草莓葉柄再生不定芽的研究(畢業(yè)論文)

1、草莓葉柄再生不定芽的研究 摘要: 目前植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為植物定向遺傳改良的主要手段,而建立穩(wěn)定高頻離體再生體系是實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)和前提。本研究擬利用草莓的葉柄誘導(dǎo)不定芽，完善草莓的高效再生體系，為應(yīng)用基因工程進(jìn)行草莓品質(zhì)改良的研究奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)采用hinonine,tudla,豐香，全明星，明星花五個(gè)品種，比較不同品種葉柄再生的差異。11個(gè)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組合，預(yù)期篩選出適合葉柄再生不定芽的最佳培養(yǎng)基配方，并對(duì)葉柄上、中、下，不同部位的誘導(dǎo)率進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果表明, 葉柄下部的誘導(dǎo)率比較高。tudla這個(gè)品種葉柄再生性相對(duì)較高。對(duì)某一特定的品種來(lái)說(shuō),外植體基因型和外源激素種類(lèi)及其合適濃度

2、是決定再生的主要因子。關(guān)鍵詞：草莓;葉柄；不定芽再生；study on regeneration system for strawberry petioles in vitro horticulture 200305 xie hongjing supervisor: zhang xueying abstract: nowadays, the gene transformation of plants has been one way of plant directional genetic breeding, and the establishment of high-frequency sy

3、stem is the base and precondition of genetic transformation.strawberr petioles were investigated for factors affecting the regeneration of adventitious bud, and a highly efficient regeneration system of leaf in vitro was established .this experiment use hinonine,tudla,fengxiang ,allstar,starflower t

4、o compare with the difference of the strawberry leaf petioles. eleven control conditions,choose the best one . and study the position of the strawberry leaf petioles. the result showed that, the upper part of the strawberry leaf petioles is better .and the tudal is the better breed.to a specific gen

5、otype, the genotype of explants and the type of exogenous hormones were the main factors affecting regeneration.key word：strawberry; leaf petioles; adventitious shoot regeneration;1.引言1.1 目的意義草莓(fragaria ananassaduch)是薔薇科(rosaceae)草莓屬(fragaria)多年生草本植物。以往草莓品種改良多采用常規(guī)雜交育種技術(shù),但育種周期長(zhǎng),選擇效率低,現(xiàn)代生物技術(shù)開(kāi)辟了草莓育種新途

6、徑。再加上草莓生長(zhǎng)周期短,無(wú)性繁殖等特點(diǎn),較適合用基因工程技術(shù)育種。目前,利用植物生物技術(shù)將目的基因?qū)氩葺?實(shí)現(xiàn)以草莓作為植物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白質(zhì)從而獲得具保健功能性鮮食水果,前景誘人。但利用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)草莓進(jìn)行定向遺傳改良的前提,是建立高效、穩(wěn)定的離體再生體系。1本研究以國(guó)內(nèi)主栽草莓品種為研究對(duì)象,對(duì)影響草莓葉片、葉柄再生的主要組培因素進(jìn)行了研究,為草莓遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。另外草莓是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的多年生草本果樹(shù)，分布范圍較廣，因其色、香、味俱佳，深受消費(fèi)者青睞。其栽培品種和類(lèi)型繁多,據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),現(xiàn)在全世界約有草莓品種2 000多個(gè)。近年來(lái),我國(guó)草莓生產(chǎn)發(fā)展迅速,提高草莓的品

7、質(zhì)及其抗性,以獲得更具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的草莓新品種成為當(dāng)務(wù)之急。植物基因工程作為現(xiàn)今植物改良育種的有效手段極大地推動(dòng)了草莓育種工作的進(jìn)程。自1990年以來(lái),關(guān)于草莓遺傳轉(zhuǎn)化的研究,國(guó)內(nèi)外已陸續(xù)有了一些文獻(xiàn)報(bào)道,草莓成為繼核桃、蘋(píng)果之后第三個(gè)獲得轉(zhuǎn)基因植株的果樹(shù)。2近年來(lái)，我國(guó)草莓栽培面積迅速增長(zhǎng)，但目前生產(chǎn)中大量栽培的品種，多是從國(guó)外引入的，普遍存在著抗病蟲(chóng)能力差、抗逆性差及品質(zhì)下降等問(wèn)題，限制了草莓產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。因此迫切需要選育適合我國(guó)不同氣候條件的、抗性強(qiáng)的優(yōu)良品種。草莓栽培品種多為八倍體，遺傳上高度雜合，雜交后代廣泛分離，使優(yōu)良性狀很難集中在子代中。我國(guó)野生草莓種質(zhì)資源非常豐富，有許多優(yōu)良性

8、狀。但其染色體倍性較低，絕大多數(shù)為二倍體，少數(shù)為四倍體、五倍體或六倍體，與栽培草莓間的遺傳差異較大，難于在常規(guī)育種中直接利用。為了選育出優(yōu)良的品種，人們正積極探索將多種育種途徑結(jié)合起來(lái)，特別是把現(xiàn)代生物技術(shù)與常規(guī)育種方法相結(jié)合，以提高育種效率，加速育種進(jìn)程。近年來(lái)，基因工程取得了很大的進(jìn)展，草莓遺傳上的高度雜合性、染色體的多種倍性和豐富的野生草莓資源，使得轉(zhuǎn)基因操作成為草莓育種的一種重要手段。應(yīng)用基因工程技術(shù)進(jìn)行草莓品種改良，建立一個(gè)高效的再生體系是基因工程的基礎(chǔ)。本研究擬利用草莓的葉柄誘導(dǎo)不定芽，選用hinonine,tudla,豐香，全明星，明星花五個(gè)品種，為了完善草莓的高效再生體系，為應(yīng)

9、用基因工程進(jìn)行草莓品質(zhì)改良的研究奠定基礎(chǔ)。1.2 國(guó)內(nèi)外研究近況 草莓的葉片和葉柄是以?xún)煞N方式形成再生芽，一部分是由愈傷組織形成層細(xì)胞局部快速分裂形成的；一部分不經(jīng)過(guò)愈傷組織直接經(jīng)表皮細(xì)胞脫分化形成的。柯善強(qiáng)3等（1988）以alkotar 幼嫩的葉片為材料離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)ms+ba1.5mg/l-2.5 mg/l+naa0.1 mg/l的培養(yǎng)基上可以直接誘導(dǎo)不定芽，同樣可繼代培養(yǎng)叢生芽。宋國(guó)慶4等對(duì)紅豐草莓葉盤(pán)進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)ms+ba1.0 mg/l+iaa 2.0mg/l上的葉盤(pán)成芽率最高，可達(dá)79.1%，葉柄在ms+ba1.0 mg/l+iba1.0 mg/l上的再生頻率為50.3%，

10、在ms培養(yǎng)基上再生苗生根效果好。張志宏5等通過(guò)“弗吉尼亞”等品種的葉片再生研究，發(fā)現(xiàn)tdz與生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)配合使用對(duì)葉片的再生效果明顯優(yōu)于6-ba。孫瑞芳等研究表明草莓的基因型不同再生能力不同，星都一號(hào)的葉柄再生不定芽能力最強(qiáng)，全明星的葉片及葉柄再生不定芽的能力都比較強(qiáng)。葉柄取3-5mm長(zhǎng)為宜，不定芽多從葉柄周緣愈傷組織處形成，少數(shù)可從切口邊緣直接再生。2. 材料與方法2.1 試驗(yàn)材料供試品種為hinonine,tudla,豐香，全明星，明星花五個(gè)品種的組培苗,用ms+ba0.5mg/l(單位下同)+iba0.1和ms+ba 0.8+iba 0.1作增殖培養(yǎng)基。葉片和葉柄取自在ms培養(yǎng)基生長(zhǎng)30

11、天的組培苗,葉柄切成5mm的小段。2.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件用ms(murashige&skoog,1962)無(wú)機(jī)鹽、b5(gamborg等,1968)維生素、蔗糖30mg/l和瓊脂7.0g/l,加不同組合的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(pgr),調(diào)節(jié)ph值至5.8, 然后分裝到100ml的無(wú)菌廣口瓶中在121條件下滅菌20分鐘, ,每瓶裝3040ml制成草莓葉柄的再生培養(yǎng)基。接種葉柄后,暗培養(yǎng)4天,然后轉(zhuǎn)到16/8小時(shí)光暗條件下培養(yǎng),溫度為252,每?jī)芍芨鼡Q一次培養(yǎng)基。當(dāng)芽苗長(zhǎng)至12cm時(shí),置ms培養(yǎng)基上延長(zhǎng)生長(zhǎng)與生根約4周后,開(kāi)瓶練苗1周,洗凈根部的瓊脂,移入裝有花卉營(yíng)養(yǎng)土的小盆,置溫室內(nèi),并用塑料薄膜覆蓋

12、保濕1周。2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組合植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑分別設(shè)定ba 0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l、2.0mg/l、3.0mg/l；iba 0.25mg/l、0.5mg/l 、1.0mg/l、2.0mg/l。具體方案見(jiàn)表1。表1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基（單位：mg/l） 處理baiba處理baibac1 1.50.25c71.50.5待添加的隱藏文字內(nèi)容2c21.50.5c82.00.5c31.51.0c93.00.5c41.52.0c101.01.0c50.50.5c112.01.0c61.00.53結(jié)果與分析3.1外植體基因型對(duì)芽分化的影響實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所用的五個(gè)品種均在芽分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)1

13、-2天后，傷口出現(xiàn)黑色，7天左右均能在傷口處形成可見(jiàn)愈傷組織，tudla愈傷率達(dá)到100%，豐香、全明星、明星花、hinonine，愈傷率達(dá)到80%以上。全明星常形成粉紅色愈傷組織；豐香愈傷形態(tài)較小并且多呈黑色；hinonine，明星花愈傷組織形態(tài)較??；全明星和tudla愈傷致密而且綠。葉柄接種后兩周左右,葉柄兩端傷口處可見(jiàn)綠色愈傷組織,4周左右愈傷組織中開(kāi)始分化出小芽,6周時(shí)芽的分化達(dá)到高峰,分化的葉柄頂部分化出芽,少數(shù)葉柄兩端均可分化出芽,每個(gè)再生葉柄分化芽數(shù)為3-5個(gè)。,每個(gè)再生葉柄形成芽的數(shù)目則隨時(shí)間的推移增長(zhǎng)加快。相同分化培養(yǎng)基上不同基因型草莓外植體再生情況列表如下。（見(jiàn)表1）表1

14、相同分化培養(yǎng)基上不同基因型草莓外植體再生情況品種外植體數(shù)愈傷數(shù)再生率/%tudla303032全明星30226.7豐香30220明星花302713.3hinonine30293.3注：每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)含有10個(gè)外植體3.2不同外源激素及其種類(lèi)對(duì)草莓再生的影響不同激素種類(lèi)和濃度配比是決定植物離體細(xì)胞脫分化與再分化的關(guān)鍵外因, 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑調(diào)控著草莓的離體形態(tài)建成反應(yīng)?？刂浦?xì)胞的再分化方向。在誘導(dǎo)草莓葉柄分化的試驗(yàn)中,大多數(shù)的不定芽發(fā)生都經(jīng)歷了愈傷組織階段。實(shí)驗(yàn)設(shè)立不同濃度把ba以及iba與不同生長(zhǎng)素組合對(duì)草莓葉柄再生的影響,見(jiàn)表2。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),tudla在ms+ba 05 mg/l+

15、iba 05 mg/l再生效果好,尤其是葉柄下部的再生率高達(dá)60%,平均再生芽數(shù)610個(gè)，而葉柄上部和中部的平均出芽數(shù)也能達(dá)到17和18。在ms+ba 15 mg/l+iba 10 mg/l中，上中下部位的出芽率均能達(dá)到30%， 在ms+ba 15 mg/l+iba 05 mg/l中再生效果也比較好，平均出芽率均能達(dá)到110?？偟膩?lái)說(shuō)tudla的出芽情況在五個(gè)品種中是最好的,培養(yǎng)30天左右葉柄愈傷形態(tài)最大,顏色深綠色。明星花在 ms+ba 15 mg/l+iba 025mg/l中，也柄下部的出芽率達(dá)到25%， 在ms+ba 10 mg/l+iba 05 mg/l中，葉柄生長(zhǎng)愈傷后直接長(zhǎng)根，根系

16、在上中下部位生長(zhǎng)都非常明顯。全明星的愈傷長(zhǎng)的普遍偏小，但在ms+ba 15 mg/l+iba 20 mg/l中，上中下部位均有出芽，出芽率達(dá)到10%，品均再生芽數(shù)210。豐香愈傷率較高，能達(dá)到80%以上，但是愈傷形態(tài)較小，黑色，只有個(gè)別出芽，芽的長(zhǎng)勢(shì)也比較弱。hinonine愈傷都非常小，只有在ms+ba 05 mg/l+iba 05 mg/l出現(xiàn)異常，愈傷大，而且顏色鮮綠，出芽率達(dá)到10%。表2不同培養(yǎng)基對(duì)草莓葉片誘導(dǎo)不定芽的影響培養(yǎng)基（mg/l）tudla全明星愈傷率（%）出芽率（%）愈傷率（%）出芽率（%）ms+ba1.5+iba0.251000200ms+ba1.5+iba0.5100

17、30500ms+ba1.5+iba1.0100101003.3ms+ba1.5+iba2.01001096.76.7ms+ba0.5+iba0.51006073.30ms+ba1.0+iba0.510001000ms+ba1.5+iba0.51006.71000ms+ba2.0+iba0.51000900ms+ba3.0+iba0.5100083.30ms+ba1.0+iba1.010001000ms+ba2.0+iba1.010001000培養(yǎng)基（mg/l）豐香明星花hinonine愈傷率（%）出芽率（%）愈傷率（%）出芽率（%）愈傷率（%）出芽率（%）ms+ba1.5+iba0.25100

18、070.62500ms+ba1.5+iba0.5100053.3013.30ms+ba1.5+iba1.060084.3013.30ms+ba1.5+iba2.096.7090016.70ms+ba0.5+iba0.573.309002010ms+ba1.0+iba0.590043.3096.70ms+ba1.5+iba0.583.3043.3076.70ms+ba2.0+iba0.590010016.773.30ms+ba3.0+iba0.593.3058.3093.30ms+ba1.0+iba1.0100055093.30ms+ba2.0+iba1.093.31093.312.5700注 以上統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)均為葉柄再生培養(yǎng)4周左右，隨著時(shí)間推移出芽率還在繼續(xù)增長(zhǎng)。4.討論本實(shí)驗(yàn)表明像多數(shù)植物一樣,草莓植株再生頻率的高低也因基因型及所用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比而異。在本試驗(yàn)條件下,tydla品種和全明星的再生能力顯著地高于豐香、hinonine,各自獲得最高再生頻率所需的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合也不同。本試驗(yàn)的結(jié)果顯示,同一基因型同一組織和器官的不同部位的再生能力不盡一致,而且對(duì)培養(yǎng)條件的要求也有差異。試驗(yàn)表明，草莓葉柄的下部和中部的再生能力明顯比上部好。資料顯示葉圓盤(pán)的再生能力高于葉柄,而且達(dá)到最高再生頻率