第18章全自動DNA測序儀和蛋白質(zhì)自動測序儀習(xí)題

1、第十八章 全自動DNA測序儀和蛋白質(zhì)自動測序儀首 頁習(xí) 題習(xí)題參考答案習(xí) 題 名詞解釋 選擇題 簡答題 一、名詞解釋1熒光標(biāo)記引物法2熒光標(biāo)記終止底物法3多色熒光標(biāo)記引物法4多色熒光標(biāo)記終止底物法5Edman降解法6Sanger雙脫氧鏈末端終止法7平板電泳型DNA測序儀8毛細(xì)管電泳型DNA測序儀9縮微生物處理器二、選擇題 【A型題】 在五個選項(xiàng)中選出一個最符合題意的答案（最佳答案）。1. DNA的一級結(jié)構(gòu)是指（ ） ； ADNA空間構(gòu)象B核苷酸序列C堿基序列D氨基酸序列EDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)2. 下列有關(guān)測序反應(yīng)體系反應(yīng)原理的敘述中，錯誤的是（ ）A加入的核苷酸單體為-脫氧核苷三磷酸B低溫退火時，

2、引物與模板形成雙鏈區(qū)C沿著-的方向形成新鏈DDNA聚合酶結(jié)合到DNA雙鏈區(qū)上啟動DNA的合成E形成的新生鏈與模板完全互補(bǔ)配對3. 雙脫氧鏈末端終止法測序反應(yīng)與普通體外合成DNA反應(yīng)的主要區(qū)別是（ ）ADNA聚合酶不同BdNTP的種類不同CdNTP的濃度不同D引物不同E雙脫氧鏈末端終止法測序反應(yīng)體系中還需加入ddNTP4. 下列熒光標(biāo)記方法中，可以將A、C、G、T四個測序反應(yīng)在同一管中完成而不影響測序結(jié)果的是（ ）A單色熒光標(biāo)記引物法B單色熒光標(biāo)記終止底物法C多色熒光標(biāo)記引物法D多色熒光標(biāo)記終止底物法E多色熒光標(biāo)記法5. 下列哪一熒光標(biāo)記法，必需將A、T、C、G四個測序反應(yīng)分管進(jìn)行，但可以合并在

3、一個泳道內(nèi)電泳（ ）A單色熒光標(biāo)記引物法B單色熒光標(biāo)記終止底物法C多色熒光標(biāo)記引物法D多色熒光標(biāo)記終止底物法E多色熒光標(biāo)記法6. 毛細(xì)管電泳型測序儀電泳時儀器顯示無電流，最常見的原因是由于（ ）A電極彎曲B電泳緩沖液蒸發(fā)使液面降低C毛細(xì)管未浸入緩沖液中D毛細(xì)管內(nèi)有氣泡E測序樣本未注入毛細(xì)管中7. 毛細(xì)管電泳型測序儀電泳時產(chǎn)生電弧，主要原因是（ ）A電泳緩沖液漏出B電泳緩沖液配有誤C電極、加熱板或自動進(jìn)樣器上有灰塵沉積D測序樣本純化不完全，含有鹽性成份E加熱板溫度過高8. 全自動DNA測序儀的主要應(yīng)用范圍，不包括（ ）A人類遺傳病、傳染病和癌癥的基因診斷B法醫(yī)的親子鑒定和個體識別C生物工程藥物的

4、篩選D動植物雜交育種E新蛋白質(zhì)的鑒定9. 蛋白質(zhì)測序儀的基本工作原理，主要是利用（ ）AEdman降解法B雙脫氧鏈末端終止法C化學(xué)降解法 D氧化還原法E水解法10. 蛋白質(zhì)測序儀主要檢測（ ）A核苷酸序列B核糖核酸序列C堿基序列D氨基酸序列E脫氧核糖核酸序列11. 下列有關(guān)雙脫氧鏈末端終止法測序原理的敘述中，不正確的是（ ）A其基本原理是利用DNA的體外合成過程B反應(yīng)體系中需加入dNTP和ddNTPCddNTP可以形成磷酸二酯鍵而摻入到DNA鏈中DdNTP摻入后可導(dǎo)致新合成鏈在不同的位置終止E生成的反應(yīng)產(chǎn)物是一系列長度不同的多核苷酸片段12. 下列有關(guān)多色熒光標(biāo)記終止底物法的敘述中，不正確的是

5、（ ）A需將4種ddNTP分別用4種不同的熒光染料標(biāo)記B標(biāo)記和終止過程在同一時間完成CA、T、C、G四種反應(yīng)可以在同一管中完成 D可在一個泳道內(nèi)完成電泳測序E熒光染料標(biāo)記過程和延伸反應(yīng)終止分別發(fā)生在同一DNA片段的兩端13. 下列有關(guān)熒光標(biāo)記DNA的檢測原理的敘述中，不正確的是（ ）A用于測序的產(chǎn)物絕大多數(shù)應(yīng)為單鏈BDNA片段上的熒光基團(tuán)可吸收激光束提供的能量而發(fā)射出特征波長的熒光C兩極間的電勢差推動DNA片段從正極向負(fù)級泳動并達(dá)到相互分離D不同顏色的熒光與不同的堿基信息相對應(yīng)E測序結(jié)果中，縱軸表示熒光波長種類和強(qiáng)度14. 下列有關(guān)Edman降解法基本原理的敘述中，錯誤的是（ ）APTC多肽的

6、生成是在弱堿性條件下BPTC多肽的生成反應(yīng)需用過量的試劑使有機(jī)反應(yīng)完全C在無水強(qiáng)堿的作用下，可使靠近PTC基的氨基酸環(huán)化，形成ATZ衍生物和一個失去末端氨基酸的剩余多肽D剩余多肽鏈可以進(jìn)行下一次以及后續(xù)的降解循環(huán)EATZ衍生物經(jīng)水溶酸處理轉(zhuǎn)化為PTH氨基酸15. 毛細(xì)管電泳型DNA測序儀電泳時儀器顯示無電流，最常見的原因?yàn)椋?）A緩沖液配制錯誤B毛細(xì)管內(nèi)有氣泡C電泳緩沖液蒸發(fā)使液面降低，而未能接觸到毛細(xì)管的兩端D電極彎曲而無法浸入緩沖液中E加熱板溫度過高16. 在單純以測定DNA序列為目的的全自動DNA測序儀中，廣泛應(yīng)用的原理是（ ）AEdman降解法B雙脫氧鏈末端終止法C化學(xué)降解法 D氧化還

7、原法E水解法17. 雙脫氧鏈末端終止法測序的基本原理是利用（ ）ART-PCRBPCRCWestern Blot DSouthern BlotE水解法18. 測序反應(yīng)體系中加入的酶為（ ）A限制性內(nèi)切酶BRNA聚合酶CDNA聚合酶 DDNA水解酶E反轉(zhuǎn)錄酶19. 在普通的體外合成DNA反應(yīng)體系中，加入的核苷酸單體為（ ）AdAMP，dCMP，dGMP，dTMPBdADP，dCDP，dGDP，dTDPCdATP，dCTP，dGTP，dTTPDddATP，ddCTP，ddGTP，ddTTPEddADP，ddCDP，ddGDP，ddTDP20. 雙脫氧鏈末端終止法測序反應(yīng)中除PCR反應(yīng)體系成份外，還

8、加入了（ ）ADNA聚合酶BdNTPCdNDPDddNTPEddNDP21. 在DNA自動測序中廣泛應(yīng)用的示蹤物是（ ）A色素染料B同位素C電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)D酶E熒光素22. 下列有關(guān)多色熒光標(biāo)記引物法標(biāo)記引物的特性的敘述中，正確的是（ ）A四種標(biāo)記引物的序列相同，但端標(biāo)記的熒光染料顏色不同B四種標(biāo)記引物的序列相同，但端標(biāo)記的熒光染料顏色不同C四種標(biāo)記引物的序列不同，其端標(biāo)記的熒光染料顏色也不同D四種標(biāo)記引物的序列不同，其端標(biāo)記的熒光染料顏色也不同E四種標(biāo)記引物的序列不同，其端標(biāo)記的熒光染料顏色也不同23. 下列有關(guān)多色熒光標(biāo)記引物法的敘述中，不正確的是（ ）A需將熒光染料預(yù)先標(biāo)記在測序反應(yīng)所用

9、引物的端B四種引物的序列相同，但標(biāo)記的熒光染料顏色不同CA、T、C、G四個測序反應(yīng)必需分管進(jìn)行D上樣時需分別在不同泳道內(nèi)電泳E特定顏色熒光標(biāo)記的引物則與特定的雙脫氧核苷酸底物保持對應(yīng)關(guān)系24. 一般來說，DNA測序圖中，其橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)的意義是（ ）A橫坐標(biāo)代表熒光波長種類，縱坐標(biāo)代表時間B橫坐標(biāo)代表熒光波長種類和強(qiáng)度，縱坐標(biāo)代表時間C橫坐標(biāo)代表時間，縱坐標(biāo)代表熒光波長種類D橫坐標(biāo)代表時間，縱坐標(biāo)代表熒光波長種類和強(qiáng)度E橫坐標(biāo)代表熒光波長種類，縱坐標(biāo)代表熒光波長強(qiáng)度25. 下列有關(guān)DNA自動測序儀自動進(jìn)樣器區(qū)功能的敘述中，不正確的是（ ）A毛細(xì)管進(jìn)入樣品盤標(biāo)本孔中進(jìn)樣依靠自動進(jìn)樣器的移動完成B

10、電極和毛細(xì)管一般均固定不動C兩級間極高的電勢差可促進(jìn)DNA分子在毛細(xì)管中很快泳動D電極為電泳的正性電極E樣品盤有48孔和96孔兩種，可一次性連續(xù)測試48或96個樣本26. 下列有關(guān)DNA自動測序儀凝膠塊區(qū)功能的敘述中，不正確的是（ ）A電泳時緩沖液閥關(guān)閉B電極為電泳的正性電極C在分析每一個樣品前，泵自動沖掉上一次分析用過的膠，灌入新膠D注射器驅(qū)動桿可給注射器提供正壓力，將注射器內(nèi)的凝膠注入毛細(xì)管中E玻璃注射器可儲存凝膠高分子聚合物以及在填充毛細(xì)管時提供必要的壓力27. 平板電泳型DNA測序儀的測序長度一般為（ ）A600bp900bpB400bp600bpC200bp400bp D900bp1

11、000bpE300bp500bp28. 毛細(xì)管電泳型DNA測序儀的測序長度一般為（ ）A600bp900bpB400bp600bpC200bp400bp D900bp1000bpE300bp500bp【X型題】每題的備選答案中有兩個或者兩個以上正確答案。1. 目前DNA測序儀的工作原理，主要是利用（ ）AEdman降解法B雙脫氧鏈末端終止法C化學(xué)降解法 D氧化還原法E水解法2. 下列有關(guān)多色熒光標(biāo)記引物法的敘述中，正確的是（ ）A需將熒光染料預(yù)先標(biāo)記在測序反應(yīng)所用引物的端B四種引物的序列相同，但標(biāo)記的熒光染料顏色不同CA、T、C、G四個測序反應(yīng)必需分管進(jìn)行D上樣時需分別在不同泳道內(nèi)電泳E特定顏

12、色熒光標(biāo)記的引物則與特定的雙脫氧核苷酸底物保持對應(yīng)關(guān)系3. 下列哪些熒光標(biāo)記法必需將A、T、C、G四個測序反應(yīng)分管進(jìn)行（ ）A單色熒光標(biāo)記引物法B單色熒光標(biāo)記終止底物法C多色熒光標(biāo)記引物法D多色熒光標(biāo)記終止底物法E多色熒光標(biāo)記法4. 下列有關(guān)單色熒光標(biāo)記法原理的敘述中，正確的是（ ）A需將A、G、C、T四管反應(yīng)分管進(jìn)行B上樣時需在不同泳道電泳C可用于標(biāo)記ddNTP，也可用于標(biāo)記引物D有可能因泳道間遷移率不同而影響測序精度E僅適用于標(biāo)記ddNTP，而不能標(biāo)記引物5. 平板電泳型DNA測序儀電泳時儀器顯示無電流，可能原因有（ ）A電極導(dǎo)線未接好或損壞B電泳緩沖液配制不正確C正極或負(fù)極鉑金絲斷裂D正

13、極或負(fù)極的膠面未浸入緩沖液中E倒膠時有氣泡形成6. 采用熒光標(biāo)記終止底物法的測序反應(yīng)體系中，包含（ ）ADNA模板B引物CdNTPDddNTPE水解酶7. 毛細(xì)管電泳型DNA測序儀電泳時儀器顯示無電流，可能原因有（ ）A電泳緩沖液蒸發(fā)使液面降低，而未能接觸到毛細(xì)管的兩端B毛細(xì)管內(nèi)有氣泡C毛細(xì)管未浸入緩沖液中D電極彎曲而無法浸入緩沖液中E加熱板溫度過高8. 導(dǎo)致毛細(xì)管電泳型DNA測序儀電極彎曲的原因有（ ）A測序時未進(jìn)行電極定標(biāo)操作就直接執(zhí)行電泳命令B自動進(jìn)樣器上有灰塵沉積C運(yùn)行前未將樣品盤歸位D進(jìn)行電極定標(biāo)操作時X/Y軸歸位尚未結(jié)束就運(yùn)行Z軸歸位E凝膠干燥而阻塞毛細(xì)管9. 平板電泳型DNA測序

14、儀電泳時儀器顯示無電流，可能原因有（ ）A電泳緩沖液配制不正確B電極導(dǎo)線未接好或損壞C正極或負(fù)極鉑金絲斷裂D正極或負(fù)極的膠面未浸入緩沖液中E電泳緩沖液蒸發(fā)使液面降低，而未能接觸到毛細(xì)管的兩端10. Sanger雙脫氧鏈末端終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)降解法的共同點(diǎn)包括（ ）A反應(yīng)體系中均有ddNTPB都是根據(jù)在某一固定的點(diǎn)開始核苷酸鏈的延伸，隨機(jī)在某一個特定的堿基處終止C均產(chǎn)生A、T、C、G四組不同長度的一系列核苷酸鏈D均在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳進(jìn)行片段的分離和檢測E均可檢測DNA的一級結(jié)構(gòu)11. 在Sanger雙脫氧鏈末端終止法測序反應(yīng)體系中，ddNTP與dNTP相比的異同點(diǎn)有（

15、 ）AddNTP在脫氧核糖的位置上缺少一個羥基BddNTP在脫氧核糖的位置上缺少一個羥基CDNA鏈在摻入dNTP的位置終止鏈的延伸D均可與正在延伸的DNA鏈的末端脫氧核糖-OH發(fā)生反應(yīng)EddNTP不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵12. 下列有關(guān)Sanger雙脫氧鏈末端終止法測序反應(yīng)體系反應(yīng)原理的敘述中，正確的是（ ）A加入的核苷酸單體包括dNTP和ddNTPB低溫退火時，引物與模板形成雙鏈區(qū)C沿著-的方向形成新鏈DDNA聚合酶結(jié)合到DNA雙鏈區(qū)上啟動DNA的合成E形成的新生鏈與模板完全互補(bǔ)配對13. 下列有關(guān)DNA自動測序儀自動進(jìn)樣器區(qū)功能的敘述中，正確的是（ ）A毛細(xì)管進(jìn)入樣品盤標(biāo)本孔中進(jìn)

16、樣依靠自動進(jìn)樣器的移動完成B電極和毛細(xì)管一般均固定不動CDNA分子在毛細(xì)管中泳動的動力來自于兩級間極高的壓力差D電極為電泳的正性電極E樣品盤有48孔和96孔兩種，可一次性連續(xù)測試48或96個樣本14. 下列有關(guān)DNA自動測序儀凝膠塊區(qū)功能的敘述中，正確的是（ ）A電泳時緩沖液閥打開B電極為電泳的負(fù)性電極C在分析每一個樣品前，泵自動沖掉上一次分析用過的膠，灌入新膠D注射器驅(qū)動桿可給注射器提供正壓力，將注射器內(nèi)的凝膠注入毛細(xì)管中E玻璃注射器可儲存凝膠高分子聚合物以及在填充毛細(xì)管時提供必要的壓力15. 下列有關(guān)縮微生物處理器結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)的敘述中，正確的是（ ）A基本結(jié)構(gòu)為2層玻璃薄片和2層聚二甲基

17、硅氧烷薄片B其形狀為圓盤狀，直徑僅10厘米C可完成納升級標(biāo)本的Sanger DNA測序D微瓣膜的功能包括在熱循環(huán)反應(yīng)時封閉反應(yīng)小室，為反應(yīng)提供封閉的空間E毛細(xì)管電泳通道由上下來回迂回的U型管道構(gòu)成，總長度為30cm三、問答題1簡述雙脫氧鏈末端終止法測序原理。2簡述多色熒光標(biāo)記引物法的原理。3簡述多色熒光標(biāo)記終止底物法的原理。4熒光標(biāo)記引物法和熒光標(biāo)記終止底物法有哪些不同之處？5多色熒光標(biāo)記DNA的檢測原理是什么？6多色熒光標(biāo)記DNA的檢測有哪些優(yōu)點(diǎn)？7與同位素標(biāo)記相比，熒光標(biāo)記在DNA測序中有哪些優(yōu)點(diǎn)？8簡要介紹介紹全自動測序儀的基本結(jié)構(gòu)。9簡要說明DNA自動測序儀檢測區(qū)基本結(jié)構(gòu)及功能。10毛

18、細(xì)管電泳型DNA測序儀電泳時儀器顯示無電流，常見的原因是什么？11導(dǎo)致毛細(xì)管電泳型DNA測序儀電極彎曲的常見原因是什么？12毛細(xì)管電泳型DNA測序儀電泳時產(chǎn)生電弧，常見的原因是什么？13簡述平板電泳型DNA測序儀的常見故障及維護(hù)。14簡述全自動DNA測序儀主要應(yīng)用于哪些方面？15簡述蛋白質(zhì)測序儀的結(jié)構(gòu)及其各部件的功能。16簡述蛋白質(zhì)測序儀的主要應(yīng)用。17簡述縮微生物處理器的檢測原理及其特點(diǎn)。18簡述蛋白質(zhì)測序儀的工作原理。習(xí) 題 參 考 答 案一、名詞解釋1熒光標(biāo)記引物法：將熒光染料預(yù)先標(biāo)記在測序反應(yīng)所用引物的端，稱為熒光標(biāo)記引物法。2熒光標(biāo)記終止底物法：將熒光染料標(biāo)記在作為終止底物的雙脫氧單

19、核苷酸上，稱為熒光標(biāo)記終止底物法。 3多色熒光標(biāo)記引物法：是DNA測序反應(yīng)常用的一種熒光標(biāo)記方法。將熒光染料預(yù)先標(biāo)記在測序反應(yīng)所用引物的端，當(dāng)相同堿基排列的寡核苷酸鏈作為骨架分別被4種熒光染料標(biāo)記后，便形成了一組（4種）標(biāo)記引物。特定顏色熒光標(biāo)記的引物則與特定的雙脫氧核苷酸底物保持對應(yīng)關(guān)系。4多色熒光標(biāo)記終止底物法：是DNA測序反應(yīng)常用的一種熒光標(biāo)記方法。將熒光染料標(biāo)記在作為終止底物的雙脫氧單核苷酸上。反應(yīng)中將4種ddNTP分別用4種不同的熒光染料標(biāo)記，帶有熒光基團(tuán)的ddNTP在摻入DNA片段導(dǎo)致鏈延伸終止的同時，也使該片段端標(biāo)上了一種特定的熒光染料。根據(jù)熒光顏色的不同來判斷所代表的不同堿基信

20、息。5Edman降解法：是檢測蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的方法。在弱堿條件下，多肽鏈N末端NH2與PITC反應(yīng)，生成PTC多肽。在無水強(qiáng)酸如三氟醋酸的作用下，可使PTC多肽形成ATZ衍生物和一個失去末端氨基酸的剩余多肽。剩余多肽鏈可以進(jìn)行下一次以及后續(xù)的降解循環(huán)。如此不斷循環(huán)，可依次使多肽鏈的氨基酸逐一降解，形成ATZ衍生物。ATZ衍生物經(jīng)水溶酸處理轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的PTH氨基酸。6Sanger雙脫氧鏈末端終止法：是檢測DNA序列的一種方法。其原理是利用PCR，但反應(yīng)體系中除了dNTP外，還有ddNTP。ddNTP可摻入到正在延伸的DNA鏈中，但不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，從而使正在延伸的DNA鏈在此終

21、止。由于存在ddNTP與dNTP的競爭，生成的反應(yīng)產(chǎn)物是一系列長度不同的多核苷酸片段。7平板電泳型DNA測序儀：為DNA測序儀的一種類型。平板型電泳的凝膠灌制在兩塊玻璃板中間，聚合后厚度一般小于0.4mm或更少，因此又稱為超薄片層凝膠電泳。它具有樣品判讀序列長（600bp900bp）、一塊凝膠板上可同時進(jìn)行多個樣品測序的優(yōu)點(diǎn)。8毛細(xì)管電泳型DNA測序儀：為DNA測序儀的一種類型。將凝膠高分子聚合物灌制于毛細(xì)管中（內(nèi)徑50mm100mm），在高壓及較低濃度膠的條件下實(shí)現(xiàn)DNA片段的快速分離。9縮微生物處理器：是一種新型DNA自動測序裝置。其基本結(jié)構(gòu)為3層玻璃薄片和一層聚二甲基硅氧烷薄片，各層間緊

22、密粘合形成圓盤狀，直徑僅10厘米。在這些薄片之間有各種反應(yīng)小室、毛細(xì)管電泳通道和微瓣膜，可完成納升級標(biāo)本的Sanger DNA測序。二、選擇題【A型題】1B 2C 3E 4D 5C 6B 7C 8E 9A 10D 11D 12E 13C 14C 15C 16B 17B 18C 19C 20D21E 22A 23D 24D 25D 26A 27A 28E【X型題】1BC 2BCE 3ABC 4ABCD 5ABCD6ABCD 7ABCD 8ACD 9ABCD 10BCDE11BDE 12ABDE 13ABE 14ACDE 15BCDE三、問答題1簡述雙脫氧鏈末端終止法測序原理。答：雙脫氧鏈末端終止

23、法測序原理是利用DNA的體外合成過程。反應(yīng)體系中的核苷酸單體除了4種dNTP外，還有ddNTP。反應(yīng)過程中ddNTP雖然可以與正在延伸的DNA鏈的末端形成磷酸二酯鍵而摻入到DNA鏈中，但它們本身沒有-OH，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，從而使正在延伸的DNA鏈在此終止。據(jù)此原理分別設(shè)計四個反應(yīng)，每一反應(yīng)中存在相同的DNA模板、引物、四種dNTP和一種ddNTP(如ddATP)，則新合成的DNA鏈在可能摻入正常dNTP的位置都有可能摻入ddNTP而導(dǎo)致新合成鏈在不同的位置終止。由于存在ddNTP與dNTP的競爭，生成的反應(yīng)產(chǎn)物是一系列長度不同的多核苷酸片段。通過PAGE對長度不等的新生鏈進(jìn)

24、行分離后，就可根據(jù)片段大小直接讀出新生DNA鏈的序列。2. 簡述多色熒光標(biāo)記引物法的原理。答：熒光標(biāo)記引物法是指將熒光染料預(yù)先標(biāo)記在測序反應(yīng)所用引物的端。當(dāng)相同堿基排列的寡核苷酸鏈作為骨架分別被4種熒光染料標(biāo)記后，便形成了一組（4種）標(biāo)記引物。這四種引物的序列相同，但端標(biāo)記的熒光染料顏色不同。在測序反應(yīng)中，模板、反應(yīng)底物、DNA聚合酶及標(biāo)記引物等按A、T、C、G編號被置于4支微量離心管中，A、T、C、G四個測序反應(yīng)分管進(jìn)行，上樣時合并在一個泳道內(nèi)電泳。特定顏色熒光標(biāo)記的引物則與特定的雙脫氧核苷酸底物保持對應(yīng)關(guān)系。3. 簡述多色熒光標(biāo)記終止底物法的原理。答：熒光標(biāo)記終止底物法是指將熒光染料標(biāo)記在

25、作為終止底物的雙脫氧單核苷酸上。反應(yīng)中將4種ddNTP分別用4種不同的熒光染料標(biāo)記，帶有熒光基團(tuán)的ddNTP在摻入DNA片段導(dǎo)致鏈延伸終止的同時，也使該片段端標(biāo)上了一種特定的熒光染料。經(jīng)電泳后將各個熒光譜帶分開，根據(jù)熒光顏色的不同來判斷所代表的不同堿基信息。4. 熒光標(biāo)記引物法和熒光標(biāo)記終止底物法有哪些不同之處？答：熒光標(biāo)記引物法是將熒光染料預(yù)先標(biāo)記在測序反應(yīng)所用引物的端。熒光標(biāo)記終止底物法是將熒光染料標(biāo)記在作為終止底物的雙脫氧單核苷酸上。兩種摻入方式的區(qū)別在于，前者的熒光染料標(biāo)記過程和延伸反應(yīng)終止分別發(fā)生在同一DNA片段的兩端，且標(biāo)記發(fā)生在引物與模板的退火過程中，而終止是發(fā)生在片段延伸過程中

26、，兩者在時間上有一定間隔。而后者使標(biāo)記和終止過程合二為一，兩者在同一時間完成。在具體操作中，前者要求A、C、G、T四個反應(yīng)分別進(jìn)行，而后者的四種反應(yīng)可以在同一管中完成。5. 多色熒光標(biāo)記DNA的檢測原理是什么？答：在采用多色熒光標(biāo)記DNA的自動測序系統(tǒng)中，兩極間極高的電勢差推動各個熒光DNA片段在凝膠高分子聚合物中從負(fù)極向正級泳動并達(dá)到相互分離，且依次通過檢測窗口。激光器發(fā)出的光束激發(fā)熒光DNA片段，熒光發(fā)色基團(tuán)發(fā)射出特征波長的熒光。這種代表不同堿基信息的不同顏色熒光經(jīng)過光柵分光后再投射到CCD攝像機(jī)上同步成像。收集的熒光信號再傳輸給計算機(jī)加以處理。整個電泳過程結(jié)束時在檢測區(qū)某一點(diǎn)上采集的所有

27、熒光信號就轉(zhuǎn)化為一個以時間為橫軸坐標(biāo)，熒光波長種類和強(qiáng)度為縱軸的信號數(shù)據(jù)的集合。6. 多色熒光標(biāo)記DNA的檢測有哪些優(yōu)點(diǎn)？答：由于采用多色熒光標(biāo)記技術(shù)，一個樣本的四個測序反應(yīng)產(chǎn)物可以同時在一個泳道內(nèi)電泳，避免單一標(biāo)記時四個泳道測序因泳道間遷移率不同對精確度的影響，提高了測序精度。另外，一個樣品所有反應(yīng)產(chǎn)物只需進(jìn)樣一次，所以一次實(shí)驗(yàn)便可以處理較之手工方法更多的樣品。在相同樣品數(shù)的情況下，加樣的工作量也大大減少。7. 與同位素標(biāo)記相比，熒光標(biāo)記在DNA測序中有哪些優(yōu)點(diǎn)？答：電泳后對不同長度DNA新生鏈進(jìn)行分析時，需要有可以檢測的示蹤信號。早期采用同位素法標(biāo)記新生鏈，因其具有放射性危害、背景高等缺點(diǎn)

28、而很快被熒光染料標(biāo)記法所取代。熒光染料的熒光和散射背景較弱，提高了信噪比；它們的激發(fā)光譜較接近而發(fā)射光譜均位于可見光范圍，且不同染料的發(fā)射光譜相互分開，易于監(jiān)測，故在DNA自動測序中得到廣泛應(yīng)用。8. 簡要介紹介紹全自動測序儀的基本結(jié)構(gòu)。答：全自動DNA測序儀主要由主機(jī)、微型計算機(jī)和各種應(yīng)用軟件等組成。主機(jī)主要包括電泳系統(tǒng)、激光器和熒光檢測系統(tǒng)等。大致可分為以下幾個結(jié)構(gòu)功能區(qū)：(1)自動進(jìn)樣器區(qū)：裝載有樣品盤、電極（負(fù)極）、電極緩沖液瓶、洗滌液（蒸餾水）瓶和廢液管。(2)凝膠塊區(qū)：括注射器驅(qū)動桿、樣品盤按鈕、注射器固定平臺、電極（正極）、緩沖液閥、玻璃注射器、毛細(xì)管固定螺母和廢液閥等部件。(3

29、)檢測區(qū) 檢測區(qū)內(nèi)有激光檢測器窗口及窗蓋、加熱板、毛細(xì)管、熱敏膠帶。9. 簡要說明DNA自動測序儀檢測區(qū)基本結(jié)構(gòu)及功能。答：DNA自動測序儀檢測區(qū)基本結(jié)構(gòu)包括：激光檢測器窗口及窗蓋：激光檢測器窗口正對毛細(xì)管檢測窗口，從儀器內(nèi)部的氬離子激光器發(fā)出的激光可通過激光檢測器窗口照到毛細(xì)管檢測窗口上。電泳過程中，當(dāng)熒光標(biāo)記DNA鏈上的熒光基團(tuán)通過毛細(xì)管窗口時，受到激光的激發(fā)而產(chǎn)生特征性的熒光光譜，熒光經(jīng)分光光柵分光后投射到CCD攝像機(jī)上同步成像。窗蓋起固定毛細(xì)管的作用，同時可防止激光外泄；加熱板：電泳過程中起加熱毛細(xì)管的作用，一般維持在50；毛細(xì)管：為填充有凝膠高分子聚合物的玻璃管，直徑為50mm，電泳

30、時樣品在毛細(xì)管內(nèi)從負(fù)極向正極泳動；熱敏膠帶：將毛細(xì)管固定在加熱板上。10. 毛細(xì)管電泳型DNA測序儀電泳時儀器顯示無電流，常見的原因是什么？答：最常見的原因是由于電泳緩沖液蒸發(fā)使液面降低，而未能接觸到毛細(xì)管的兩端（或一端）。其它可能原因包括電極彎曲而無法浸入緩沖液中、毛細(xì)管未浸入緩沖液中、毛細(xì)管內(nèi)有氣泡等。因此，遇到此類問題時，應(yīng)首先檢查電極緩沖液，然后再檢查電極和毛細(xì)管。11. 導(dǎo)致毛細(xì)管電泳型DNA測序儀電極彎曲的常見原因是什么？答：主要原因是安裝、調(diào)整或清洗電極后未進(jìn)行電極定標(biāo)操作就直接執(zhí)行電泳命令，電極不能準(zhǔn)確插入各管中而被樣品盤打彎。其它如運(yùn)行前未將樣品盤歸位、或雖然執(zhí)行了歸位操作，

31、但X/Y軸歸位尚未結(jié)束就運(yùn)行Z軸歸位等情況下，也容易將電極打彎。12. 毛細(xì)管電泳型DNA測序儀電泳時產(chǎn)生電弧，常見的原因是什么？答：主要原因是電極、加熱板或自動進(jìn)樣器上有灰塵沉積，此時應(yīng)立即停機(jī)，并清洗電極、加熱板或自動進(jìn)樣器。13. 簡述平板電泳型DNA測序儀的常見故障及維護(hù)。答：(1)電泳時儀器顯示無電流 可能原因包括：電泳緩沖液配制不正確；電極導(dǎo)線未接好或損壞；正極或負(fù)極鉑金絲斷裂；正極或負(fù)極的膠面未浸入緩沖液中。(2)傳熱板粘住膠板 主要原因?yàn)樯戏降木彌_液室漏液。此時應(yīng)將上方的緩沖液倒掉，并卸下緩沖液室，松開膠板固定夾，將傳熱板順著膠板向上滑動，直至與膠板分開。清洗傳熱板，同時檢查緩

32、沖液室漏液的原因，并采取相應(yīng)措施，防止漏液。(3)其它 倒膠前應(yīng)按照操作要求認(rèn)真清洗玻璃板，用未清洗干凈的膠板倒膠時易產(chǎn)生氣泡、或者產(chǎn)生較高的熒光背景；配制凝膠時應(yīng)注意膠的濃度、TEMED含量、尿素濃度等，并注意防止其它物質(zhì)（尤其是熒光物質(zhì)）的污染；倒膠時需注意不能有氣泡，用固定夾固定膠板時，四周的力度應(yīng)均勻一致；將待測樣品加入各孔前，應(yīng)使用緩沖液沖洗各孔，把尿素沖去，以免影響電泳效果。14. 全自動DNA測序儀主要應(yīng)用于哪些方面？全自動DNA測序儀主要應(yīng)用在人類基因組測序；人類遺傳病、傳染病和癌癥的基因診斷；法醫(yī)的親子鑒定和個體識別；生物工程藥物的篩選；動植物雜交育種等方面。15. 簡述蛋白質(zhì)測序儀的結(jié)構(gòu)及其功能。答：蛋白質(zhì)測序儀包括測序反應(yīng)系統(tǒng)、分析系統(tǒng)和數(shù)椐處理系統(tǒng)。(1)測序反應(yīng)系統(tǒng)具有4個微管。其主要部件為反應(yīng)器。因?yàn)榉磻?yīng)條件要求一定的溫度、時間、液體流量等，所以系統(tǒng)計算機(jī)具備調(diào)節(jié)控制這些因素。蛋白質(zhì)或多肽在這里被水解為單個氨基酸殘基。