)。 苯

9、萘蒽維生素A 205nm286nm356nm327nm 278nm321nm404nm510nm 0.110.290.36 ex em 剛性平面結(jié)構(gòu)：當(dāng)熒光分子共軛程度 相同時(shí)，分子的剛性和共平面性越大， 熒光效率越大。 O -O O COO- 熒光物質(zhì)（熒光素） -O O COO- 非熒光物質(zhì)（酚酞） 芴（=1.0） 聯(lián)苯（=0.2） 有些物質(zhì)本身不發(fā)熒光或熒光較 弱，但和金屬離子形成配合物后，如 果剛性和共平面性增加，就可以發(fā)熒 光或增強(qiáng)熒光。如8-羥基喹啉是弱熒 光物質(zhì)，與Mg2+、Al3+ 等金屬離子形 成的配合物的熒光增強(qiáng)，利用這一特 點(diǎn)可以間接測定金屬離子。 N OH 8-羥基喹啉

10、 N O Al /3 8-羥基喹啉-鋁 取代基團(tuán) 熒光分子上的各種取代基對分子的熒光光 譜和熒光強(qiáng)度都有很大影響。給電子取代基 如NH2、OH、OCH3、CN、 NHR、NR2等，能增加分子的電子共軛程度， 使熒光效率提高。而-COOH、NO2、 C=O、F、Cl等吸電子取代基，可減弱分子 電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。還有一類 取代基則對熒光的影響不明顯，如R、 SO3H、NH3 等。 溫度 溫度對被測溶液的熒光強(qiáng)度有明 顯的影響。當(dāng)溫度升高時(shí)，介質(zhì)粘度 減小，分子運(yùn)動(dòng)加快，分子間碰撞幾 率增加，從而使分子無輻射躍遷增加， 熒光效率降低。故降低溫度有利于提 高熒光效率及熒光強(qiáng)度。 由于熒光

11、儀器光源的光強(qiáng)度大、溫度較高，容 易引起溶液溫度升高，加之分析過程中室溫可 能發(fā)生變化，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度改變。另外， 有些熒光物質(zhì)的溶液在激發(fā)光較長時(shí)間的照射 下，還會(huì)發(fā)生光分解，使熒光強(qiáng)度下降。因此， 試樣不應(yīng)長時(shí)間受光照射，只在測定熒光強(qiáng)度 時(shí)才打開光閘，其余時(shí)間應(yīng)關(guān)閉。在較高檔的 熒光分光光度計(jì)中，樣品室四周設(shè)有冷卻水套 或配有恒溫裝置，以使溶液的溫度在測定過程 中保持恒定。 溶劑：同一種熒光物質(zhì)在不同的溶 劑中，其熒光光譜的位置和熒光強(qiáng) 度可能會(huì)有一定的差別，尤其是那 些分子中含有極性取代基的熒光物 質(zhì)，它們的熒光光譜易受溶劑的影 響。 溶劑的影響可以分為一般溶劑效應(yīng) 和特殊溶劑效應(yīng)。

12、一般溶劑效應(yīng)是 指溶劑極性的影響。通常情況下， 隨著溶劑極性增大，* 躍遷所 需的能量差E減小，躍遷幾率增加， 從而使熒光波長長移，熒光強(qiáng)度增 大。 一般而言， 探針激發(fā)態(tài)的偶極矩大于基態(tài) 偶極矩， 當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)后， 溶劑的偶 極子在激發(fā)態(tài)的熒光基團(tuán)的周圍重新定向而 降低激發(fā)態(tài)的能量，溶劑的極性越大，熒光 團(tuán)激發(fā)態(tài)能量降低的越多， 因而從激發(fā)態(tài) 躍遷回基態(tài)時(shí)發(fā)射的能量越低， 發(fā)射的波 長就越長 特殊溶劑效應(yīng)是指溶劑與熒光物質(zhì)形成 化合物，或溶劑使熒光物質(zhì)的電離狀態(tài) 改變，使熒光峰的波長和熒光強(qiáng)度都發(fā) 生較大變化。如在萘胺的乙醇溶液中加 入鹽酸，隨著溶液中鹽酸濃度的增加， 萘胺的NH2基逐漸

13、被NH3Cl基所代替， 而NH3Cl基對萘環(huán)特征頻率的影響小 于NH2，因此溶液的熒光光譜趨近于 萘的熒光光譜。 pH值：溶液的酸度（pH值）對熒光 物質(zhì)的影響可以分兩個(gè)方面： 1若熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時(shí)， 溶液pH值改變，物質(zhì)分子和其離子 間的平衡也隨之發(fā)生變化，而不同 形體具有其各自特定的熒光光譜和 熒光效率。例如苯胺 NH3+ NH2 OH- H+ OH- H+ NH- PH13 無熒光（離子形式） 2. 對于金屬離子與有機(jī)試劑生成的熒光配 合物，溶液pH值的改變會(huì)影響配合物的組 成，從而影響它們的熒光性質(zhì)。例如Ga3+離 子與鄰-二羥基偶氮苯，在pH34的溶液中 形成1:1配合物，

14、能產(chǎn)生熒光。而在pH67 的溶液中，則形成12的配合物，不產(chǎn)生熒 光。 總之，溶液pH值對熒光物質(zhì)的熒光光 譜、熒光效率及熒光強(qiáng)度均有影響。需通 過條件實(shí)驗(yàn)找出pH與熒光強(qiáng)度的關(guān)系，確 定最適宜的pH范圍，以提高分析的靈敏度 和準(zhǔn)確度。 Chapter 2 Fluorescence signaling mechanisms 1、 Photoinduced electron transfer，PET 2、 Intramolecular Charge Transfer，ICT 3、 Frster Resonance Energy Transfer, FRET 4、 Monomer/Excimer

15、5、 Through-Bond Energy Transfer，TBET 6、 Excited-State Intramolecular Proton Transfer，ESIPT 內(nèi)容提要： Photoinduced electron transfer， PET 典型的光誘導(dǎo)電子(Photoinduced electron transfer， PET)轉(zhuǎn)移體系是由包含電子給體的受體部分 R(receptor)，通過間隔基S(spacer，-CH2-)和熒光團(tuán) F(fluorophore)相連而構(gòu)成的。其中熒光團(tuán)部分是能 吸收光和熒光發(fā)射的場所，受體部分則用來結(jié)合客 體，這兩部分被間隔基隔開，

16、又靠間隔基相連而成 一個(gè)分子，構(gòu)成了一個(gè)在選擇性識(shí)別客體的同時(shí)又 給出光信號(hào)變化的超分子體系。 Fig1 The principle of guest recognition by PET fluorescent molecular probe PET mechanism PET熒光分子探針中，熒光團(tuán)與受體單元之間存在 著光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移，對熒光有非常強(qiáng)的淬滅作用， 通常是電子從供體轉(zhuǎn)移到激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)(還原型 PET)。因此在未結(jié)合客體之前，探針分子不發(fā)射熒 光，或熒光很弱。一旦受體與客體相結(jié)合，光誘導(dǎo) 電子轉(zhuǎn)移作用受到抑制，甚至被完全阻斷，熒光團(tuán) 就會(huì)發(fā)射熒光。 Fig.2 Frontier

17、orbital energy diagrams illustrating the mechanism of PET PET mechanism 當(dāng)電子給體被激發(fā)時(shí)，引入的電子受體就可作為淬滅 劑，通過LUMO軌道的電子轉(zhuǎn)移，引起熒光淬滅。 電子轉(zhuǎn)移 HOMO LUMO 激發(fā)分子為 電子給體 淬滅劑為 電子受體 熒光淬滅和 生成離子自由基 HOMO LUMO h Fig.2 Frontier orbital energy diagrams illustrating the mechanism of PET 當(dāng)電子受體被激發(fā)時(shí)，引入的電子給體就可作為淬滅 劑，通過HOMO軌道的電子轉(zhuǎn)移，引起熒光淬

18、滅。 電子轉(zhuǎn)移 HOMO LUMO 激發(fā)分子為 電子受體 淬滅劑為 電子給體 熒光淬滅和 生成離子自由基 HOMO LUMO h PET應(yīng)用到傳感器上需要的條件： 一、傳感器分子中要包含一個(gè)熒光團(tuán)，其應(yīng)具有高 的量子產(chǎn)率； 二、還應(yīng)包含電子給體（Electron Donor），可以 發(fā)生向熒光團(tuán)的 PET 過程； 三、當(dāng)結(jié)合目標(biāo)分子（或離子）后，會(huì)引發(fā)或抑制 電子給體與電子受體間的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移，引起熒 光團(tuán)熒光猝滅或熒光恢復(fù)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)報(bào)告目的。 基于PET過程的陰離子識(shí)別與傳感 此分子為首例利用PET機(jī)理識(shí)別陰離子的熒光分子 傳感器。其以蒽為熒光團(tuán)，多胺陽離子為陰離子的 識(shí)別位點(diǎn)。在進(jìn)行陰離

19、子識(shí)別前，先對多胺進(jìn)行部 分質(zhì)子化，殘留一個(gè)自由氨基作為熒光團(tuán)蒽的猝滅 劑。當(dāng)HPO42的加入后，其羥基與殘余氨基孤對電 子結(jié)合后，阻斷了PET的發(fā)生，可使蒽熒光得到恢 復(fù)，表現(xiàn)為受體分子熒光顯著增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)在在pH = 6 的水中選擇性識(shí)別磷酸氫根離子(HPO42 )。 選擇性識(shí)別HPO4-的熒光傳感器 選擇性識(shí)別HPO4-的熒光傳感器 PET PET 選擇性識(shí)別CH3COO-的熒光傳感器 受體分子以硫脲鹽類為陰離子識(shí)別位點(diǎn)，熒光團(tuán)為 萘。在激發(fā)態(tài)時(shí)，會(huì)發(fā)生從萘向硫脲鹽方向的PET 過程， 致使萘的熒光被猝滅，在乙腈中， 陰離子 如AcO與硫脲鹽以靜電吸引和多重氫鍵協(xié)同作用結(jié) 合后，提高了硫脲

20、鹽的還原電位，阻斷了PET的發(fā) 生，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)在水中識(shí)別HPO42 和AcO，其與HPO42形成2:1的配合物。 選擇性識(shí)別CH3COO-的熒光傳感器 PET 選擇性識(shí)別Hg2+的熒光傳感器 受體分子3是選擇性識(shí)別Hg2+的PET傳感器。 萘酰亞 胺是分子3的熒光團(tuán)， 2，6-二胺甲基吡啶上的氮原子 既是熒光團(tuán)的猝滅基又是金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)，其半 剛性結(jié)構(gòu)可增強(qiáng)與金屬離子結(jié)合的選擇性。在 pH=6.98的HCl-Tris緩沖溶液中受體自身的熒光較弱， 熒光量子產(chǎn)率為0.007，過渡金屬離子中的Zn2+、Cd2+、 Ag+和Pb2+均能使3的熒光不同程度的增強(qiáng)(/0 3)， 唯有H

21、g2+使其的熒光增強(qiáng)17倍，其它金屬離子的加入 并不影響3的熒光行為。受體分子中的羥基可增加分 子的水溶性， 可實(shí)現(xiàn)水相中的Hg2+ 選擇性識(shí)別。 PET 選擇性識(shí)別Hg2+的熒光傳感器 同樣為選擇性識(shí)別Hg2+的熒光傳感器，受體4以熒 光素為熒光團(tuán)，同時(shí)在受體中引入硫原子以增加與 Hg2+的結(jié)合能力。在pH = 7的緩沖溶液中，受體4 存在從苯胺到熒光素的PET過程，熒光量子產(chǎn)率僅 為0.04。隨著Hg2+的加入，苯胺到熒光素的PET過 程被抑制，受體的熒光強(qiáng)度增加5倍，光譜略有紅 移。干擾實(shí)驗(yàn)表明除Cu2+外，其它金屬離子的存在 對Hg2+的檢測并不干擾。 Frster Resonance

22、 Energy Transfer,FRET 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Frster resonance energy transfer， FRET)是指在兩個(gè)不同的熒光團(tuán)中，如果一個(gè)熒光團(tuán) (Doner)的發(fā)射光譜和另一個(gè)熒光團(tuán)(Aceptor)的吸 收光譜有一定的重疊，當(dāng)這兩個(gè)熒光團(tuán)間的距離合 適時(shí)(一般小于100)，就可以觀察到熒光能量由供 體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，即用供體的激發(fā)波長激發(fā)時(shí)， 可觀察到受體的熒光發(fā)射。進(jìn)一步講，就是在供體 的激發(fā)狀態(tài)下由一對偶極子介導(dǎo)的能量從供體向受 體轉(zhuǎn)移的過程。此過程沒有光子的參與，所以是非 輻射性的。 按照Frsters理論 影響共振能量轉(zhuǎn)移效率的因素 一、供體的

23、發(fā)射光譜與受體的吸收光譜重疊程度 二、供體與受體間的距離 三、供體與受體的躍遷偶極的相對取向 選擇性識(shí)別F-的熒光傳感器 受體分子5是利用共振能量轉(zhuǎn)移原理識(shí)別F的傳感器。 在四氫呋喃溶液中，以 294nm（三芳基硼的吸收帶） 激發(fā)，只觀察到位于 670nm 的卟啉的熒光發(fā)射峰而觀 測不到三芳基硼基團(tuán)的熒光發(fā)射， 說明發(fā)生了從三芳 基硼到卟啉的能量轉(zhuǎn)移過程。氟離子加入后與硼反應(yīng)， 使硼原子的雜化軌道由 sp2變?yōu)?sp3，進(jìn)而減弱了體系 的共軛，阻斷了能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生，于是產(chǎn)生兩個(gè)新 的熒光峰，分別位于356 nm（三芳基硼的發(fā)射）和 692nm（卟啉的發(fā)射），而位于670nm 處的熒光強(qiáng)度 減弱

24、，說明由三芳基硼到卟啉的能量轉(zhuǎn)移被阻斷。因 此該體系可用于比值法檢測氟離子。 選擇性識(shí)別Na+的熒光傳感器 分子6中，芘為能量供體，蒽-9-羧酸酯為能量受 體，杯芳烴為Na+的結(jié)合位點(diǎn)。在甲醇-四氫呋喃 (15:1)的混合溶劑中，可同時(shí)觀察到芘和蒽-9-羧 酸酯的熒光發(fā)射。隨著Na+的加入，相對于芘的熒 光發(fā)射，蒽-9-羧酸酯的熒光增強(qiáng)程度更大，說明 Na+的加入使芘與蒽-9-羧酸酯間的距離減小，能 量轉(zhuǎn)移效率提高。 識(shí)別F-,HPO4-的熒光傳感器 受體分子7未結(jié)合陰離子時(shí)存在從芘（能量供體） 到 2,3-二吡咯-喹喔啉（能量受體）的共振能量轉(zhuǎn)移， 以 325nm（芘的吸收帶）激發(fā)，觀察到位

25、于 495nm 的2,3-二吡咯-喹喔啉的強(qiáng)熒光發(fā)射峰。隨著陰離子 （F或 HPO42）的加入，2,3-二吡咯-喹喔啉的熒光 強(qiáng)度減弱，且其吸收光譜也發(fā)生變化，表明 FRET 過程受到抑制。 通過對比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)跟單獨(dú)的 2,3- 二吡咯-喹喔啉相比，受體7 通過FRET進(jìn)行傳感的 靈敏度有所提高。 選擇性識(shí)別Al3+的熒光傳感器 受體分子8利用結(jié)合前后供體的發(fā)射光譜與受體的吸 收光譜重疊程度的不同，從而選擇性進(jìn)行Al3+的傳 感。分子中鄰羥基苯基三唑自身不發(fā)熒光，與Al3+ 結(jié)合后熒光有所增強(qiáng)（盡管仍很弱），但其發(fā)射光 譜與香豆素343的吸收光譜重疊程度大為增加，能量 轉(zhuǎn)移效率提高，達(dá)到信號(hào)放

26、大之目的。在甲醇-水 （1:1）的pH 5.0緩沖溶液中，以350 nm光激發(fā)受體8 （鄰羥基苯基三唑的吸收峰）， Al3+ 的加入使香豆 素343的熒光增強(qiáng)7倍，檢測限為50 nM，其它金屬 離子除Cu2+和Fe3+使受體8熒光猝滅外，對測定無影 響。 激基締合物（excimer） 如果兩個(gè)相同的熒光團(tuán)(主要是多環(huán)芳烴)之間的距離 和位置合適，當(dāng)其中一個(gè)熒光團(tuán)被激發(fā)以后就會(huì)和另 外一個(gè)處于基態(tài)的熒光團(tuán)形成激基締合物(excimer)， 其熒光發(fā)射光譜的特征表現(xiàn)是原來單體的發(fā)射峰減弱 或者消失，取而代之的是一個(gè)新的、強(qiáng)而寬的、長波 長的無振動(dòng)精細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)射峰。由于形成這種激基締合 物需要激發(fā)態(tài)分

27、子與基態(tài)分子達(dá)到“碰撞”距離約 3.5,因此熒光團(tuán)間的距離是激基締合物形成和破壞 的關(guān)鍵。 利用各種分子間作用力改變兩個(gè)熒光團(tuán)之 間的距離和取向，如用結(jié)合客體前后單體 激基締合物的熒光光譜變化就能夠表達(dá) 客體被識(shí)別的信息。萘、蒽、芘等熒光團(tuán) 由于具有較長的激發(fā)單線態(tài)壽命，易形成 激基復(fù)合物，常常用于此類探針的設(shè)計(jì)中。 芘單體與激基締合物的熒光光譜 激基締合物的形成過程受擴(kuò)散控制，因此單體濃度 與溶劑粘度是締合物形成過程中的決定因素。當(dāng)單 體溶于烷烴溶劑且濃度低于105 mol /L時(shí)，通常觀 測到的為單體熒光。若受體分子中有兩相同的熒光 團(tuán)，其相對距離與受體和客體的結(jié)合有關(guān)，如受體 分子結(jié)合上

28、客體后，分子構(gòu)型發(fā)生變化，促進(jìn)激基 締合物的形成（圖 6）或破壞了單體本身的激基締 合物結(jié)構(gòu)，因此可通過單體與 excimer 間的熒光強(qiáng) 度比值來進(jìn)行客體的識(shí)別。 圖6. 客體與受體分子結(jié)合后促進(jìn)激基締合物的形成 基于monomer/excimer的陰離子識(shí)別 與傳感 分子以胍基為陰離子識(shí)別位點(diǎn)，芘為信號(hào)報(bào)告基團(tuán)，在甲醇 中，其只發(fā)射單體的熒光，隨著焦磷酸根離子的加入，導(dǎo)致 單體熒光猝滅和excimer熒光的形成和增強(qiáng)，原因在于焦磷酸 根離子與受體發(fā)生自組裝作用。其它陰離子無此現(xiàn)象，因而 該受體可選擇性地識(shí)別焦磷酸根離子 作為磷酸根離子傳感器，此分子采用了與上例相反的傳感模式。 它采用鉗型結(jié)

29、構(gòu)，以酰胺鍵為識(shí)別位點(diǎn)，可選擇性地識(shí)別磷酸根 離子。在四氫呋喃中發(fā)射雙重?zé)晒?，長波長的excimer熒光被認(rèn) 為來自不同側(cè)鏈的芘分子間的激發(fā)態(tài)相互作用。磷酸根離子的加 入與酰胺NH氫鍵結(jié)合，改變了分子構(gòu)型，使芘分子間距離增大， 導(dǎo)致excimer熒光減弱，單體熒光增強(qiáng)。 基于monomer/excimer的陽離子識(shí)別 與傳感 識(shí)別Zn2+的熒光傳感器巧妙地應(yīng)用變構(gòu)原理。在受體分子中，金屬配體（- NH2）與熒光團(tuán)（芘基）處于六元環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定的平伏鍵構(gòu)象結(jié)構(gòu)中。未結(jié) 合陽離子時(shí)分子的熒光主要為單體熒光； Zn2+的加入，誘使-NH2采取直立 鍵構(gòu)象，使之構(gòu)象發(fā)生翻轉(zhuǎn)，熒光團(tuán)芘也只能以直立鍵方式分

30、處上下兩端， 促進(jìn)excimer的形成，導(dǎo)致excimer熒光增強(qiáng)，單體熒光猝滅。 與前一分子相反， 此分子在未結(jié)合陽離子時(shí)，分子中的兩個(gè) 芘基彼此靠近、重疊，主要發(fā)射 excimer長波長熒光，陽離子 （Hg2+）與之配合后改變芘基的空間位置， 破壞之前的 excimer結(jié)構(gòu)，所以觀測到受體分子單體熒光增強(qiáng)，而excimer 熒光被猝滅。該受體對Hg2+ 的選擇性很好，而對其他金屬陽離 子的響應(yīng)很弱。 Intramolecular Charge Transfer，ICT 當(dāng)直接連有供電子基(通常是氨基)的熒光團(tuán) 和一個(gè)吸電子基共軛連接時(shí)，在光的激發(fā)下，分 子內(nèi)就會(huì)發(fā)生從電子供體到電子受體的電

31、荷轉(zhuǎn)移。 典型分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移熒光分子探針就是熒光團(tuán)上 連有強(qiáng)的吸電子基和供電子基的推-拉電子體系。 ICT熒光分子探針的受體往往是推-拉電子體系整 體中的一部分，相反，當(dāng)熒光團(tuán)上的受體在吸電子基 團(tuán)一端，也就是說，在推拉電子體系中拉電子的一端 時(shí)，和客體結(jié)合后，會(huì)增大體系推拉電子的能力，增 大電子的流動(dòng)性，吸收光譜紅移，摩爾消光系數(shù)增大。 原理上，熒光光譜的位移和吸收光譜的位移方向一致。 除了光譜的變化外，也能觀察到熒光量子產(chǎn)率和熒光 壽命的變化。所有這些光物理性能的變化決定于客體 的大小和電荷多少。 當(dāng)熒光團(tuán)上的受體(如氨基)在供電子基團(tuán)一端時(shí)， 和客體結(jié)合后會(huì)減少這個(gè)供電子基團(tuán)的供電能力，

32、 從而導(dǎo)致體系共軛程度降低，吸收光譜藍(lán)移，并 伴隨著摩爾消光系數(shù)的減小。 Intramolecular Charge Transfer，ICT 當(dāng)熒光團(tuán)上的受體在吸電子基團(tuán)一端，也就是說， 在推拉電子體系中拉電子的一端時(shí)，和客體結(jié)合 后，會(huì)增大體系推拉電子的能力，增大電子的流 動(dòng)性，吸收光譜紅移，摩爾消光系數(shù)增大。 Intramolecular Charge Transfer，ICT 問題：分子處于激發(fā)態(tài)為什么會(huì)發(fā)生電子轉(zhuǎn)移而 導(dǎo)致正負(fù)電荷分離呢？ 這是由分子激發(fā)態(tài)的性質(zhì)決定的。首先，激發(fā)態(tài) 的分子較基態(tài)具有更大的反應(yīng)活性，體現(xiàn)在其氧 化電位下降和還原電位提高，因此易于發(fā)生電子 的得失，為電子

33、轉(zhuǎn)移提供條件。其次，當(dāng)電子給 體與電子受體位于分子內(nèi)的共軛體系中時(shí)，無論 是給體被激發(fā)或是受體被激發(fā)，都會(huì)誘導(dǎo)從電子 給體到受體的電子轉(zhuǎn)移過程。隨著電子轉(zhuǎn)移的進(jìn) 行，分子內(nèi)會(huì)發(fā)生正負(fù)電荷的分離，表現(xiàn)為分子 偶極距的增大。 處于激發(fā)態(tài)上的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移態(tài)分子是不 穩(wěn)定的，具有正負(fù)電荷復(fù)合趨向而回到基態(tài)，要 是這個(gè)過程為輻射躍遷，就會(huì)伴隨 ICT熒光發(fā)射。 分子電荷轉(zhuǎn)移態(tài)的穩(wěn)定性受外界環(huán)境的影響較大， 凡是能穩(wěn)定正負(fù)電荷分離的因素將會(huì)降低電荷轉(zhuǎn) 移態(tài)的能量，導(dǎo)致 ICT熒光光譜紅移（例如溶劑 效應(yīng)），反之則會(huì)導(dǎo)致ICT光譜藍(lán)移。 氮雜冠醚有著雙重身份：既是推拉電子體系中的電子給體，又是探針 分子中

34、的識(shí)別基團(tuán)。當(dāng)冠醚與Ca2+絡(luò)合時(shí)，由于金屬離子的拉電子效 應(yīng)，降低了氮雜冠醚中氮原子的供電子能力，因此其吸收光譜發(fā)生較 大的藍(lán)移。熒光光譜也發(fā)生藍(lán)移，但比吸收光譜藍(lán)移得幅度要小。這 是由于光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移減少了冠醚上氮原子的電子云密度，這個(gè)氮原 子由于極化變?yōu)榉桥湮辉?。因此，光激發(fā)誘導(dǎo)冠醚上氮原子和金屬 離子之間的作用減弱或消失，從而使熒光光譜發(fā)生較小的藍(lán)移。 與Cd2+結(jié)合后，體系的顏色從淡藍(lán)色變?yōu)榉凵?，而且熒光發(fā)射波 長從656 nm藍(lán)移到597nm。隨著Cd2+ 濃度的增加，反應(yīng)體系在 656 nm和597 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度比值逐漸增大，并且這一比值 與Cd2+濃度在一定范圍內(nèi)呈線

35、性相關(guān)，同時(shí)在656 nm處觀察到一 個(gè)熒光等發(fā)射點(diǎn)。該探針的設(shè)計(jì)主要是基于分子結(jié)構(gòu)中的N，N-二 (吡啶-2-亞甲基)苯胺與Cd2+結(jié)合，從而使分子中的氨基失去供電 子能力，減弱了ICT過程的正常發(fā)生，導(dǎo)致分子的熒光發(fā)射波長藍(lán) 移。該方法已成功用于細(xì)胞中Cd2+含量的測定。 分子中含有兩個(gè)供電子基團(tuán)-NH-和兩個(gè)吸電子基團(tuán)-C=O， 受光激發(fā)，-NH-上的電子向-C=O轉(zhuǎn)移，形成ICT過程。在 乙醇水溶液(乙醇:水=4:6)中加入Cu2+，體系的最大熒光發(fā) 射波長藍(lán)移50 (從525 nm到475 nm)。而且隨著Cu2+濃度 的增加，475nm處的熒光發(fā)射逐漸增強(qiáng)，525 nm處的熒光 強(qiáng)

36、度逐漸降低，兩處的熒光發(fā)射強(qiáng)度比值與Cu2+濃度呈線 性相關(guān)。 加入Cd2+后，體系的顏色從綠色變?yōu)樗{(lán)色，而且熒光發(fā)射波 長發(fā)生藍(lán)移(531nm到487nm)，這是由于Cd2+直接與分子結(jié)構(gòu) 中的-NH結(jié)合，減弱了-NH的供電子能力；而加入Zn2+后，體 系的顏色從綠色變?yōu)辄S色，而且熒光發(fā)射波長發(fā)生紅移(531 nm到538 nm)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究pH滴定 Zn2+配合物的圖譜， 結(jié)果表明此結(jié)構(gòu)中的-NH基團(tuán)首先要脫去質(zhì)子，才能與Zn2+ 配合，從而導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)-NH的供電子能力增強(qiáng)。這兩種相反 的ICT過程使之能夠選擇性的測定Cd2+ 和Zn2+ 。 Twisted Intramolccul

37、ar Charge Transfer,TICT 在熒光壽命期間，與發(fā)色團(tuán)單鍵相連的助色 團(tuán)(通常是與發(fā)色團(tuán)相連的氨基)會(huì)發(fā)生分子內(nèi)的 扭轉(zhuǎn)，使得構(gòu)像發(fā)生了變化；另有一種是以雙鍵 相連的，旋轉(zhuǎn)后構(gòu)型發(fā)生了變化。旋轉(zhuǎn)的動(dòng)力來 源于電子激發(fā)后受體(aceeptor)的吸電性，扭轉(zhuǎn)后 的電子云分布將更加有利于系統(tǒng)的穩(wěn)定，這種扭 轉(zhuǎn)將有利于電荷的完全分離。所形成的激發(fā)態(tài)稱 為TICT態(tài)，是完全的電荷分離。 Principle of twisted intramolecular charge transfer，TICT Twisted Intramolccular Charge Transfer, TIC

38、T C N H3CCH3 N A D C N N 在NMC5 和JULCN 分子中，氨氮原子被固定在苯 環(huán)平面上，僅觀察到 LE 熒光；而在 CBQ 和 MMD 分子中，二甲氨基平面被固定與芳環(huán)平面 垂直或因鄰位甲基的空間位阻使其扭轉(zhuǎn)而與芳環(huán) 平面幾乎垂直，僅觀察到 CT 熒光。 基于TICT機(jī)理的離子傳感 Excited-State Intramolecular Proton Transfer， ESIPT 含有分子內(nèi)氫鍵的分子，光激發(fā)時(shí)其質(zhì)子酸性 提高，易于發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移?？砂l(fā)生分子內(nèi)激發(fā)態(tài) 質(zhì)子轉(zhuǎn)移的物質(zhì)一般含羥基或氨基，受光激發(fā)時(shí)， 質(zhì)子從羥基或氨基轉(zhuǎn)移至鄰近的與之形成氫鍵的 原子上（一

39、般能形成五元環(huán)或六元環(huán)，距離不超 過2），由之前的醇式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成酮式結(jié)構(gòu)。 由于光激發(fā)所形成的酮式異構(gòu)體只在激發(fā)態(tài)時(shí) （而不是基態(tài)）較原醇式結(jié)構(gòu)穩(wěn)定， 故光異構(gòu) 體的熒光較原分子的熒光位于長波長處 Fig.9 ESIPT mechanism for benzazole dyes 在pH為7.2的緩沖溶液中熒光峰位于460nm，Zn2+ 加入后，使其熒光藍(lán)移至405nm，這是由于Zn2+ 配位后導(dǎo)致磺酰胺NH脫質(zhì)子，抑制了激發(fā)態(tài)質(zhì)子 轉(zhuǎn)移，質(zhì)子轉(zhuǎn)移熒光消失。由此可實(shí)現(xiàn)熒光比值 法測定Zn2+。 酮式烯醇式L=solvent 于450nm處發(fā)射酮式異構(gòu)體的熒光峰,加入Zn2+后，結(jié) 構(gòu)中的-OH與

40、Zn2+鍵合，抑制了ESIPT過程的發(fā)生， 因此體系的熒光發(fā)射波長藍(lán)移至404nm。而且，隨著 Zn2+濃度的增加，體系在450nm處的熒光發(fā)射逐漸減 弱，在404nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增大，二者的熒光強(qiáng) 度比值I404/I450與Zn2+濃度在8.0 x10-4-4.0 x10-3mol/L范 圍內(nèi)呈線性關(guān)系。 N SH NH SH OH O 以下是測定Mg2+的比率型熒光探針。由于存在ESIPT過程，在 激發(fā)態(tài)時(shí)，此分子具有烯醇式結(jié)構(gòu)和酮式異構(gòu)體兩種形態(tài)。 在THF水(9：1,v/v)溶液中，分別在355 nm和427 nm處發(fā)射 雙重?zé)晒夥?。加入Mg2+ 后，酮式異構(gòu)體可以與Mg2+形成2：1 的配合物，打亂了分子原先的異構(gòu)體互變平衡，導(dǎo)致在427 nm處的熒光強(qiáng)度顯著增大，而355 nm處的熒光強(qiáng)度降低。 TBET能量體系與FRET能量體系不同，通 過TBET的能量傳遞不要求能量供體的發(fā) 射光譜與能量受體的吸