生物大分子的電子顯微鏡技術(shù)

1、n核酸的分類核酸的分類： n核小體核小體DNA 與蛋白質(zhì)聚合一起構(gòu)成的染 色體的單位 DNA 雙鏈dsDNA、線性的， 超螺旋 的， 單鏈 ssDNA RNA 單鏈 ssRNA 、線性的，三葉草形 的 雙鏈dsRNA 核酸分子電鏡觀察的要求核酸分子電鏡觀察的要求: : n核酸分子需要打開超螺旋成為二維伸展的長鏈核酸分子需要打開超螺旋成為二維伸展的長鏈; ; n核酸分子太細(xì)需要加粗；核酸分子太細(xì)需要加粗； n提高電子反差。提高電子反差。 分子長度測量及計(jì)算分子長度測量及計(jì)算 n對已知的標(biāo)準(zhǔn)分子進(jìn)行觀察和計(jì)算，完整的分子對已知的標(biāo)準(zhǔn)分子進(jìn)行觀察和計(jì)算，完整的分子 的長度應(yīng)相對一致。的長度應(yīng)相對一致

2、。 n觀察觀察100100個以上的分子，拍像記錄；個以上的分子，拍像記錄； n矯正電鏡放大倍數(shù)；矯正電鏡放大倍數(shù)； n測量分子，測量分子，5020050200份單分子；份單分子； n統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算平均值，作出長度分布圖；統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算平均值，作出長度分布圖； n用已知的標(biāo)準(zhǔn)分子進(jìn)行對照測算用已知的標(biāo)準(zhǔn)分子進(jìn)行對照測算 n經(jīng)驗(yàn)公式：經(jīng)驗(yàn)公式：ds 1um=2.07X10ds 1um=2.07X106 6DaDa s s 1um=1.20X10 s s 1um=1.20X106 6DaDa 特點(diǎn)和應(yīng)用 n樣品量少；操作簡便；制備樣品時(shí)間短。樣品量少；操作簡便；制備樣品時(shí)間短。 n適合觀察核酸分子的

3、形狀和長度、雙鏈或單鏈適合觀察核酸分子的形狀和長度、雙鏈或單鏈 的區(qū)分、根據(jù)長度計(jì)算核酸的分子量；的區(qū)分、根據(jù)長度計(jì)算核酸的分子量； n進(jìn)行異源雙鏈分子分析、分子雜交、轉(zhuǎn)錄復(fù)合進(jìn)行異源雙鏈分子分析、分子雜交、轉(zhuǎn)錄復(fù)合 體、核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體等研究；體、核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體等研究； n基因組織結(jié)構(gòu)、基因片段的缺失、斷裂基因、基因組織結(jié)構(gòu)、基因片段的缺失、斷裂基因、 插入或倒置、基因定位及堿基組成特征等方面插入或倒置、基因定位及堿基組成特征等方面 的研究。的研究。 蛋白質(zhì)單分子展層操作 n對核酸樣品和試劑的要求：對核酸樣品和試劑的要求： 1.核酸樣品純度高，去除其他混雜的核酸和蛋白質(zhì)成份；核酸樣品純度高

4、，去除其他混雜的核酸和蛋白質(zhì)成份； 2.核酸樣品為新鮮制備核酸樣品為新鮮制備,并盡量保持其長鏈的完整性并盡量保持其長鏈的完整性; 3.樣品濃度在樣品濃度在5ugml以上以上; 4.樣品溶液中無表面活性劑及變性劑等其他污染樣品溶液中無表面活性劑及變性劑等其他污染; 5.溶液的溶液的PH在在610之間之間; 6.展層的堿性蛋白常選擇細(xì)胞色素展層的堿性蛋白常選擇細(xì)胞色素C,電泳純電泳純; 7.所用試劑為分析純所用試劑為分析純,器具潔凈器具潔凈,無去污劑等殘留無去污劑等殘留; 8.制備制備RNA樣品的試劑與器具須高溫烘烤樣品的試劑與器具須高溫烘烤,使使RNA酶失活酶失活. 染色與投影 n染色染色-增加

5、核酸分子的電子密度增加核酸分子的電子密度 樣品展層后樣品展層后, ,粘取至銅網(wǎng)上粘取至銅網(wǎng)上, ,經(jīng)過染色和金屬投經(jīng)過染色和金屬投 影以增強(qiáng)反差影以增強(qiáng)反差. . 染色液為染色液為12%12%的的PTA, (PTA, (用用90%90% 乙醇配制乙醇配制,100ml,100ml染液中含染液中含1ml1ml的濃硫酸的濃硫酸) )或醋酸或醋酸 雙氧鈾雙氧鈾, ,染色染色10301030秒后秒后. .自然晾干自然晾干. . n投影投影-使核酸細(xì)分子的直徑加粗使核酸細(xì)分子的直徑加粗 染色后的樣品以投影角度染色后的樣品以投影角度5959, ,用鉑用鉑 鈀合金進(jìn)鈀合金進(jìn) 行旋轉(zhuǎn)投影行旋轉(zhuǎn)投影, ,或再加噴

6、一薄層碳膜或再加噴一薄層碳膜, ,以增加強(qiáng)度以增加強(qiáng)度. . 染色與投影 n染色染色-增加核酸分子的電子密度增加核酸分子的電子密度 樣品展層后樣品展層后, ,粘取至銅網(wǎng)上粘取至銅網(wǎng)上, ,經(jīng)過染色和金屬投經(jīng)過染色和金屬投 影以增強(qiáng)反差影以增強(qiáng)反差. . 染色液為染色液為12%12%的的PTA, (PTA, (用用90%90% 乙醇配制乙醇配制,100ml,100ml染液中含染液中含1ml1ml的濃硫酸的濃硫酸) )或醋酸或醋酸 雙氧鈾雙氧鈾, ,染色染色10301030秒后秒后. .自然晾干自然晾干. . n投影投影-使核酸細(xì)分子的直徑加粗使核酸細(xì)分子的直徑加粗 染色后的樣品以投影角度染色后的

7、樣品以投影角度5959, ,用鉑用鉑 鈀合金進(jìn)鈀合金進(jìn) 行旋轉(zhuǎn)投影行旋轉(zhuǎn)投影, ,或再加噴一薄層碳膜或再加噴一薄層碳膜, ,以增加強(qiáng)度以增加強(qiáng)度. . 電鏡觀察要求 n染色，投影后，核酸分子的直徑從染色，投影后，核酸分子的直徑從20A增至增至 80100A，故在，故在10萬倍以下可以觀察到；萬倍以下可以觀察到； 蛋白質(zhì)單分子膜展層技術(shù)的原理蛋白質(zhì)單分子膜展層技術(shù)的原理 n某些堿性蛋白質(zhì)在低鹽溶液或水的表面形成不溶性變某些堿性蛋白質(zhì)在低鹽溶液或水的表面形成不溶性變 性薄膜，單濃度和加到溶液表面的量合適，該膜就展性薄膜，單濃度和加到溶液表面的量合適，該膜就展 開成為單分子層，也就是一個多肽鏈構(gòu)成的

8、分子網(wǎng)。開成為單分子層，也就是一個多肽鏈構(gòu)成的分子網(wǎng)。 如果將核酸樣品混合在溶液中，堿性蛋白上的氨基酸如果將核酸樣品混合在溶液中，堿性蛋白上的氨基酸 堿性基團(tuán)便與核酸分子鏈上的酸性基團(tuán)以水合鍵結(jié)合，堿性基團(tuán)便與核酸分子鏈上的酸性基團(tuán)以水合鍵結(jié)合， 核酸分子相對穩(wěn)定地固著在蛋白質(zhì)分子上。展層時(shí)，核酸分子相對穩(wěn)定地固著在蛋白質(zhì)分子上。展層時(shí)， 核酸分子隨著蛋白質(zhì)在溶液表面的展開而被拉開伸展核酸分子隨著蛋白質(zhì)在溶液表面的展開而被拉開伸展 為彎曲的二維結(jié)構(gòu)。由于蛋白質(zhì)單分子膜作基礎(chǔ)，使為彎曲的二維結(jié)構(gòu)。由于蛋白質(zhì)單分子膜作基礎(chǔ)，使 核酸分子保持完整性，經(jīng)撈網(wǎng)，染色，金屬投影，電核酸分子保持完整性，經(jīng)撈

9、網(wǎng)，染色，金屬投影，電 鏡觀察。鏡觀察。 特點(diǎn)和應(yīng)用 n樣品量少；操作簡便；制備樣品時(shí)間短。樣品量少；操作簡便；制備樣品時(shí)間短。 n適合觀察核酸分子的形狀和長度、雙鏈或單鏈適合觀察核酸分子的形狀和長度、雙鏈或單鏈 的區(qū)分、根據(jù)長度計(jì)算核酸的分子量；的區(qū)分、根據(jù)長度計(jì)算核酸的分子量； n進(jìn)行異源雙鏈分子分析、分子雜交、轉(zhuǎn)錄復(fù)合進(jìn)行異源雙鏈分子分析、分子雜交、轉(zhuǎn)錄復(fù)合 體、核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體等研究；體、核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體等研究； n基因組織結(jié)構(gòu)、基因片段的缺失、斷裂基因、基因組織結(jié)構(gòu)、基因片段的缺失、斷裂基因、 插入或倒置、基因定位及堿基組成特征等方面插入或倒置、基因定位及堿基組成特征等方面 的研究。

10、的研究。 蛋白質(zhì)單分子展層操作 n對核酸樣品和試劑的要求：對核酸樣品和試劑的要求： 1.核酸樣品純度高，去除其他混雜的核酸和蛋白質(zhì)成份；核酸樣品純度高，去除其他混雜的核酸和蛋白質(zhì)成份； 2.核酸樣品為新鮮制備核酸樣品為新鮮制備,并盡量保持其長鏈的完整性并盡量保持其長鏈的完整性; 3.樣品濃度在樣品濃度在5ugml以上以上; 4.樣品溶液中無表面活性劑及變性劑等其他污染樣品溶液中無表面活性劑及變性劑等其他污染; 5.溶液的溶液的PH在在610之間之間; 6.展層的堿性蛋白常選擇細(xì)胞色素展層的堿性蛋白常選擇細(xì)胞色素C,電泳純電泳純; 7.所用試劑為分析純所用試劑為分析純,器具潔凈器具潔凈,無去污劑

11、等殘留無去污劑等殘留; 8.制備制備RNA樣品的試劑與器具須高溫烘烤樣品的試劑與器具須高溫烘烤,使使RNA酶失活酶失活. 樣品配制樣品配制 n醋酸銨法醋酸銨法: 上相液組成上相液組成:醋酸銨醋酸銨 (終濃度終濃度)0.52Mol(PH7.5) 核酸樣品核酸樣品 0.51ugml 總體積總體積50ul 細(xì)胞色素細(xì)胞色素C 0.050.1mgml 下相液下相液:0.050.25M醋酸銨水溶液或雙蒸水醋酸銨水溶液或雙蒸水 甲酰銨法甲酰銨法: 上相液組成上相液組成:Tris-Na3EDTA(PH8.5) 0.10.01M 核酸樣品核酸樣品 0.51ugml 細(xì)胞色素細(xì)胞色素C 0.050.1mgml

12、甲酰銨甲酰銨 4050% 下相液下相液:0.1MTris0.01MNa3EDTA(PH8.5),20%甲酰銨甲酰銨. 展層方法及步驟 展層展層 1.樣品溶液樣品溶液(上相溶上相溶 液液) 2.展層液展層液(下相溶液下相溶液) 3.滑石粉滑石粉 4.載玻片載玻片 5.加樣器加樣器 1 2 3 4 5. 沾網(wǎng)沾網(wǎng): 將銅網(wǎng)的膜面朝下將銅網(wǎng)的膜面朝下, 沾取液面上的樣品沾取液面上的樣品 脫水與染色脫水與染色 銅網(wǎng)以銅網(wǎng)以45角插入角插入 無水乙醇片刻無水乙醇片刻,進(jìn)行進(jìn)行 脫水脫水,以同樣方法在以同樣方法在 2%PTA中染色中染色 金屬投影金屬投影: 在真空噴鍍儀中在真空噴鍍儀中 對樣品進(jìn)行重金對樣

13、品進(jìn)行重金 屬旋轉(zhuǎn)投影屬旋轉(zhuǎn)投影. 微滴擴(kuò)散法及單滴展開法 適合微量樣品的操作適合微量樣品的操作,單滴展單滴展 開法的展層樣品液只需開法的展層樣品液只需510ul, 操作方法與展層方法相同操作方法與展層方法相同,可可 用用16孔酶標(biāo)板代用展層容器孔酶標(biāo)板代用展層容器 一步釋放法一步釋放法 病毒，噬菌體等含核酸的細(xì)胞器，不進(jìn)行提取核酸，病毒，噬菌體等含核酸的細(xì)胞器，不進(jìn)行提取核酸， 利用展層上相利用展層上相液液（2M2M醋酸銨），下醋酸銨），下相相液液（0.2M醋酸銨醋酸銨 或水溶液）或水溶液）鹽濃度的巨大差異，高鹽中的病毒遇到低滲鹽濃度的巨大差異，高鹽中的病毒遇到低滲 溶液而破裂，核酸分子溶液

14、而破裂，核酸分子釋放，并與細(xì)胞色素釋放，并與細(xì)胞色素CC結(jié)合，隨結(jié)合，隨 著單分子層展開，因此，釋放與展層在一步完成著單分子層展開，因此，釋放與展層在一步完成 染色與投影 n染色染色-增加核酸分子的電子密度增加核酸分子的電子密度 樣品展層后樣品展層后, ,粘取至銅網(wǎng)上粘取至銅網(wǎng)上, ,經(jīng)過染色和金屬投經(jīng)過染色和金屬投 影以增強(qiáng)反差影以增強(qiáng)反差. . 染色液為染色液為12%12%的的PTA, PTA, ( (用用90%90% 乙醇配制乙醇配制,100,100mlml染液中含染液中含1 1mlml的濃硫酸的濃硫酸) )或醋酸或醋酸 雙氧鈾雙氧鈾, ,染色染色10301030秒后秒后. .自然晾干自

15、然晾干. . n投影投影-使核酸細(xì)分子的直徑加粗使核酸細(xì)分子的直徑加粗 染色后的樣品以投影角度染色后的樣品以投影角度5959, ,用鉑用鉑 鈀合金進(jìn)鈀合金進(jìn) 行旋轉(zhuǎn)投影行旋轉(zhuǎn)投影, ,或再加噴一薄層碳膜或再加噴一薄層碳膜, ,以增加強(qiáng)度以增加強(qiáng)度. . 電鏡觀察要求 n染色，投影后，核酸分子的直徑從染色，投影后，核酸分子的直徑從20A增至增至 80100A，故在，故在10萬倍以下可以觀察到；萬倍以下可以觀察到； n樣品不進(jìn)行投影，只染色，分子的直徑大小樣品不進(jìn)行投影，只染色，分子的直徑大小 改變不大，在視野中很難尋找。改變不大，在視野中很難尋找。 無蛋白展層法 n用蛋白質(zhì)單分子展層技術(shù)，核酸分

16、子被細(xì)胞用蛋白質(zhì)單分子展層技術(shù)，核酸分子被細(xì)胞 色素色素CC覆蓋，再經(jīng)染色和投影，分子的直徑覆蓋，再經(jīng)染色和投影，分子的直徑 從從100A100A，不適合觀察酶或蛋白質(zhì)與核酸的，不適合觀察酶或蛋白質(zhì)與核酸的 復(fù)合體，與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)組分被細(xì)胞色復(fù)合體，與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)組分被細(xì)胞色 素素CC覆蓋，故建議用無蛋白展層技術(shù)。覆蓋，故建議用無蛋白展層技術(shù)。 1.1.BACBAC法法 : :用銨鹽類低分子化合物氯化烴基二甲基芐基用銨鹽類低分子化合物氯化烴基二甲基芐基 銨代替細(xì)胞色素銨代替細(xì)胞色素C,C,能在下相液表面形成一層膜吸附核能在下相液表面形成一層膜吸附核 酸酸, ,投影后投影后. .核酸分子

17、直徑為核酸分子直徑為4060A.4060A. 2.2.加染料法加染料法: :如溴乙啶、二碘丙啶加到如溴乙啶、二碘丙啶加到DNADNA的溶液的溶液 中中,DNA,DNA分子吸附到云母片上分子吸附到云母片上, ,進(jìn)行復(fù)型、投影進(jìn)行復(fù)型、投影. . RNA的展層技術(shù) 從一種非洲蛙的卵母細(xì) 胞核中提取的DNA的8個 基因片段。 5SDNA5SDNA的部分變性的部分變性 雜交重復(fù)分子 X174的DNA,長度約1.8 m 的環(huán)狀DNA(雙鏈DNA) 病毒病毒DNADNA在細(xì)菌中復(fù)制時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)在細(xì)菌中復(fù)制時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié) 合在病毒合在病毒DNADNA的特別部分，也就是的特別部分，也就是DNADNA 復(fù)制的開始點(diǎn)。復(fù)制的開始點(diǎn)。 能夠看到大腸桿菌染色體能夠看到大腸桿菌染色體 的二個片段，下邊一個是的二個片段，下邊一個是 活動中的。可以看到活動中的?？梢钥吹絤RNAmRNA 的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的翻譯過的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的翻譯過 程。程。 基因上的RNA聚合酶 雜交的雜交的DNADNA分子分子 二條二條DNADNA分子分子 經(jīng)過變性、退火處理形成缺失環(huán)和經(jīng)過變性、退火處理形成缺失環(huán)和 置換泡置換泡 昆蟲病毒的核酸分子展層圖 微滴擴(kuò)散法及單滴展開法 適合微量樣品的操作適合微量樣品的操作,單滴展單滴展 開法的展層樣品液只