細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)修改版

1、實(shí)驗(yàn)一 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作一、器材與藥品（每實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備量）（一）普通器材名 稱數(shù) 量備 注普通天平1臺(tái)大酒精瓶3只量筒1000ml、250ml各一只500ml鹽水瓶1只玻璃棒2支火柴，標(biāo)簽紙，記號(hào)筆等（二）無(wú)菌器材名 稱數(shù) 量備 注100ml或250ml鹽水瓶70只大翻70個(gè)10ml吸管3支5ml吸管5支1ml吸管1支青霉素瓶120只青霉素瓶塞120個(gè)（三）藥品名 稱數(shù) 量備 注重鉻酸鉀2400g濃H2SO44000ml雙蒸水5000ml由技術(shù)室提前準(zhǔn)備青霉素10000單位/ml鏈霉素10 000g/mlNaHCO3， KCl ，NaCl，Na2HPO412H2O， KH2PO4，結(jié)晶紫，甲醛，無(wú)水

2、酒精等二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一）配清潔液成 分量備 注重鉻酸鉀2400g重鉻酸鉀溶于水中有時(shí)不能完全溶解，預(yù)先用2000ml熱水助其溶解，再加入足量自來(lái)水，最后緩慢加濃硫酸。濃硫酸4000ml自來(lái)水20000ml切記：濃硫酸要緩慢加入，且邊加邊攪拌?。ǘ┢渌囵B(yǎng)用液的配制及分工（學(xué)生分為三大組）1、RPMI-1640培養(yǎng)液 成分量備 注RPMI-16402袋攪拌溶解后過(guò)濾除菌，每瓶按100ml分裝，塞好大翻，并注明名稱配制日期和組別。每實(shí)驗(yàn)室20瓶。每小組1瓶。NaHCO34.0 g2000ml大酒精瓶1只；無(wú)菌100ml鹽水瓶20只。2、無(wú)菌分裝5.6NaHCO3成分量備 注無(wú)菌5.6NaHCO3

3、50ml按照3ml/瓶分裝，每室16瓶，每小組1瓶。無(wú)菌操作。無(wú)菌青霉素瓶16只；無(wú)菌5ml吸管1支。 3、無(wú)菌分裝1胰酶（技術(shù)室提供） 成分量備 注無(wú)菌1胰酶20ml按照1ml/瓶分裝，每室16瓶，每小組1瓶。無(wú)菌操作。無(wú)菌青霉素瓶16只；無(wú)菌1ml吸管1支。4、Hanks液（母液由技術(shù)室提供）成分量備 注A液100按照1：1：18比例進(jìn)行配比混勻，總量為2000ml，過(guò)濾除菌，然后按照每瓶500ml分裝，并注明名稱配制日期，每室4瓶。B液100雙蒸水1800無(wú)菌10ml吸管2支，1000ml量筒1只，1000ml大酒精瓶1只，無(wú)菌100ml鹽水瓶20只。5、雙抗成分量備 注青霉素（80萬(wàn)U

4、）2瓶配制雙抗終濃度為： 16000單位/ml；鏈霉素10000g/ml。按5ml/瓶分裝，瓶口貼好膠布作好標(biāo)記，膠布上注明配制日期和組別。每室16瓶。每小組1瓶。20保存?zhèn)溆?。鏈霉素?g) 1瓶無(wú)菌Hank s液100ml無(wú)菌5ml吸管1支，無(wú)菌青霉素瓶16只。6、血清的滅活和分裝成分量備 注無(wú)菌小牛血清150ml總量為150ml， 56的水浴鍋中進(jìn)行熱滅活，滅活時(shí)間30min，后按照每瓶5ml分裝，并在瓶口處貼好膠布作好標(biāo)記，膠布上寫好日期和組別。每實(shí)驗(yàn)室30瓶。每小組2瓶。20保存?zhèn)溆?。無(wú)菌5ml吸管1支，無(wú)菌青霉素瓶30只。7、1PBS配制成分量備 注NaCl8.0 g總量為1000

5、ml，每瓶按70ml分裝，用硫酸紙包好瓶口，待高壓滅菌后第二天派人再換大翻保存。每實(shí)驗(yàn)室15瓶。每小組1瓶。KCl0.2gNa2HPO412H2O2.9gKH2PO40.2g去離子水至1000ml標(biāo)好1000ml刻度的酒精瓶或1000ml容量瓶1只，無(wú)菌100ml鹽水瓶15個(gè)。8、染色液成分量備 注結(jié)晶紫0.5g溶解、混勻，濾紙過(guò)濾甲醛10mlNaCl0.8g無(wú)水乙醇50ml去離子水加至100ml250ml量筒1只，500ml鹽水瓶1只。9、分裝VTP（由技術(shù)室提供）成分量備 注無(wú)菌VTP70ml無(wú)菌操作按4ml/瓶分裝，并注明日期和組別。每實(shí)驗(yàn)室15瓶。無(wú)菌5ml吸管1支，無(wú)菌青霉素瓶15只

6、。未特別說(shuō)明上述試劑均放置28冰箱保存?zhèn)溆?。每組完成后統(tǒng)一收好，下次再分配到各小組。備注：常規(guī)實(shí)驗(yàn)室用品注意更換，包括酒精缸和酒精燈，棉球，一次性臺(tái)布等。實(shí)驗(yàn)二 雞胚原代成纖維細(xì)胞的制備與培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆针u胚原代成纖維細(xì)胞的制備及培養(yǎng)的基本步驟；掌握活細(xì)胞的顯微鏡下觀察；熟悉病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的基本判斷方法。二、實(shí)驗(yàn)原理離體動(dòng)物組織通過(guò)溫和的手段（機(jī)械和酶消化）形成單個(gè)細(xì)胞后，在適宜的外界環(huán)境中，包括溫度、酸堿度和氣相環(huán)境，并給予充足合適的營(yíng)養(yǎng)條件，能生存、生長(zhǎng)形成單層細(xì)胞，這種原代培養(yǎng)的細(xì)胞具有原來(lái)體內(nèi)所具備的基本特性，比如肌肉細(xì)胞的收縮功能；上皮細(xì)胞的分泌功能等。通常把這種從體內(nèi)取出組織

7、細(xì)胞開(kāi)始培養(yǎng)到第一次進(jìn)行傳代之前的這一段時(shí)期稱為原(初)代培養(yǎng)。原代細(xì)胞最接近體內(nèi)細(xì)胞的特性，因而對(duì)外界環(huán)境的變化也最敏感，因此比較適合病毒的增殖，藥物的作用機(jī)制等的研究。 三、實(shí)驗(yàn)材料（按2人/組的量發(fā)放）911日齡雞胚1只，碘酒和酒精棉球若干，無(wú)菌器械一套，無(wú)菌無(wú)毒平皿2只；5或10ml吸管4支，1或5ml吸管1支，長(zhǎng)青霉素瓶2只（帶塞）；Hank s 液1瓶，RPMI-1640 1瓶，雙抗1瓶（5ml）；胰蛋白酶1瓶（1ml），血清1瓶（5ml），5.6NaHCO31瓶四、操作步驟1）碘酒和酒精棉球分別拭擦雞胚氣室外卵殼；2）取出兩只無(wú)菌平皿，并標(biāo)記和，待用。3）在RPMI-1640和H

8、anks 液中分別無(wú)菌操作以1的量加入雙抗，吸出1015mlHanks 液至無(wú)菌平皿中備用； 4）大鑷子輕敲卵殼頂部然后小心去掉氣室外卵殼； 5）消毒鑷子后小心撕破卵膜，兩人互相配合取出雞胚置于盛有Hanks 液的平皿中，小心去頭、內(nèi)臟、爪和粘液及血球，洗滌后置于盛有Hanks 液的平皿中，再充分洗滌；6）取出洗凈的組織塊置于大青霉素瓶中，在火焰附近用無(wú)菌眼科剪刀將其剪成約0.51mm3的小塊（約250次），此時(shí)體積約0.5ml；用Hank s 液洗滌兩次。7）加入1 ml 1胰蛋白酶，用適量Hank s 液調(diào)整使其工作濃度為0.25，5.6NaHCO3調(diào)節(jié)pH至約7.38.0（肉眼觀為肉紅色

9、，1 ml吸管約23滴）蓋上瓶塞，寫好標(biāo)記；8）將上述細(xì)胞瓶置于37水浴中，開(kāi)始計(jì)時(shí)，約1530min，其間緩慢搖勻以充分消化。消化停止的標(biāo)志是：輕輕晃動(dòng)后細(xì)胞懸起，呈云霧狀，很快聚集成團(tuán)，表明細(xì)胞活力好。9）消化結(jié)束后，取出，稍沉淀，緩慢吸出上清，用Hanks 液小心洗滌23次，可以盡量減少胰蛋白酶的殘留量，然后加入RPMI-1640液約5ml，用小頭吸管充分吹打，使細(xì)胞充分分散。吸上清；重復(fù)操作34次，收集細(xì)胞上清。10） 經(jīng)四層無(wú)菌紗布或200目不銹鋼鋼網(wǎng)過(guò)濾后收集濾液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度大約1106/ml；或上述細(xì)胞懸液自然沉降，待未消化徹底的組織塊沉入瓶底后，收集上清，并加入足

10、量的小牛血清（終濃度為10）。11）將上述制備好的細(xì)胞懸液平均分配到兩個(gè)細(xì)胞瓶中，5ml/瓶，塞好螺口塞，注意生長(zhǎng)面朝下，在非生長(zhǎng)面上做好標(biāo)記，包括細(xì)胞名稱，接種培養(yǎng)時(shí)間，組別及姓名等。12）細(xì)胞統(tǒng)一置于本室指定的37，5CO2孵箱中培養(yǎng)。13）24h后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，如果細(xì)胞長(zhǎng)成單層，細(xì)胞界限清晰，大多數(shù)細(xì)胞為梭形并貼壁，布滿細(xì)胞瓶的生長(zhǎng)面，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。實(shí)驗(yàn)三 濾泡性口炎病毒（VSV）的增殖（純培養(yǎng)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆詹《驹诩?xì)胞內(nèi)增殖的基本判斷方法。二、實(shí)驗(yàn)原理原代細(xì)胞最接近體內(nèi)細(xì)胞的特性，因而對(duì)外界環(huán)境的變化也最敏感，因此比較適合病毒的增殖，藥物的作用機(jī)制等研究。 病毒在細(xì)胞內(nèi)增

11、殖的檢測(cè)指標(biāo)有細(xì)胞變化、紅細(xì)胞吸附、細(xì)胞代謝改變、干擾現(xiàn)象、免疫熒光法檢測(cè)等。由病毒引起的細(xì)胞病變稱細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），常見(jiàn)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化為細(xì)胞變圓、聚集、融合、裂解或脫落等。三、實(shí)驗(yàn)材料（按2人/組的量發(fā)放）200TCID50的VSV病毒0.1ml，5ml和1ml吸管各一支，維持液（含3小牛血清的RPMI-1640液）。四、操作步驟1）上述原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)24h后，一旦細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)良好后，則輕棄培養(yǎng)上清，換上細(xì)胞維持液（含3小牛血清的RPMI-1640），接種200TCID50的VSV0.1ml，在細(xì)胞瓶上標(biāo)記換液時(shí)間，接種病毒量。正常對(duì)照也按

12、照上述方法換上維持液。2）再繼續(xù)培養(yǎng)，每間隔1224h觀察，直至全部細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變，顯微鏡觀察細(xì)胞脫落，圓縮，則可停止培養(yǎng)。3）收集全班的病毒培養(yǎng)物于100ml無(wú)菌鹽水瓶中，寫好標(biāo)記，置于20冰箱充分冷凍后再置于4冰箱或室溫下解凍，該過(guò)程稱為凍融。反復(fù)凍融三次后，細(xì)胞膜破壞，釋放出胞內(nèi)病毒。低速離心，棄細(xì)胞碎片沉渣，收集上清即為病毒懸液。留樣測(cè)定病毒的TCID50。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、雞胚原代成纖維細(xì)胞的顯微鏡下觀察。2、VSV攻擊雞胚原代成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的觀察。3、病毒收獲的方法。實(shí)驗(yàn)四 Hep-2細(xì)胞的傳代培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆占?xì)胞傳代培養(yǎng)的方法及其應(yīng)用。二、實(shí)驗(yàn)原理體外

13、培養(yǎng)的細(xì)胞由于細(xì)胞游出數(shù)量增加，單層培養(yǎng)細(xì)胞相互匯合，整個(gè)瓶底逐漸被細(xì)胞覆蓋。這時(shí)需要進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會(huì)因生存空間不足或密度過(guò)大，營(yíng)養(yǎng)障礙，影響細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)。細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過(guò)程稱之為傳代；進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代。細(xì)胞培養(yǎng)傳代根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代；部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。三、實(shí)驗(yàn)材料傳代細(xì)胞：人喉癌細(xì)胞（Hep-2）（每?jī)扇艘黄浚?；所需溶液：PBS 、VTP、RPMI-1640液、血清；其他：5 ml吸管、10ml吸管、細(xì)

14、胞瓶。四、操作步驟1）將已長(zhǎng)成單層的細(xì)胞生長(zhǎng)面朝上輕輕倒掉培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗滌兩次，注意吸管尖頭不要伸到細(xì)胞瓶中。2）用上述吸管吸取1mlVTP加入細(xì)胞瓶中，鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)面即可；室溫或手握住消化，約35min。顯微鏡下觀察細(xì)胞胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，即可停止消化。盡可能棄盡消化液，繼續(xù)利用殘余的消化液消化，直至細(xì)胞大部分易在外力作用下從細(xì)胞瓶表面脫落下來(lái)為止。3）加入少量RPMI-1640液于細(xì)胞瓶中，用小頭吸管吹打瓶壁細(xì)胞以及脫落細(xì)胞使細(xì)胞充分均勻，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔不要用力過(guò)猛，盡可能不要出現(xiàn)泡沫。4）計(jì)數(shù)：用吸管吹打細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液與等量0.04臺(tái)盼蘭混勻，在計(jì)數(shù)板上蓋玻

15、片的一側(cè)加該細(xì)胞懸液，加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過(guò)少或帶氣泡。計(jì)算細(xì)胞濃度。5）用RPMI-1640制備成1106/ml濃度的細(xì)胞懸液，并按10的量加入小牛血清。6）將上述細(xì)胞懸液分裝5ml到新細(xì)胞瓶中，塞好塞子，標(biāo)記后送培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后觀察。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯微鏡下觀察Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)良好，已長(zhǎng)滿單層，細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形，透光性良好。實(shí)驗(yàn)五 VSV TCID50滴定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆詹《綯CID50滴定的基本原理和計(jì)算方法以及應(yīng)用。二、實(shí)驗(yàn)原理多數(shù)病毒感染體外培養(yǎng)的細(xì)胞后，常引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞團(tuán)縮、裂解和細(xì)胞腫大等，這種改變稱為病毒致病變效應(yīng)（cytopathic effect，C

16、PE），可以直接通過(guò)顯微鏡觀察，亦可通過(guò)染色得以識(shí)別和判斷。CPE的程度可間接反映病毒的毒力，因此利用這種特征可以用來(lái)測(cè)定病毒的毒力。即能在半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)板孔或試管內(nèi)引起細(xì)胞發(fā)生病變所需的病毒量定義為病毒的50組織細(xì)胞感染指數(shù)（50 tissue culture infectious dose，TCID50）。測(cè)定時(shí)，首先在微量細(xì)胞板上培養(yǎng)敏感細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁形成單層，棄上清。將待測(cè)病毒用維持液做10倍稀釋后加入細(xì)胞單層，逐日觀察，直至病毒產(chǎn)生的CPE不再進(jìn)展為止。具體時(shí)間根據(jù)病毒的增殖特點(diǎn)而定，如腸道病毒增殖迅速，一般48h即可；VSV增殖也較快，因此，48h72h也可以觀察、染色、計(jì)算。三、

17、實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞：Hep-2細(xì)胞株（實(shí)驗(yàn)四傳代所得），自備/組。病毒：水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV），自備/組。試劑：維持液，PBS，VTP等自備/組。材料：細(xì)胞板（1塊/組），tip頭（2盒/排），微量移液器，5ml或10ml吸管（2支/組），青霉素瓶帶塞（10個(gè)/排），酒精缸，鑷子（2個(gè)/排）四、操作步驟1）制備細(xì)胞：方法同實(shí)驗(yàn)四。一瓶細(xì)胞消化后加入營(yíng)養(yǎng)液制成所需細(xì)胞懸液，濃度約為1106/ml。用微量移液器將細(xì)胞懸液加入40孔板微孔中，每孔100l，37，5%CO2孵育箱培養(yǎng)24h，形成單層后，做病毒滴定用。2）50%組織細(xì)胞感染量（TCID5

18、0）測(cè)定（1）稀釋病毒液：取無(wú)菌青霉素瓶9支，各管分別加3%小牛血清的維持液2.7ml，然后向第一管加VSV病毒液0.3ml，反復(fù)吹吸混合三次，從第一管內(nèi)吸液0.3ml加入第二管內(nèi)，反復(fù)混合三次，從第二管內(nèi)吸液0.3ml加入第三管內(nèi)，反復(fù)混合三次，依此類推將待測(cè)的病毒液做連續(xù)10倍稀釋，使病毒稀釋為10-1，10-2，10-310-9。（2）病毒接種：將長(zhǎng)好單層細(xì)胞的培養(yǎng)板各孔細(xì)胞液全部?jī)A棄，用微量移液器把各稀釋度的VSV病毒從低濃度開(kāi)始依次加入各微孔中，每稀釋度平行加2孔，每孔100l。細(xì)胞對(duì)照孔不加病毒液，只加維持液。置37，5%CO2孵育箱中孵育。（3）結(jié)果觀察：于孵育后18、24、36

19、、48、72h在倒置顯微鏡下觀察CPE，病毒可引起細(xì)胞圓縮、堆聚及脫落現(xiàn)象?！?”表示細(xì)胞正常；“+”25%細(xì)胞產(chǎn)生病變、圓縮、破碎脫落；“2+”50%細(xì)胞產(chǎn)生病變；“3+”75%細(xì)胞產(chǎn)生病變；“4+”100%細(xì)胞產(chǎn)生病變。（實(shí)驗(yàn)時(shí)，觀察24h48h即可染色計(jì)算）3）計(jì)算TCID50參見(jiàn)下表表 VSV在Hep-2細(xì)胞上的TCID50結(jié)果記錄病毒稀釋度病變孔數(shù)/接種孔數(shù)累積數(shù)（孔）病變細(xì)胞孔有病變無(wú)病變比例百分比（%）10-38/810010/1010010-42/8262/82510-50/80140/14010-60/80220/22010-70/80300/30010-80/80380/3

20、80按表中，10-3稀釋的病變高于50%；10-4稀釋的病變低于50%；50%病變分布于10-3與10-4之間，計(jì)算公式如下： 高于50%病變率- （50%） 100-50 距離比例= lg稀釋倍數(shù) =- lg10 高于50%的病變率-低于50%的病變率 100-25 =-0.67lg TCID50=高于50%病變的低稀釋度對(duì)數(shù)+距離比=-3+(-0.67)= -3.67即1個(gè)TCID50=10-3.67，查0.67的反對(duì)數(shù)為4.68，即病毒做4.68103倍稀釋時(shí)取0.1ml接種細(xì)胞，即可使50%細(xì)胞產(chǎn)生病變。附錄：如何計(jì)算200個(gè)TCID50？4.38103200=23.4，將病毒作23.

21、4倍稀釋時(shí)即得200個(gè)TCID50。五、計(jì)算請(qǐng)計(jì)算提供的病毒的TCID50。六、寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告并計(jì)算給定的病毒的TCID50。實(shí)驗(yàn)六 干擾素活性（效價(jià)）的測(cè)定 （注：此實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)四時(shí)傳代培養(yǎng)所得）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆瘴⒘考?xì)胞病變抑制法測(cè)定干擾素效價(jià)的基本步驟以及結(jié)果分析。熟悉常用生物制品生物學(xué)活性測(cè)定的實(shí)際意義。了解影響結(jié)果的常見(jiàn)因素。二、基本原理病毒或其他干擾素誘生劑作用于巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞或成纖維細(xì)胞后，由細(xì)胞基因自身編碼產(chǎn)生的具有抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能的一類小分子糖肽，統(tǒng)稱為干擾素。干擾素發(fā)揮重要的酶的特性而抑制病毒DNA和蛋白質(zhì)的合成，從而抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖。因此具有間接的廣

22、譜抗病毒作用。為了進(jìn)一步確定人工方法制備的干擾素的生物學(xué)活性，需進(jìn)行體外抗病毒試驗(yàn)測(cè)定，即干擾素效價(jià)的測(cè)定。干擾素效價(jià)一般定義為：凡1ml干擾素標(biāo)本的最高稀釋度仍能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞（50）免受“攻擊病毒”損害者，該稀釋度的倒數(shù)即為干擾素的效價(jià)，即單位/毫升。三、測(cè)定方法測(cè)定干擾素效價(jià)的方法有多種，最常用的是“細(xì)胞病變抑制法”（Method of Cytopathic effect inhibition assay，簡(jiǎn)稱CPE法）。此法的主要優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，易于掌握，結(jié)果可靠，故已成為目前各實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)。亦可用“放射化學(xué)測(cè)定法”、“染料攝入測(cè)定法”。本次實(shí)驗(yàn)也主要采用前法。下面就此法的發(fā)展做一簡(jiǎn)要闡

23、述。1、全量細(xì)胞病變抑制測(cè)定法優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、易于掌握、結(jié)果可靠缺點(diǎn)：大量測(cè)定時(shí)，耗費(fèi)細(xì)胞量太大，清洗工作量大，判斷結(jié)果不能完全排出主觀因素。2、常規(guī)微量細(xì)胞病變抑制測(cè)定法此法是在“全量法”基礎(chǔ)上加以改良的一種方法，它的最大優(yōu)點(diǎn)是：需用細(xì)胞量少，適于大量干擾素標(biāo)本檢測(cè)。其主要缺點(diǎn)是：判斷結(jié)果不能完全排除主觀因素。具體操作形式有：先使細(xì)胞培養(yǎng)2448h形成單層后，再加入不同稀釋度的干擾素孵育24h，棄去，再加入100TCID50的攻擊病毒，繼續(xù)孵育直至病毒對(duì)照出現(xiàn)完全病變?yōu)橹埂Ｖ饕攸c(diǎn)是干擾素稀釋標(biāo)本和細(xì)胞同時(shí)加，優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞對(duì)攻擊病毒較敏感，且省時(shí)。兩種方法滴定的干擾素效價(jià)無(wú)明顯差別。3、微量快

24、速檢測(cè)法（一步快速法）本法的特點(diǎn)是干擾素（不同稀釋倍數(shù)）、細(xì)胞（一定濃度）和病毒（一定量）三者同時(shí)加入。因?yàn)楦蓴_素誘導(dǎo)細(xì)胞形成“抗病毒狀態(tài)”要先于病毒的復(fù)制與成熟，即VSV的復(fù)制周期為7h，而干擾素作用于靶細(xì)胞后約1h即形成抗病毒狀態(tài)。但一步快速法的敏感性隨病毒攻擊劑量的提高而迅速下降。因此常規(guī)微量法比微量快速法穩(wěn)定。四、材料準(zhǔn)備待測(cè)標(biāo)本：為了除去非干擾素抑制物，待測(cè)標(biāo)本應(yīng)作（1）離心處理；（2）pH處理（此步學(xué)生不需做）?？煞盅b為2040l /份/2人。測(cè)定細(xì)胞：應(yīng)根據(jù)“種屬特異性”選擇測(cè)定細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室選用生長(zhǎng)良好的一日齡或兩日齡人羊膜單層細(xì)胞傳代培養(yǎng)物(WISH)或人喉癌上皮細(xì)胞（Hep

25、-2），本次實(shí)驗(yàn)選取后者。攻擊病毒：選用具有“同步致病作用”的VSV(Vesicular Stomatitis Virus)作為“攻擊病毒”。使用前，應(yīng)先在原代雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物（約400萬(wàn)細(xì)胞/毫升）中傳代增殖及滴定病毒的空斑形成單位（PFU）或在人羊膜單層細(xì)胞上滴定其TCID50。病毒的攻擊量一般可選100300個(gè)TCID50（一般不得小于10個(gè)TCID50，不得大于500個(gè)TCID50）。胰蛋白酶混合消化液：VTP，其胰蛋白酶和Versene的最終濃度分別為0.05和0.02。用VTP比單用胰蛋白酶作消化液對(duì)細(xì)胞的損傷要小些。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：配方是（1）RPMI-1640液；（2）10%滅

26、活小牛血清；（3）雙抗。最后用NaHCO3調(diào)pH至7.27.4。微量細(xì)胞培養(yǎng)板：無(wú)菌40孔進(jìn)口板1塊/組。CO2培養(yǎng)裝置：采用CO2孵箱（CO2為5%，空氣為95%）。其他器材：5ml吸管2只/組，1ml吸管1只/組，tip頭1盒/桌。五、操作步驟1）稀釋待檢干擾素（在微量滴定板上直接進(jìn)行）（1）配制10小牛血清的營(yíng)養(yǎng)液5ml，除第一列外，在第一、二排的第210孔各加100l營(yíng)養(yǎng)液；（2）將待檢干擾素進(jìn)行400倍稀釋后，分別取100L于第一孔和第二孔，將第二孔充分吹吸3次混勻，吸出100l于第三孔，重復(fù)上述操作，直到第8孔，吹吸后棄去100l。因此依據(jù)倍倍稀釋原則對(duì)干擾素進(jìn)行系列稀釋，各孔的稀

27、釋倍數(shù)如下表所列。第九孔為細(xì)胞對(duì)照孔，不加干擾素保護(hù)也不加病毒攻擊；第十孔為病毒對(duì)照，不加干擾素保護(hù)加病毒攻擊。第二排按照同樣方法進(jìn)行，即每個(gè)稀釋度重復(fù)兩孔。每孔含量為100l。管號(hào)123456789（細(xì)胞對(duì)照孔）10（病毒對(duì)照）營(yíng)養(yǎng)液（L）100100100100100100100100100干擾素（L）100100上一孔的100上一孔的100上一孔的100上一孔的100上一孔的100上一孔的100，棄去100干擾素稀釋倍數(shù)1：4001：8001：16001：32001：64001：128001：256001：51200細(xì)胞每孔均為100l2）微量單層細(xì)胞培養(yǎng)（1）按常規(guī)方法將預(yù)先培養(yǎng)好的細(xì)

28、胞單層用VTP消化下來(lái)；（2）用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基將細(xì)胞制成40萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升的懸液；（3）用加樣器向微量細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中加入100L細(xì)胞懸液（加時(shí)不斷搖勻瓶中的細(xì)胞）；（4）置CO2孵箱中培養(yǎng)1d。3）病毒攻擊觀察到細(xì)胞單層良好時(shí)，將各孔內(nèi)含干擾的培養(yǎng)液倒掉，于每孔中加入100TCID50的攻擊病毒VSV100l，該病毒用3維持液稀釋，細(xì)胞對(duì)照組加入等量的維持液。本組加入24h引起75100%細(xì)胞病變的VSV100l。置37孵育2440h。4）觀察結(jié)果（1） 可直接倒置顯微鏡觀察。在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)首先觀察“細(xì)胞對(duì)照組”和“病毒對(duì)照組”，若病毒對(duì)照組各孔中的細(xì)胞出現(xiàn)75100的明顯病變和死亡，而細(xì)胞對(duì)照

29、組中的細(xì)胞仍完全生長(zhǎng)良好，則表明對(duì)照系統(tǒng)完全合格，即可作全面觀察。否則棄去重做。每孔中出現(xiàn)的細(xì)胞病變（CPE）程度，用表示。一般病毒對(duì)照孔，出現(xiàn)3或4，干擾素保護(hù)孔CPE不再進(jìn)展，則可終止反應(yīng)，并染色。（2） 結(jié)晶紫染色：將上述反應(yīng)板取出，棄去孔內(nèi)液體于消毒液中，每孔加入1滴染色液，35min后，棄去，洗凈孔內(nèi)殘余液體，控干即可記錄結(jié)果。細(xì)胞著色的深淺可以直觀反應(yīng)CPE出現(xiàn)的程度，一般時(shí)板孔內(nèi)幾乎無(wú)可見(jiàn)的細(xì)胞貼壁層，無(wú)CPE時(shí)則板孔內(nèi)細(xì)胞貼壁層完整。六、結(jié)果判斷與計(jì)算分析1、效價(jià)單位：效價(jià)以單位/毫升表示一般判定法：凡1ml干擾素標(biāo)本的最高稀釋度仍能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞（50）免受“攻擊病毒”損害者，

30、該稀釋度的倒數(shù)即為干擾素的單位/毫升。如某干擾素稀釋到1:8000時(shí)仍能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞（50）免受“攻擊病毒”的損害，即出現(xiàn)的稀釋度，則該干擾素的效價(jià)即為8000單位/毫升。特殊計(jì)算法（通常按照Reed-Muench法計(jì)算） 第一步 計(jì)算保護(hù)百分比，見(jiàn)下表A項(xiàng)B項(xiàng)C項(xiàng)D項(xiàng)E項(xiàng)F項(xiàng)G項(xiàng)干擾素稀釋度病變細(xì)胞正常細(xì)胞平均數(shù)累積比例百分比（）管1管2管1管2病變正常病變（）正常（）正常/(正常病變)1：400（22102）1：800（2 3 102 ）1：1600 （2 4 102 ）1：3200 （25 102 ）1：6400 （2 6 10 2 ）1：12800 （2 7 102 ）1：25600

31、（2 8 102 ）1：51200 （2 9 102 ）0012234400122344443221004432210000122344443221000013581216161285310016 /1612 /128 /95 /83 /81 /9001001008963381100A、B、C項(xiàng)為原始數(shù)據(jù)，4表示全部細(xì)胞病變；3表示75細(xì)胞病變；2表示50細(xì)胞病變；1表示25細(xì)胞病變。第二步 求出干擾素單位從上表中可大略看出，此批干擾素能保護(hù)半數(shù)（50）細(xì)胞不被“攻擊病毒”損害的最高稀釋度在1:32001:6400之間。因此，可通過(guò)下式求出其距離比。 高于50的百分比50 6350距離比 0.

32、52 高于50的百分比低于50的百分比 6338即此批干擾素稀釋到25.52 102（1:4588）時(shí)，能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受“攻擊病毒”損害，其結(jié)果可記為5.52Log2+2單位/毫升（5.52Log22 u. ml1）。2、工作單位修正各實(shí)驗(yàn)室所測(cè)得的干擾素單位，習(xí)慣上一般都稱為該實(shí)驗(yàn)室“工作單位”。為了表明某種干擾素效價(jià)的高低，就必須用同型國(guó)際干擾素參考制劑加以修正。例如，當(dāng)我們要修正本實(shí)驗(yàn)室所制備的獸用白細(xì)胞干擾素的效價(jià)時(shí)，就應(yīng)當(dāng)：（1）查明獸用白細(xì)胞干擾素參考制劑的標(biāo)準(zhǔn)單位(R1) （2）并在相同條件下測(cè)出獸用白細(xì)胞干擾素參考制劑的工作單位（R2）（3）測(cè)出本實(shí)驗(yàn)室所制獸用白細(xì)胞干擾素的

33、工作單位(X2)（4）按下式求出本室所制獸用白細(xì)胞干擾素的修正單位（X1）：R1:X1 = R2：X2例如設(shè)：R1=5000單位， R2=10000單位， X2= 8000單位；則按上式可求知：X1 = 4000單位。 實(shí)驗(yàn)七 濾泡性口炎病毒（VSV）中和試驗(yàn)（稀釋血清固定病毒法）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康臏y(cè)定血清中的VSV中和抗體效價(jià)二、實(shí)驗(yàn)原理特異的抗病毒免疫血清（中和抗體）和病毒作用后，使病毒失去感染的能力，一種病毒只能被相應(yīng)的免疫血清所中和，中和一定量的病毒的感染力必須有一定效價(jià)的中和抗體。根據(jù)稀釋成分不同可分為兩種方法。一為固定病毒用量（100TCID50）與等量一系列倍比稀釋的血清進(jìn)行中和試驗(yàn)，

34、以血清中和抗體滴度表示。二為固定血清用量與等量一系列對(duì)數(shù)稀釋的病毒進(jìn)行中和試驗(yàn)。結(jié)果以中和指數(shù)表示。三、實(shí)驗(yàn)材料VSV動(dòng)物免疫血清（S1、S2，1:10稀釋后56 30min滅活）、100TCID50VSV病毒懸液、稀釋液（無(wú)血清RPMI-1640）、營(yíng)養(yǎng)液（含10小牛血清的RPMI-1640）、40孔平底細(xì)胞板、Hep-2細(xì)胞一瓶、吸管、加樣器等。四、實(shí)驗(yàn)步驟1）40孔板每孔加稀釋液50l，作好標(biāo)記，按圖示進(jìn)行。每塊板做2個(gè)血清標(biāo)本（S1、S2）。S對(duì)照 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 C對(duì)照 V對(duì)照 S1S22）取1:10滅活血清，第1、2孔

35、分別加入50l；從第2孔吹吸3次，吸出50l至第3孔，吹吸3次，吸出50l至第4孔依次直至第8孔，吸出50l棄去。第9孔細(xì)胞（C）對(duì)照，第10孔病毒（V）對(duì)照均不加血清。3）加入預(yù)先制配好100TCID50 VSV病毒懸液，每50l/孔，C對(duì)照及S對(duì)照不加病毒。最后每孔總量100l，C對(duì)照及S對(duì)照補(bǔ)充稀釋液至100l/孔。4）置37 溫箱，孵育1h。5）利用此1小時(shí)制備Hep-2細(xì)胞懸液并加入上述混合液中。Hep-2一瓶，PBS洗滌2次 VTP 1ml消化 約5min后傾去 37至細(xì)胞從玻璃瓶脫落 加入1640營(yíng)養(yǎng)液6ml，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)成1106/ml，每孔加100l細(xì)胞懸液。37 5

36、CO2孵育，24h觀察結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 用倒置顯微鏡觀察。首先觀察對(duì)照：V對(duì)照（3+4+）；S對(duì)照（/）；C對(duì)照（）。以病變作為指標(biāo)，能抑制病毒CPE的血清最高稀釋度為中和抗體的效價(jià)（滴度）。實(shí)驗(yàn)八 細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性檢測(cè)（1） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握cck-8比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性的原理及方法（2） 實(shí)驗(yàn)原理 Mcck-8比色法檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性WST-8還原為黃色的甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞無(wú)此功能。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。（3） 實(shí)驗(yàn)材料Hep-2細(xì)胞，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5氟尿嘧啶（50mg/mL），溶劑

37、（pH8.9 PBS溶液），DMEM，小牛血清，VTP。（三）實(shí)驗(yàn)方法1.細(xì)胞鋪板將Hep-2消化下來(lái)，用營(yíng)養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整至 4104個(gè)/ml，每孔加入100l。第一行12個(gè)孔不加細(xì)胞只加100l營(yíng)養(yǎng)液作為空白調(diào)零孔（blank）。全班分成三大組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2. 待細(xì)胞貼壁后（第二天），按下圖加入藥物處理，每孔10l。并設(shè)置相應(yīng)對(duì)照組。1） 先取5個(gè)Ep管，分別標(biāo)記D、E、F、G、H，每管加入500l DMEM液，取500l原始濃度（管蓋標(biāo)記C1，濃度為50mg/mL）的5氟尿嘧啶，加入到D管，混勻后取500l加入到E管，依次倍比稀釋至H管。最終，C-G管每管體積500l，H管1ml。2） A1-A4（空白對(duì)照），C1-C4每孔加入10