第二章光譜分析技術(shù)

1、第二章第二章 光譜分析技術(shù)光譜分析技術(shù) n本章內(nèi)容概要：本章內(nèi)容概要： * * 分光光度技術(shù)的基本原理分光光度技術(shù)的基本原理 * * 分光光度計的基本結(jié)構(gòu)與操作分光光度計的基本結(jié)構(gòu)與操作 * * 分光光度技術(shù)的定量方法分光光度技術(shù)的定量方法 * * 其他光譜分析技術(shù)其他光譜分析技術(shù) 波長波長 光譜光譜 區(qū)域區(qū)域 分析分析 方法方法 0.1A 0.1-1A200-400nm 400-760nm760100025-500m1cm 射線射線X射線射線紫外線紫外線可見光可見光紅外光紅外光微波微波無線電波無線電波 射線射線 光譜法光譜法 X射線射線 光譜法光譜法 紫外光紫外光 光度法光度法 可見光可見光

2、 光度法光度法 紅紅 外外 光度法光度法 微微 波波 光譜法光譜法 核磁共振核磁共振 光譜法光譜法 電磁波譜圖電磁波譜圖 第一節(jié)第一節(jié) 光譜分析技術(shù)的基本原理光譜分析技術(shù)的基本原理 一、光譜分析技術(shù)的概念一、光譜分析技術(shù)的概念 二、光譜分析技術(shù)的分類二、光譜分析技術(shù)的分類 利用各種化學(xué)物質(zhì)（原子、基團、分子及高分子化合物）利用各種化學(xué)物質(zhì)（原子、基團、分子及高分子化合物） 所具有的發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征來確定其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)所具有的發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征來確定其性質(zhì)、結(jié)構(gòu) 及含量的技術(shù)。及含量的技術(shù)。 光譜分析技術(shù)光譜分析技術(shù) 發(fā)射光譜分析發(fā)射光譜分析 吸收光譜分析（常用）吸收光譜

3、分析（常用） 散射光譜分析散射光譜分析 三、分光光度技術(shù)的基本原理三、分光光度技術(shù)的基本原理 1 1、光的吸收現(xiàn)象與吸收曲線、光的吸收現(xiàn)象與吸收曲線 * *光色互補光色互補 紅紅 紫紫 藍藍 青青 藍藍 青青 綠綠 黃黃 橙橙 白白 曲線繪制：曲線繪制： * *吸收曲線吸收曲線 概念：概念： 利用各種不同的波長測定物質(zhì)的吸光度，以波長為橫利用各種不同的波長測定物質(zhì)的吸光度，以波長為橫 坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，連接各點成光滑的曲線。坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，連接各點成光滑的曲線。 * *應(yīng)用：應(yīng)用： 定性分析定性分析吸收曲線的形狀吸收曲線的形狀 定量分析定量分析max max 為選擇單色光的依據(jù)為選擇

4、單色光的依據(jù) A nm300 400500 600 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 700 0.800 0.900 max 脫氫皮質(zhì)酮 睪丸酮 （nm） A minmaxsh * * * * * * *吸收曲線吸收曲線 制作者：制作者： 制作日期：制作日期： 制作儀器：制作儀器： (1)(1)吸光度（吸光度（A)A)（absorbanceabsorbance）與透光率（）與透光率（T)T)（transmittancetransmittance） T=T= I I IoIo 2 2、光吸收定律、光吸收定律Lambert-BeerLambert-

5、Beer定律定律 當(dāng)光線通過均勻、透明的溶液時可出現(xiàn)三種情況：一部分當(dāng)光線通過均勻、透明的溶液時可出現(xiàn)三種情況：一部分 光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透過溶液。設(shè)入射光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透過溶液。設(shè)入射 光強度為光強度為IoIo，透射光強度為，透射光強度為I I，I I和和I I0 0之比稱為透光度之比稱為透光度，即：即： A = -lgT = -lgI/IA = -lgT = -lgI/I0 0 = lgI = lgI0 0/I/I 條件：單色光，稀溶液條件：單色光，稀溶液 (2)Lambert-Beer(2)Lambert-Beer定律定律 Lambert-Bee

6、r Lambert-Beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層 厚度之間關(guān)系的基本定律，其表達式為：厚度之間關(guān)系的基本定律，其表達式為： A = K L C 式中式中A A為吸光度；為吸光度；K K為吸光系數(shù)；為吸光系數(shù)；L L為溶液層厚度（光徑）；為溶液層厚度（光徑）； C C為溶液濃度為溶液濃度 （Lambert-BeerLambert-Beer定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。）定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。） 入射光入射光IoIo 透射光透射光I I 反射光反射光IrIr 散射光散射光IsIs 吸收光吸收

7、光IaIa 分類：分類： 1mol 1mol（ （摩爾吸光系數(shù)）摩爾吸光系數(shù)） 1cm1cm E E 1% 1% （ （百分吸光系數(shù)）百分吸光系數(shù)） 1cm1cm 應(yīng)用：應(yīng)用： 1.1.根據(jù)根據(jù)進行物質(zhì)的定性、定量分析進行物質(zhì)的定性、定量分析 2. 2. 的大小反映測定的靈敏度的大小反映測定的靈敏度，越大，靈敏度越高。越大，靈敏度越高。 意義：意義：表示物質(zhì)對某一特定波長的吸收能力，表示物質(zhì)對某一特定波長的吸收能力， 愈大，表示愈大，表示 對某波長光的吸收能力愈強。在一定條件下是特征性常數(shù)對某波長光的吸收能力愈強。在一定條件下是特征性常數(shù) 3.3.吸光系數(shù)吸光系數(shù) 概念：在一定條件下，物質(zhì)濃度

8、為概念：在一定條件下，物質(zhì)濃度為1mol/l1mol/l、液層厚度為、液層厚度為1cm1cm 時的吸光度值，與溶液的性質(zhì)有關(guān)。時的吸光度值，與溶液的性質(zhì)有關(guān)。 第二節(jié)第二節(jié) 分光光度計的基本結(jié)構(gòu)與操作分光光度計的基本結(jié)構(gòu)與操作 可見光及近紅外線可見光及近紅外線 紫外光紫外光 一、儀器結(jié)構(gòu)一、儀器結(jié)構(gòu) 光源光源 鎢絲燈鎢絲燈 氫燈或氘燈氫燈或氘燈 單色器單色器 棱鏡棱鏡 光柵光柵 檢測器檢測器 光電管光電管 光電倍增管光電倍增管 顯示器顯示器 檢流計檢流計 數(shù)碼管顯示數(shù)碼管顯示 吸收池（比色杯、比色皿）吸收池（比色杯、比色皿） 玻璃玻璃 石英石英 塑料塑料 二、操作方法（二、操作方法（72272

9、2光柵分光光度計）光柵分光光度計） 1 1、接通電源開關(guān)，通電、接通電源開關(guān)，通電2020分鐘預(yù)熱（打開比色室蓋子）分鐘預(yù)熱（打開比色室蓋子） 2 2、調(diào)節(jié)波長、調(diào)節(jié)波長 3 3、將樣品放入比色室、將樣品放入比色室 5 5、將開關(guān)置于、將開關(guān)置于A A位，讀數(shù)不為零可用消光零調(diào)節(jié)為位，讀數(shù)不為零可用消光零調(diào)節(jié)為0.00.0 6 6、拉動拉桿，讀取待測溶液、拉動拉桿，讀取待測溶液A A，記錄，記錄 4 4、將開關(guān)置于、將開關(guān)置于T T位，打開比色室蓋子，調(diào)節(jié)位，打開比色室蓋子，調(diào)節(jié)T T為為0.00.0，關(guān)上，關(guān)上 比色室蓋子，調(diào)節(jié)比色室蓋子，調(diào)節(jié)T T為為100.0100.0 樣品室樣品室 波

10、長調(diào)節(jié)波長調(diào)節(jié) 旋鈕旋鈕 控制面板控制面板 樣品槽樣品槽 拉桿拉桿 二、操作方法（二、操作方法（722722型分光光度計）型分光光度計） 1 1、開機預(yù)熱（接通電源開關(guān)，通電、開機預(yù)熱（接通電源開關(guān)，通電2020分鐘預(yù)熱）分鐘預(yù)熱） 2 2、波長調(diào)整、波長調(diào)整 3 3、將樣品放入比色室、將樣品放入比色室 5 5、“功能鍵功能鍵”切換切換“A A ” 模式，儀器顯示模式，儀器顯示“.000.000”或或“-.000-.000” 6 6、拉動拉桿，讀取待測溶液、拉動拉桿，讀取待測溶液A A，并記錄，并記錄 4 4、“功能鍵功能鍵”置于置于“T T”，用遮光體或拉動半格拉桿，調(diào)，用遮光體或拉動半格拉

11、桿，調(diào)0%0%， 取出遮光體或拉桿推到底，調(diào)取出遮光體或拉桿推到底，調(diào)100%100%。 三、分光光度計波長校正三、分光光度計波長校正 粗測：粗測：580nm580nm有均勻橙黃色光斑，光斑偏紅或偏綠，說明有均勻橙黃色光斑，光斑偏紅或偏綠，說明 已經(jīng)偏移。已經(jīng)偏移。 四、吸光度的校正四、吸光度的校正 鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計的吸光度。鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計的吸光度。 在在2525，將，將4mg4mg鉻酸鉀溶于鉻酸鉀溶于100ml100ml的的0.05mol/L KOH0.05mol/L KOH中，放中，放 入比色池中，在不同波長下測定吸光度值，與己知的標(biāo)準(zhǔn)入比色池中，在不

12、同波長下測定吸光度值，與己知的標(biāo)準(zhǔn) 吸光度校正表進行比較，可檢測儀器吸光度的準(zhǔn)確度。吸光度校正表進行比較，可檢測儀器吸光度的準(zhǔn)確度。 第三節(jié)第三節(jié) 分光光度技術(shù)的定性、定量方法分光光度技術(shù)的定性、定量方法 （一）分光光度技術(shù)的定性方法（一）分光光度技術(shù)的定性方法 2.2.摩爾消光系數(shù)摩爾消光系數(shù)檢測法檢測法 1.1.最大吸收波長最大吸收波長maxmax檢測法檢測法 一、比較法一、比較法 計算公式：計算公式：Cu= Cu= CsCsf f AuAu AsAs 將標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品在相同條件下，顯色并測定各自將標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品在相同條件下，顯色并測定各自 的的A A，由于測定體系的溫度、厚度及入射光

13、波長一致，故，由于測定體系的溫度、厚度及入射光波長一致，故 可用公式計算待測樣品的濃度。可用公式計算待測樣品的濃度。 概念：概念： （二）分光光度技術(shù)的定量方法（二）分光光度技術(shù)的定量方法 標(biāo)準(zhǔn)液的要求：其濃度盡量接近于樣品濃度。（雙標(biāo)準(zhǔn)）標(biāo)準(zhǔn)液的要求：其濃度盡量接近于樣品濃度。（雙標(biāo)準(zhǔn)） 二、標(biāo)準(zhǔn)曲線法（二、標(biāo)準(zhǔn)曲線法（standard curvestandard curve） 概念：配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按標(biāo)本處理方法做相同概念：配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按標(biāo)本處理方法做相同 處理，在特定的波長下測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫處理，在特定的波長下測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫 坐標(biāo)，以

14、吸光度為縱坐標(biāo)，連接成一條通過原點的直線。坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，連接成一條通過原點的直線。 制作方法：制作方法： 作圖法作圖法主要主要 直線回歸方程計算法直線回歸方程計算法 制備標(biāo)準(zhǔn)液：制備標(biāo)準(zhǔn)液：5656個不同濃度梯度個不同濃度梯度 加樣顯色：加樣顯色：3 3個平行管個平行管 比色記錄：平均比色記錄：平均A A 作圖：作圖： 標(biāo)準(zhǔn)檢量表的制作：標(biāo)準(zhǔn)檢量表的制作： 作圖法步驟作圖法步驟 標(biāo)準(zhǔn)曲線（曲線） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Y=ax+b 注意事項：注意事項： 1.1.測定條件應(yīng)一致，條件改變應(yīng)重新繪制測定條件應(yīng)一致，條件改變應(yīng)重新繪制 2.2.標(biāo)準(zhǔn)液濃度應(yīng)準(zhǔn)確標(biāo)準(zhǔn)液濃度應(yīng)

15、準(zhǔn)確 3.3.重復(fù)、平行測定重復(fù)、平行測定 4.4.比例適當(dāng)比例適當(dāng) 5.5.吸光度范圍應(yīng)在吸光度范圍應(yīng)在0.050.05 1.0 1.0 之間之間 6.6.高濃度標(biāo)本超出線性范圍時，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后在測定。高濃度標(biāo)本超出線性范圍時，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后在測定。 三、差示法（三、差示法（differential spectrophotometrydifferential spectrophotometry） 原理：對物質(zhì)濃度過高或過低時，可用一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)液原理：對物質(zhì)濃度過高或過低時，可用一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)液 代替空白管做參比，提高測定的精確度。代替空白管做參比，提高測定的精確度。 A= Au-As =

16、 LA= Au-As = L（Cu-CsCu-Cs）= L c= L c 四、摩爾吸光系數(shù)法四、摩爾吸光系數(shù)法 原理：利用已知的吸光系數(shù)，由測得的吸光度計算樣品的濃度原理：利用已知的吸光系數(shù)，由測得的吸光度計算樣品的濃度 C=C= A A L L 五、五、多組分混合物的測定多組分混合物的測定 各組分吸收峰不互相重疊各組分吸收峰不互相重疊-可分別測定可分別測定 各組分吸收峰互相重疊各組分吸收峰互相重疊-等吸收點法、解聯(lián)立方程法等吸收點法、解聯(lián)立方程法 雙波長法等雙波長法等 第四節(jié)第四節(jié) 其他光譜分析技術(shù)其他光譜分析技術(shù) 一、火焰光度法一、火焰光度法 原理：某些金屬的基態(tài)原子在受到火焰激發(fā)后，其外

17、層電子原理：某些金屬的基態(tài)原子在受到火焰激發(fā)后，其外層電子 從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)返回基態(tài)時，可發(fā)出特征性從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)返回基態(tài)時，可發(fā)出特征性 的譜線，檢測其強度可進行定量分析。的譜線，檢測其強度可進行定量分析。 應(yīng)用：鉀、鈉等堿金屬和堿土金屬的檢測應(yīng)用：鉀、鈉等堿金屬和堿土金屬的檢測 儀器組成：霧化燃燒系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)儀器組成：霧化燃燒系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、檢測系統(tǒng) 特點：操作煩瑣、干擾因素多、被簡便的離子選擇電極法取代特點：操作煩瑣、干擾因素多、被簡便的離子選擇電極法取代 二、原子吸收分光光度法二、原子吸收分光光度法 應(yīng)用：體液中多種金屬元素（鈣、鐵）的檢測應(yīng)用：體液中多種金屬

18、元素（鈣、鐵）的檢測 在環(huán)境檢測、職業(yè)病防治中痕量有害元素（砷、汞）的檢測在環(huán)境檢測、職業(yè)病防治中痕量有害元素（砷、汞）的檢測 特點：特點： 靈敏度高（靈敏度高（1010-9 -9 1010-6 -6g/L g/L），準(zhǔn)確度較高），準(zhǔn)確度較高 簡便，快速簡便，快速 可測全部金屬元素和一些半金屬元素可測全部金屬元素和一些半金屬元素 原理：根據(jù)待測元素的氣態(tài)原子能吸收相同原子所發(fā)射的特征原理：根據(jù)待測元素的氣態(tài)原子能吸收相同原子所發(fā)射的特征 譜線的分析技術(shù)，即在一定條件下，原子的吸光度與待譜線的分析技術(shù)，即在一定條件下，原子的吸光度與待 測元素的濃度成正比。測元素的濃度成正比。 儀器組成：光源（空心陰極燈）、原子化器、分光系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)儀器組成：光源（空心陰極燈）、原子化器、分光系統(tǒng)、檢測系統(tǒng) 三、熒光光度分析法三、熒光光度分析法 原理：待測物質(zhì)在激發(fā)光的照射下，可由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，原理：待測物質(zhì)在激發(fā)光的照射下，可由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)， 當(dāng)從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，可發(fā)出熒光，其強度與溶液當(dāng)從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，可發(fā)出熒光，其強度與溶液 的濃度成正比。的濃度成正比。 應(yīng)用：激素及其代謝產(chǎn)物的測定應(yīng)用：激素及其代謝產(chǎn)物的測定 生物活性物質(zhì)