細胞培養(yǎng)技術(shù)修改版

1、實驗一 實驗準備工作一、器材與藥品（每實驗室準備量）（一）普通器材名 稱數(shù) 量備 注普通天平1臺大酒精瓶3只量筒1000ml、250ml各一只500ml鹽水瓶1只玻璃棒2支火柴，標簽紙，記號筆等（二）無菌器材名 稱數(shù) 量備 注100ml或250ml鹽水瓶70只大翻70個10ml吸管3支5ml吸管5支1ml吸管1支青霉素瓶120只青霉素瓶塞120個（三）藥品名 稱數(shù) 量備 注重鉻酸鉀2400g濃H2SO44000ml雙蒸水5000ml由技術(shù)室提前準備青霉素10000單位/ml鏈霉素10 000g/mlNaHCO3， KCl ，NaCl，Na2HPO412H2O， KH2PO4，結(jié)晶紫，甲醛，無水

2、酒精等二、實驗內(nèi)容（一）配清潔液成 分量備 注重鉻酸鉀2400g重鉻酸鉀溶于水中有時不能完全溶解，預(yù)先用2000ml熱水助其溶解，再加入足量自來水，最后緩慢加濃硫酸。濃硫酸4000ml自來水20000ml切記：濃硫酸要緩慢加入，且邊加邊攪拌！（二）其他培養(yǎng)用液的配制及分工（學(xué)生分為三大組）1、RPMI-1640培養(yǎng)液 成分量備 注RPMI-16402袋攪拌溶解后過濾除菌，每瓶按100ml分裝，塞好大翻，并注明名稱配制日期和組別。每實驗室20瓶。每小組1瓶。NaHCO34.0 g2000ml大酒精瓶1只；無菌100ml鹽水瓶20只。2、無菌分裝5.6NaHCO3成分量備 注無菌5.6NaHCO3

3、50ml按照3ml/瓶分裝，每室16瓶，每小組1瓶。無菌操作。無菌青霉素瓶16只；無菌5ml吸管1支。 3、無菌分裝1胰酶（技術(shù)室提供） 成分量備 注無菌1胰酶20ml按照1ml/瓶分裝，每室16瓶，每小組1瓶。無菌操作。無菌青霉素瓶16只；無菌1ml吸管1支。4、Hanks液（母液由技術(shù)室提供）成分量備 注A液100按照1：1：18比例進行配比混勻，總量為2000ml，過濾除菌，然后按照每瓶500ml分裝，并注明名稱配制日期，每室4瓶。B液100雙蒸水1800無菌10ml吸管2支，1000ml量筒1只，1000ml大酒精瓶1只，無菌100ml鹽水瓶20只。5、雙抗成分量備 注青霉素（80萬U

4、）2瓶配制雙抗終濃度為： 16000單位/ml；鏈霉素10000g/ml。按5ml/瓶分裝，瓶口貼好膠布作好標記，膠布上注明配制日期和組別。每室16瓶。每小組1瓶。20保存?zhèn)溆?。鏈霉素?g) 1瓶無菌Hank s液100ml無菌5ml吸管1支，無菌青霉素瓶16只。6、血清的滅活和分裝成分量備 注無菌小牛血清150ml總量為150ml， 56的水浴鍋中進行熱滅活，滅活時間30min，后按照每瓶5ml分裝，并在瓶口處貼好膠布作好標記，膠布上寫好日期和組別。每實驗室30瓶。每小組2瓶。20保存?zhèn)溆?。無菌5ml吸管1支，無菌青霉素瓶30只。7、1PBS配制成分量備 注NaCl8.0 g總量為1000

5、ml，每瓶按70ml分裝，用硫酸紙包好瓶口，待高壓滅菌后第二天派人再換大翻保存。每實驗室15瓶。每小組1瓶。KCl0.2gNa2HPO412H2O2.9gKH2PO40.2g去離子水至1000ml標好1000ml刻度的酒精瓶或1000ml容量瓶1只，無菌100ml鹽水瓶15個。8、染色液成分量備 注結(jié)晶紫0.5g溶解、混勻，濾紙過濾甲醛10mlNaCl0.8g無水乙醇50ml去離子水加至100ml250ml量筒1只，500ml鹽水瓶1只。9、分裝VTP（由技術(shù)室提供）成分量備 注無菌VTP70ml無菌操作按4ml/瓶分裝，并注明日期和組別。每實驗室15瓶。無菌5ml吸管1支，無菌青霉素瓶15只

6、。未特別說明上述試劑均放置28冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ拷M完成后統(tǒng)一收好，下次再分配到各小組。備注：常規(guī)實驗室用品注意更換，包括酒精缸和酒精燈，棉球，一次性臺布等。實驗二 雞胚原代成纖維細胞的制備與培養(yǎng)一、實驗?zāi)康恼莆针u胚原代成纖維細胞的制備及培養(yǎng)的基本步驟；掌握活細胞的顯微鏡下觀察；熟悉病毒在細胞內(nèi)增殖的基本判斷方法。二、實驗原理離體動物組織通過溫和的手段（機械和酶消化）形成單個細胞后，在適宜的外界環(huán)境中，包括溫度、酸堿度和氣相環(huán)境，并給予充足合適的營養(yǎng)條件，能生存、生長形成單層細胞，這種原代培養(yǎng)的細胞具有原來體內(nèi)所具備的基本特性，比如肌肉細胞的收縮功能；上皮細胞的分泌功能等。通常把這種從體內(nèi)取出組織

7、細胞開始培養(yǎng)到第一次進行傳代之前的這一段時期稱為原(初)代培養(yǎng)。原代細胞最接近體內(nèi)細胞的特性，因而對外界環(huán)境的變化也最敏感，因此比較適合病毒的增殖，藥物的作用機制等的研究。 三、實驗材料（按2人/組的量發(fā)放）911日齡雞胚1只，碘酒和酒精棉球若干，無菌器械一套，無菌無毒平皿2只；5或10ml吸管4支，1或5ml吸管1支，長青霉素瓶2只（帶塞）；Hank s 液1瓶，RPMI-1640 1瓶，雙抗1瓶（5ml）；胰蛋白酶1瓶（1ml），血清1瓶（5ml），5.6NaHCO31瓶四、操作步驟1）碘酒和酒精棉球分別拭擦雞胚氣室外卵殼；2）取出兩只無菌平皿，并標記和，待用。3）在RPMI-1640和H

8、anks 液中分別無菌操作以1的量加入雙抗，吸出1015mlHanks 液至無菌平皿中備用； 4）大鑷子輕敲卵殼頂部然后小心去掉氣室外卵殼； 5）消毒鑷子后小心撕破卵膜，兩人互相配合取出雞胚置于盛有Hanks 液的平皿中，小心去頭、內(nèi)臟、爪和粘液及血球，洗滌后置于盛有Hanks 液的平皿中，再充分洗滌；6）取出洗凈的組織塊置于大青霉素瓶中，在火焰附近用無菌眼科剪刀將其剪成約0.51mm3的小塊（約250次），此時體積約0.5ml；用Hank s 液洗滌兩次。7）加入1 ml 1胰蛋白酶，用適量Hank s 液調(diào)整使其工作濃度為0.25，5.6NaHCO3調(diào)節(jié)pH至約7.38.0（肉眼觀為肉紅色

9、，1 ml吸管約23滴）蓋上瓶塞，寫好標記；8）將上述細胞瓶置于37水浴中，開始計時，約1530min，其間緩慢搖勻以充分消化。消化停止的標志是：輕輕晃動后細胞懸起，呈云霧狀，很快聚集成團，表明細胞活力好。9）消化結(jié)束后，取出，稍沉淀，緩慢吸出上清，用Hanks 液小心洗滌23次，可以盡量減少胰蛋白酶的殘留量，然后加入RPMI-1640液約5ml，用小頭吸管充分吹打，使細胞充分分散。吸上清；重復(fù)操作34次，收集細胞上清。10） 經(jīng)四層無菌紗布或200目不銹鋼鋼網(wǎng)過濾后收集濾液，細胞計數(shù)，并調(diào)節(jié)細胞密度大約1106/ml；或上述細胞懸液自然沉降，待未消化徹底的組織塊沉入瓶底后，收集上清，并加入足

10、量的小牛血清（終濃度為10）。11）將上述制備好的細胞懸液平均分配到兩個細胞瓶中，5ml/瓶，塞好螺口塞，注意生長面朝下，在非生長面上做好標記，包括細胞名稱，接種培養(yǎng)時間，組別及姓名等。12）細胞統(tǒng)一置于本室指定的37，5CO2孵箱中培養(yǎng)。13）24h后觀察細胞生長情況，如果細胞長成單層，細胞界限清晰，大多數(shù)細胞為梭形并貼壁，布滿細胞瓶的生長面，說明細胞生長狀態(tài)良好。實驗三 濾泡性口炎病毒（VSV）的增殖（純培養(yǎng)）一、實驗?zāi)康恼莆詹《驹诩毎麅?nèi)增殖的基本判斷方法。二、實驗原理原代細胞最接近體內(nèi)細胞的特性，因而對外界環(huán)境的變化也最敏感，因此比較適合病毒的增殖，藥物的作用機制等研究。 病毒在細胞內(nèi)增

11、殖的檢測指標有細胞變化、紅細胞吸附、細胞代謝改變、干擾現(xiàn)象、免疫熒光法檢測等。由病毒引起的細胞病變稱細胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），常見的細胞形態(tài)學(xué)變化為細胞變圓、聚集、融合、裂解或脫落等。三、實驗材料（按2人/組的量發(fā)放）200TCID50的VSV病毒0.1ml，5ml和1ml吸管各一支，維持液（含3小牛血清的RPMI-1640液）。四、操作步驟1）上述原代成纖維細胞培養(yǎng)24h后，一旦細胞完全貼壁生長良好后，則輕棄培養(yǎng)上清，換上細胞維持液（含3小牛血清的RPMI-1640），接種200TCID50的VSV0.1ml，在細胞瓶上標記換液時間，接種病毒量。正常對照也按

12、照上述方法換上維持液。2）再繼續(xù)培養(yǎng)，每間隔1224h觀察，直至全部細胞出現(xiàn)明顯的病變，顯微鏡觀察細胞脫落，圓縮，則可停止培養(yǎng)。3）收集全班的病毒培養(yǎng)物于100ml無菌鹽水瓶中，寫好標記，置于20冰箱充分冷凍后再置于4冰箱或室溫下解凍，該過程稱為凍融。反復(fù)凍融三次后，細胞膜破壞，釋放出胞內(nèi)病毒。低速離心，棄細胞碎片沉渣，收集上清即為病毒懸液。留樣測定病毒的TCID50。五、實驗結(jié)果1、雞胚原代成纖維細胞的顯微鏡下觀察。2、VSV攻擊雞胚原代成纖維細胞后，細胞病變效應(yīng)（CPE）的觀察。3、病毒收獲的方法。實驗四 Hep-2細胞的傳代培養(yǎng)一、實驗?zāi)康恼莆占毎麄鞔囵B(yǎng)的方法及其應(yīng)用。二、實驗原理體外

13、培養(yǎng)的細胞由于細胞游出數(shù)量增加，單層培養(yǎng)細胞相互匯合，整個瓶底逐漸被細胞覆蓋。這時需要進行分離培養(yǎng)，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細胞繼續(xù)生長。細胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程稱之為傳代；進行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代。細胞培養(yǎng)傳代根據(jù)不同細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。三、實驗材料傳代細胞：人喉癌細胞（Hep-2）（每兩人一瓶）；所需溶液：PBS 、VTP、RPMI-1640液、血清；其他：5 ml吸管、10ml吸管、細

14、胞瓶。四、操作步驟1）將已長成單層的細胞生長面朝上輕輕倒掉培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗滌兩次，注意吸管尖頭不要伸到細胞瓶中。2）用上述吸管吸取1mlVTP加入細胞瓶中，鋪滿整個細胞生長面即可；室溫或手握住消化，約35min。顯微鏡下觀察細胞胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后，即可停止消化。盡可能棄盡消化液，繼續(xù)利用殘余的消化液消化，直至細胞大部分易在外力作用下從細胞瓶表面脫落下來為止。3）加入少量RPMI-1640液于細胞瓶中，用小頭吸管吹打瓶壁細胞以及脫落細胞使細胞充分均勻，吹打時動作要輕柔不要用力過猛，盡可能不要出現(xiàn)泡沫。4）計數(shù)：用吸管吹打細胞懸液，取少許細胞懸液與等量0.04臺盼蘭混勻，在計數(shù)板上蓋玻

15、片的一側(cè)加該細胞懸液，加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡。計算細胞濃度。5）用RPMI-1640制備成1106/ml濃度的細胞懸液，并按10的量加入小牛血清。6）將上述細胞懸液分裝5ml到新細胞瓶中，塞好塞子，標記后送培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后觀察。五、實驗結(jié)果顯微鏡下觀察Hep-2細胞生長良好，已長滿單層，細胞呈不規(guī)則多邊形，透光性良好。實驗五 VSV TCID50滴定一、實驗?zāi)康恼莆詹《綯CID50滴定的基本原理和計算方法以及應(yīng)用。二、實驗原理多數(shù)病毒感染體外培養(yǎng)的細胞后，常引起細胞形態(tài)學(xué)改變，如細胞團縮、裂解和細胞腫大等，這種改變稱為病毒致病變效應(yīng)（cytopathic effect，C

16、PE），可以直接通過顯微鏡觀察，亦可通過染色得以識別和判斷。CPE的程度可間接反映病毒的毒力，因此利用這種特征可以用來測定病毒的毒力。即能在半數(shù)細胞培養(yǎng)板孔或試管內(nèi)引起細胞發(fā)生病變所需的病毒量定義為病毒的50組織細胞感染指數(shù)（50 tissue culture infectious dose，TCID50）。測定時，首先在微量細胞板上培養(yǎng)敏感細胞，待細胞貼壁形成單層，棄上清。將待測病毒用維持液做10倍稀釋后加入細胞單層，逐日觀察，直至病毒產(chǎn)生的CPE不再進展為止。具體時間根據(jù)病毒的增殖特點而定，如腸道病毒增殖迅速，一般48h即可；VSV增殖也較快，因此，48h72h也可以觀察、染色、計算。三、

17、實驗材料細胞：Hep-2細胞株（實驗四傳代所得），自備/組。病毒：水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV），自備/組。試劑：維持液，PBS，VTP等自備/組。材料：細胞板（1塊/組），tip頭（2盒/排），微量移液器，5ml或10ml吸管（2支/組），青霉素瓶帶塞（10個/排），酒精缸，鑷子（2個/排）四、操作步驟1）制備細胞：方法同實驗四。一瓶細胞消化后加入營養(yǎng)液制成所需細胞懸液，濃度約為1106/ml。用微量移液器將細胞懸液加入40孔板微孔中，每孔100l，37，5%CO2孵育箱培養(yǎng)24h，形成單層后，做病毒滴定用。2）50%組織細胞感染量（TCID5

18、0）測定（1）稀釋病毒液：取無菌青霉素瓶9支，各管分別加3%小牛血清的維持液2.7ml，然后向第一管加VSV病毒液0.3ml，反復(fù)吹吸混合三次，從第一管內(nèi)吸液0.3ml加入第二管內(nèi)，反復(fù)混合三次，從第二管內(nèi)吸液0.3ml加入第三管內(nèi)，反復(fù)混合三次，依此類推將待測的病毒液做連續(xù)10倍稀釋，使病毒稀釋為10-1，10-2，10-310-9。（2）病毒接種：將長好單層細胞的培養(yǎng)板各孔細胞液全部傾棄，用微量移液器把各稀釋度的VSV病毒從低濃度開始依次加入各微孔中，每稀釋度平行加2孔，每孔100l。細胞對照孔不加病毒液，只加維持液。置37，5%CO2孵育箱中孵育。（3）結(jié)果觀察：于孵育后18、24、36

19、、48、72h在倒置顯微鏡下觀察CPE，病毒可引起細胞圓縮、堆聚及脫落現(xiàn)象。“-”表示細胞正常；“+”25%細胞產(chǎn)生病變、圓縮、破碎脫落；“2+”50%細胞產(chǎn)生病變；“3+”75%細胞產(chǎn)生病變；“4+”100%細胞產(chǎn)生病變。（實驗時，觀察24h48h即可染色計算）3）計算TCID50參見下表表 VSV在Hep-2細胞上的TCID50結(jié)果記錄病毒稀釋度病變孔數(shù)/接種孔數(shù)累積數(shù)（孔）病變細胞孔有病變無病變比例百分比（%）10-38/810010/1010010-42/8262/82510-50/80140/14010-60/80220/22010-70/80300/30010-80/80380/3

20、80按表中，10-3稀釋的病變高于50%；10-4稀釋的病變低于50%；50%病變分布于10-3與10-4之間，計算公式如下： 高于50%病變率- （50%） 100-50 距離比例= lg稀釋倍數(shù) =- lg10 高于50%的病變率-低于50%的病變率 100-25 =-0.67lg TCID50=高于50%病變的低稀釋度對數(shù)+距離比=-3+(-0.67)= -3.67即1個TCID50=10-3.67，查0.67的反對數(shù)為4.68，即病毒做4.68103倍稀釋時取0.1ml接種細胞，即可使50%細胞產(chǎn)生病變。附錄：如何計算200個TCID50？4.38103200=23.4，將病毒作23.

21、4倍稀釋時即得200個TCID50。五、計算請計算提供的病毒的TCID50。六、寫實驗報告并計算給定的病毒的TCID50。實驗六 干擾素活性（效價）的測定 （注：此實驗所需的細胞為實驗四時傳代培養(yǎng)所得）一、實驗?zāi)康恼莆瘴⒘考毎∽円种品y定干擾素效價的基本步驟以及結(jié)果分析。熟悉常用生物制品生物學(xué)活性測定的實際意義。了解影響結(jié)果的常見因素。二、基本原理病毒或其他干擾素誘生劑作用于巨噬細胞、T細胞或成纖維細胞后，由細胞基因自身編碼產(chǎn)生的具有抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能的一類小分子糖肽，統(tǒng)稱為干擾素。干擾素發(fā)揮重要的酶的特性而抑制病毒DNA和蛋白質(zhì)的合成，從而抑制病毒在細胞內(nèi)的增殖。因此具有間接的廣

22、譜抗病毒作用。為了進一步確定人工方法制備的干擾素的生物學(xué)活性，需進行體外抗病毒試驗測定，即干擾素效價的測定。干擾素效價一般定義為：凡1ml干擾素標本的最高稀釋度仍能保護半數(shù)細胞（50）免受“攻擊病毒”損害者，該稀釋度的倒數(shù)即為干擾素的效價，即單位/毫升。三、測定方法測定干擾素效價的方法有多種，最常用的是“細胞病變抑制法”（Method of Cytopathic effect inhibition assay，簡稱CPE法）。此法的主要優(yōu)點是操作簡便，易于掌握，結(jié)果可靠，故已成為目前各實驗室的常規(guī)。亦可用“放射化學(xué)測定法”、“染料攝入測定法”。本次實驗也主要采用前法。下面就此法的發(fā)展做一簡要闡

23、述。1、全量細胞病變抑制測定法優(yōu)點：操作簡單、易于掌握、結(jié)果可靠缺點：大量測定時，耗費細胞量太大，清洗工作量大，判斷結(jié)果不能完全排出主觀因素。2、常規(guī)微量細胞病變抑制測定法此法是在“全量法”基礎(chǔ)上加以改良的一種方法，它的最大優(yōu)點是：需用細胞量少，適于大量干擾素標本檢測。其主要缺點是：判斷結(jié)果不能完全排除主觀因素。具體操作形式有：先使細胞培養(yǎng)2448h形成單層后，再加入不同稀釋度的干擾素孵育24h，棄去，再加入100TCID50的攻擊病毒，繼續(xù)孵育直至病毒對照出現(xiàn)完全病變?yōu)橹埂Ｖ饕攸c是干擾素稀釋標本和細胞同時加，優(yōu)點是細胞對攻擊病毒較敏感，且省時。兩種方法滴定的干擾素效價無明顯差別。3、微量快

24、速檢測法（一步快速法）本法的特點是干擾素（不同稀釋倍數(shù)）、細胞（一定濃度）和病毒（一定量）三者同時加入。因為干擾素誘導(dǎo)細胞形成“抗病毒狀態(tài)”要先于病毒的復(fù)制與成熟，即VSV的復(fù)制周期為7h，而干擾素作用于靶細胞后約1h即形成抗病毒狀態(tài)。但一步快速法的敏感性隨病毒攻擊劑量的提高而迅速下降。因此常規(guī)微量法比微量快速法穩(wěn)定。四、材料準備待測標本：為了除去非干擾素抑制物，待測標本應(yīng)作（1）離心處理；（2）pH處理（此步學(xué)生不需做）?？煞盅b為2040l /份/2人。測定細胞：應(yīng)根據(jù)“種屬特異性”選擇測定細胞。本實驗室選用生長良好的一日齡或兩日齡人羊膜單層細胞傳代培養(yǎng)物(WISH)或人喉癌上皮細胞（Hep

25、-2），本次實驗選取后者。攻擊病毒：選用具有“同步致病作用”的VSV(Vesicular Stomatitis Virus)作為“攻擊病毒”。使用前，應(yīng)先在原代雞胚成纖維細胞培養(yǎng)物（約400萬細胞/毫升）中傳代增殖及滴定病毒的空斑形成單位（PFU）或在人羊膜單層細胞上滴定其TCID50。病毒的攻擊量一般可選100300個TCID50（一般不得小于10個TCID50，不得大于500個TCID50）。胰蛋白酶混合消化液：VTP，其胰蛋白酶和Versene的最終濃度分別為0.05和0.02。用VTP比單用胰蛋白酶作消化液對細胞的損傷要小些。營養(yǎng)培養(yǎng)基：配方是（1）RPMI-1640液；（2）10%滅

26、活小牛血清；（3）雙抗。最后用NaHCO3調(diào)pH至7.27.4。微量細胞培養(yǎng)板：無菌40孔進口板1塊/組。CO2培養(yǎng)裝置：采用CO2孵箱（CO2為5%，空氣為95%）。其他器材：5ml吸管2只/組，1ml吸管1只/組，tip頭1盒/桌。五、操作步驟1）稀釋待檢干擾素（在微量滴定板上直接進行）（1）配制10小牛血清的營養(yǎng)液5ml，除第一列外，在第一、二排的第210孔各加100l營養(yǎng)液；（2）將待檢干擾素進行400倍稀釋后，分別取100L于第一孔和第二孔，將第二孔充分吹吸3次混勻，吸出100l于第三孔，重復(fù)上述操作，直到第8孔，吹吸后棄去100l。因此依據(jù)倍倍稀釋原則對干擾素進行系列稀釋，各孔的稀

27、釋倍數(shù)如下表所列。第九孔為細胞對照孔，不加干擾素保護也不加病毒攻擊；第十孔為病毒對照，不加干擾素保護加病毒攻擊。第二排按照同樣方法進行，即每個稀釋度重復(fù)兩孔。每孔含量為100l。管號123456789（細胞對照孔）10（病毒對照）營養(yǎng)液（L）100100100100100100100100100干擾素（L）100100上一孔的100上一孔的100上一孔的100上一孔的100上一孔的100上一孔的100，棄去100干擾素稀釋倍數(shù)1：4001：8001：16001：32001：64001：128001：256001：51200細胞每孔均為100l2）微量單層細胞培養(yǎng)（1）按常規(guī)方法將預(yù)先培養(yǎng)好的細

28、胞單層用VTP消化下來；（2）用營養(yǎng)培養(yǎng)基將細胞制成40萬個細胞/毫升的懸液；（3）用加樣器向微量細胞培養(yǎng)板每孔中加入100L細胞懸液（加時不斷搖勻瓶中的細胞）；（4）置CO2孵箱中培養(yǎng)1d。3）病毒攻擊觀察到細胞單層良好時，將各孔內(nèi)含干擾的培養(yǎng)液倒掉，于每孔中加入100TCID50的攻擊病毒VSV100l，該病毒用3維持液稀釋，細胞對照組加入等量的維持液。本組加入24h引起75100%細胞病變的VSV100l。置37孵育2440h。4）觀察結(jié)果（1） 可直接倒置顯微鏡觀察。在規(guī)定的時間內(nèi)首先觀察“細胞對照組”和“病毒對照組”，若病毒對照組各孔中的細胞出現(xiàn)75100的明顯病變和死亡，而細胞對照

29、組中的細胞仍完全生長良好，則表明對照系統(tǒng)完全合格，即可作全面觀察。否則棄去重做。每孔中出現(xiàn)的細胞病變（CPE）程度，用表示。一般病毒對照孔，出現(xiàn)3或4，干擾素保護孔CPE不再進展，則可終止反應(yīng)，并染色。（2） 結(jié)晶紫染色：將上述反應(yīng)板取出，棄去孔內(nèi)液體于消毒液中，每孔加入1滴染色液，35min后，棄去，洗凈孔內(nèi)殘余液體，控干即可記錄結(jié)果。細胞著色的深淺可以直觀反應(yīng)CPE出現(xiàn)的程度，一般時板孔內(nèi)幾乎無可見的細胞貼壁層，無CPE時則板孔內(nèi)細胞貼壁層完整。六、結(jié)果判斷與計算分析1、效價單位：效價以單位/毫升表示一般判定法：凡1ml干擾素標本的最高稀釋度仍能保護半數(shù)細胞（50）免受“攻擊病毒”損害者，

30、該稀釋度的倒數(shù)即為干擾素的單位/毫升。如某干擾素稀釋到1:8000時仍能保護半數(shù)細胞（50）免受“攻擊病毒”的損害，即出現(xiàn)的稀釋度，則該干擾素的效價即為8000單位/毫升。特殊計算法（通常按照Reed-Muench法計算） 第一步 計算保護百分比，見下表A項B項C項D項E項F項G項干擾素稀釋度病變細胞正常細胞平均數(shù)累積比例百分比（）管1管2管1管2病變正常病變（）正常（）正常/(正常病變)1：400（22102）1：800（2 3 102 ）1：1600 （2 4 102 ）1：3200 （25 102 ）1：6400 （2 6 10 2 ）1：12800 （2 7 102 ）1：25600

31、（2 8 102 ）1：51200 （2 9 102 ）0012234400122344443221004432210000122344443221000013581216161285310016 /1612 /128 /95 /83 /81 /9001001008963381100A、B、C項為原始數(shù)據(jù)，4表示全部細胞病變；3表示75細胞病變；2表示50細胞病變；1表示25細胞病變。第二步 求出干擾素單位從上表中可大略看出，此批干擾素能保護半數(shù)（50）細胞不被“攻擊病毒”損害的最高稀釋度在1:32001:6400之間。因此，可通過下式求出其距離比。 高于50的百分比50 6350距離比 0.

32、52 高于50的百分比低于50的百分比 6338即此批干擾素稀釋到25.52 102（1:4588）時，能保護半數(shù)細胞免受“攻擊病毒”損害，其結(jié)果可記為5.52Log2+2單位/毫升（5.52Log22 u. ml1）。2、工作單位修正各實驗室所測得的干擾素單位，習(xí)慣上一般都稱為該實驗室“工作單位”。為了表明某種干擾素效價的高低，就必須用同型國際干擾素參考制劑加以修正。例如，當我們要修正本實驗室所制備的獸用白細胞干擾素的效價時，就應(yīng)當：（1）查明獸用白細胞干擾素參考制劑的標準單位(R1) （2）并在相同條件下測出獸用白細胞干擾素參考制劑的工作單位（R2）（3）測出本實驗室所制獸用白細胞干擾素的

33、工作單位(X2)（4）按下式求出本室所制獸用白細胞干擾素的修正單位（X1）：R1:X1 = R2：X2例如設(shè)：R1=5000單位， R2=10000單位， X2= 8000單位；則按上式可求知：X1 = 4000單位。 實驗七 濾泡性口炎病毒（VSV）中和試驗（稀釋血清固定病毒法）一、實驗?zāi)康臏y定血清中的VSV中和抗體效價二、實驗原理特異的抗病毒免疫血清（中和抗體）和病毒作用后，使病毒失去感染的能力，一種病毒只能被相應(yīng)的免疫血清所中和，中和一定量的病毒的感染力必須有一定效價的中和抗體。根據(jù)稀釋成分不同可分為兩種方法。一為固定病毒用量（100TCID50）與等量一系列倍比稀釋的血清進行中和試驗，

34、以血清中和抗體滴度表示。二為固定血清用量與等量一系列對數(shù)稀釋的病毒進行中和試驗。結(jié)果以中和指數(shù)表示。三、實驗材料VSV動物免疫血清（S1、S2，1:10稀釋后56 30min滅活）、100TCID50VSV病毒懸液、稀釋液（無血清RPMI-1640）、營養(yǎng)液（含10小牛血清的RPMI-1640）、40孔平底細胞板、Hep-2細胞一瓶、吸管、加樣器等。四、實驗步驟1）40孔板每孔加稀釋液50l，作好標記，按圖示進行。每塊板做2個血清標本（S1、S2）。S對照 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 C對照 V對照 S1S22）取1:10滅活血清，第1、2孔

35、分別加入50l；從第2孔吹吸3次，吸出50l至第3孔，吹吸3次，吸出50l至第4孔依次直至第8孔，吸出50l棄去。第9孔細胞（C）對照，第10孔病毒（V）對照均不加血清。3）加入預(yù)先制配好100TCID50 VSV病毒懸液，每50l/孔，C對照及S對照不加病毒。最后每孔總量100l，C對照及S對照補充稀釋液至100l/孔。4）置37 溫箱，孵育1h。5）利用此1小時制備Hep-2細胞懸液并加入上述混合液中。Hep-2一瓶，PBS洗滌2次 VTP 1ml消化 約5min后傾去 37至細胞從玻璃瓶脫落 加入1640營養(yǎng)液6ml，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)成1106/ml，每孔加100l細胞懸液。37 5

36、CO2孵育，24h觀察結(jié)果。五、實驗結(jié)果 用倒置顯微鏡觀察。首先觀察對照：V對照（3+4+）；S對照（/）；C對照（）。以病變作為指標，能抑制病毒CPE的血清最高稀釋度為中和抗體的效價（滴度）。實驗八 細胞增殖與細胞毒性檢測（1） 實驗?zāi)康?掌握cck-8比色法檢測細胞增殖與細胞毒性的原理及方法（2） 實驗原理 Mcck-8比色法檢測細胞存活和生長原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性WST-8還原為黃色的甲瓚（Formazan），而死細胞無此功能。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。（3） 實驗材料Hep-2細胞，96孔細胞培養(yǎng)板，5氟尿嘧啶（50mg/mL），溶劑

37、（pH8.9 PBS溶液），DMEM，小牛血清，VTP。（三）實驗方法1.細胞鋪板將Hep-2消化下來，用營養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)整至 4104個/ml，每孔加入100l。第一行12個孔不加細胞只加100l營養(yǎng)液作為空白調(diào)零孔（blank）。全班分成三大組進行實驗。2. 待細胞貼壁后（第二天），按下圖加入藥物處理，每孔10l。并設(shè)置相應(yīng)對照組。1） 先取5個Ep管，分別標記D、E、F、G、H，每管加入500l DMEM液，取500l原始濃度（管蓋標記C1，濃度為50mg/mL）的5氟尿嘧啶，加入到D管，混勻后取500l加入到E管，依次倍比稀釋至H管。最終，C-G管每管體積500l，H管1ml。2） A1-A4（空白對照），C1-C4每孔加入10