基因甲基化給研究生講課課件2

1、 表觀遺傳學(xué)表觀遺傳學(xué) u從根本上講，表觀遺傳是環(huán)境因素和細胞內(nèi) 的遺傳物質(zhì)之間發(fā)生交互作用的結(jié)果。 u與中心法則不同，表觀遺傳學(xué)認為遺傳信息 并非單方向傳遞，環(huán)境因素也能改變遺傳物質(zhì)。 u目前表觀遺傳學(xué)研究主要集中在甲基化、組 蛋白修飾、小RNA 和 染色質(zhì)重塑等方面。 騾和駃騠 前者又稱馬騾，是公驢與母馬雜交的后代，體大、耳小而尾 部蓬松; 后者又叫驢騾，是公馬與母驢雜交的后代，相對來說 體小、耳大而尾毛較少。這個現(xiàn)象表明，來源于不同性別親 本的遺傳物質(zhì)在后代表達的功能可以有差別。這就是基因印 記。 基因印記基因印記 Hinny 駃騠駃騠 Mule u類胰島素生長因子-2 基因Igf2(

2、位于7 號染色體) 在小鼠身體里是否表達，要看它是否是受之于父 親，因為來自母親的基因拷貝是處于失活性狀態(tài) 的。這就是說，該基因是被母親所印記的。 u相反，17 號染色體上的Igf2r是被父親所印記的， 被特別關(guān)注。因為來自父親的Igf2r是處于失活性 狀態(tài)的，它只有受之于母親才在體內(nèi)表達。 類胰島素生長因子類胰島素生長因子 u親代印記的結(jié)果是，被印記的基因所表現(xiàn)的形 式好像半合子的情況，盡管在每一個細胞中這種 體細胞基因均成對存在。 u分子水平的分析發(fā)現(xiàn)，DNA 序列并沒有發(fā)生 改變。那么，功能與性狀的變化因何而起? X染色體失活染色體失活 X 連鎖的O基因控 制黃色毛性狀，其 等位基因o控

3、制黑 色毛性狀，另有常 染色體基因S 控 制白色性狀。在雜 合子貓XOXo，一 些細胞團產(chǎn)生黃 毛 、一些細胞團 產(chǎn)生黑毛，在白色 背景下構(gòu)成3 色皮 毛。 現(xiàn)象與猜想現(xiàn)象與猜想 基因一定受到了某種修飾，這種修飾效基因一定受到了某種修飾，這種修飾效 應(yīng)能夠通過有絲分裂和減數(shù)分裂實現(xiàn)代應(yīng)能夠通過有絲分裂和減數(shù)分裂實現(xiàn)代 間傳遞。間傳遞。 甲基化的發(fā)現(xiàn)甲基化的發(fā)現(xiàn) 1979 年年 Mc Ghee 等發(fā)現(xiàn)與雞等發(fā)現(xiàn)與雞珠蛋白珠蛋白 基因比鄰的胞嘧啶核苷酸甲基化后，該基因比鄰的胞嘧啶核苷酸甲基化后，該 基因轉(zhuǎn)錄受抑制的現(xiàn)象?；蜣D(zhuǎn)錄受抑制的現(xiàn)象。 胞嘧啶的胞嘧啶的 嘧啶環(huán)上嘧啶環(huán)上 第第5 5位碳原子

4、位碳原子 加上一個甲基加上一個甲基 DNA 甲基化的可遺傳特性是通過agouti viable yellow(Avy )小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)的。 Avy 小鼠毛色控制基因agouti 的第一外顯子前插 入了一段逆轉(zhuǎn)座子(IAP)序列。agouti 基因的表達 間接地受到IAP 的啟動子調(diào)控，因而IAP 啟動子的 甲基化狀態(tài)可以通過小鼠的毛色鑒定出來。 通過給孕期的母鼠補充富含甲基的食物可以改變 后代中三種毛色小鼠的比例，IAP 啟動子被甲基 化的小鼠，即棕色小鼠的比例增加了。 IPA LTRLTR Phenotype diversity contributed by dynamics of epi

5、genotype WT IPA LTRLTR Agouti 別小看一個小小的修飾，卻給 DNA增加了額外的信息，使得 有限的基因組遺傳信息的表現(xiàn) 呈現(xiàn)出豐富的多樣性和可塑性。 簡單地把DNA甲基化理解為“一把鎖”，凡是被DNA甲 基化標(biāo)記的部分，大都是需要被“塵封”“監(jiān)禁”的基因， 比如基因組的“搗蛋鬼”轉(zhuǎn)座子，就是被甲基化這把 “鎖”管制著，失去管制或管制不嚴(yán)，這些“搗蛋鬼”會在 基因組里跳來跳去，把基因組搞得一團糟，會引起很 多問題，如腫瘤、精神疾病等。 酵母與果蠅基因組中未能檢測到任何甲基化 CpG，這兩種生物并不依賴DNA甲基化的方 式來控制基因活性，它們采用其它的機制來 達到同一目的

6、。 脊椎動物與高等植物普遍利用DNA甲基化作 為重要的調(diào)控機制。 lDNA甲基化是常見的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象， 它是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作 用下，將甲基添加在DNA分子中的堿基 上。 lDNA甲基化的主要形式: 5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基 鳥嘌呤 。 哺乳動物基因組中約有5一1O 是CpG位點，其中約 有70 為mCpG。 CpG島島 uCpG島主要位于基因的啟動子區(qū)，少量位于基因 的第一個外顯子區(qū)；其甲基化狀態(tài)直接影響基因表 達。 u甲基化的 CpG 雙核苷酸通過募集轉(zhuǎn)錄抑制因子或 者阻礙轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合抑制基因的表達抑制基因的表達。 uCpG島一般是非甲基化的，

7、而在失活 X染色體、 印記基因和非表達的組織特異基因中則是甲基化的。 u成體基因組通常中，奢侈基因呈現(xiàn)高密度甲基化， 而含有豐富 CpG 島的管家基因則呈非甲基化。 CpG CpGCpG表示核苷酸對，其中G在DNA鏈中 緊隨C后。 基因組中60%90% 的CpG 都被甲基 化, 未甲基化的CpG 成簇地組成CpG 島, 位于結(jié)構(gòu)基因啟動子的核心序列 和轉(zhuǎn)錄起始點。 基因組甲基化的特點： 可逆性許多甲基化位點可以根據(jù)細胞活性 的要求重新甲基化或去甲基化； 組織特異性不同的組織細胞具有不同的甲 基化模式，為基因表達設(shè)定程序。 異常的甲基化可分為高甲基化和低甲基化 ，前 者指正常組織中不發(fā)生甲基化的

8、位點被甲基化 ， 后者是指在正常組織中發(fā)生甲基化的位點去甲 基化。 突變熱點：5-mC w胞嘧啶發(fā)生脫氨基作用,就可能被氧化成為 U,被DNA修復(fù)系統(tǒng)所識別和切除,恢復(fù)成C. 已經(jīng)甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨基作用, 它就 變?yōu)門, 無法被區(qū)分. w可能導(dǎo)致基因置換突變, 發(fā)生堿基錯配: T-G, 如果在細胞分裂過程中不被糾正,就會誘發(fā) 遺傳病或癌癥。 DNA甲基化的相關(guān)蛋白 從頭甲基化 酶 Dnmt3a 在未分化的胚胎干細胞中高度表達，在體細胞中 表達水平很低。主要作用是從頭甲基化，負責(zé)重 復(fù)序列的甲基化。 Dnmt3b 維持DNA甲基化轉(zhuǎn)移 酶 Dnmt1 MET1 與繁殖細胞核酸抗原(PCNA

9、)、組蛋白脫乙酰 酶2(HDAC2)和一個新的蛋白質(zhì)DNAP1(DNMT1相 關(guān)蛋白)組成復(fù)合體，維持CG序列的甲基化。 CMT 僅發(fā)現(xiàn)在植物中，其催化區(qū)l和包埋染色體的 主區(qū)，并且特異性地維持CG序列的甲基化。 去甲基化酶 5一甲基胞 嘧啶糖基化 酶、MBD2 5一甲基胞嘧啶糖基化酶是體內(nèi)候選去甲基化酶。 DNA 甲基化的機制 1) DNM T1, 持續(xù)性DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 使僅有一條鏈甲基化的DNA 雙鏈完全甲基化； 參與DNA 復(fù)制雙鏈中的新合成鏈的甲基化； DNM T1 可能直接與HDAC (組蛋白去乙?；D(zhuǎn) 移酶) 聯(lián)合作用阻斷轉(zhuǎn)錄。 2)DNM T3a、DNM T3b從頭甲基轉(zhuǎn)移酶

10、 它們可甲基化CpG, 使其半甲基化, 繼而全甲基 化； 可能參與細胞生長分化調(diào)控, 其中DNM T3b在腫 瘤基因甲基化中起重要作用。 DNA甲基化的機制 DNA甲基化反應(yīng)分為2種類型： 一、從頭甲基化：2條鏈均未甲基化的DNA被 甲基化。 二、保留甲基化：雙鏈DNA的其中1條鏈已存 在甲基化，另1條未甲基化的鏈被甲基化。 DNA 去甲基化 w1) 被動途徑: 由于核因子N F 粘附甲基化的 DNA , 使粘附點附近的DNA不能被完全甲基 化, 從而阻斷DNM T1 的作用。 w2) 主動途徑: 是由去甲基酶的作用, 將甲基基 團移去的過程。 甲基化酶甲基化酶 u一般按甲基化的方式將甲基化酶

11、（DNA methytransferase，DNMT）分為2類： u一種是維持型甲基轉(zhuǎn)移酶，需以半甲基化的雙鏈 DNA 為模板，指導(dǎo)新合成的鏈甲基化； u一種是全新甲基化酶，不依賴半甲基化 DNA 分 子中的甲基化模板而從新開始合成5mC u哺乳動物細胞中已知有活性的 DNMT 有 3 種 ， 它們是 DNMT1 、DNMT3a 、DNMT3b 。 uDNMT1 的主要功能是作為 DNA 復(fù)制復(fù)合物 (DNA synthesome) 中的組分 ，催化子鏈 DNA 半甲基化位點甲基化 ，維持復(fù)制過程中甲基化位 點的遺傳穩(wěn)定性； uDNMT3a 和 DNMT3b 主要催化從頭甲基化 ，以 非甲基化

12、的 DNA 為模板 ，催化新的甲基化位點 形成 ，在胚胎發(fā)育中起重要作用。 甲基化酶甲基化酶 CpG島的形成島的形成 雖然人類基因組上有的 CpG 島處于甲基化狀態(tài)，但是大 部分 CpG 島是不易被甲基化的，這同基因組上約 80% 的 CpG 雙核苷酸處于甲基化狀態(tài)的現(xiàn)象形成鮮明對比。 該現(xiàn)象促使人們思考為什么CpG 島不易被甲基化。 去甲基化酶去甲基化酶 哺乳動物體內(nèi)可能可能存在去甲基化的酶，這種酶 可能可能為一種糖基化酶、核酸內(nèi)切酶或真正的去 甲基化酶。 近2年來，對去甲基化酶的研究有所突破。 一般認為，DNA 甲基化有兩種方式：一種是主 動去甲基化 ；另一種是復(fù)制相關(guān)的 DNA 去甲基

13、化 DNA甲基化與腫瘤 w腫瘤細胞的特征： 癌基因低甲基化 被激活； 抑癌基因高甲基化 被沉默 腫瘤中普遍存在DNA甲基化狀態(tài)的改變，其特點是總體的甲 基化水平降低與局部的甲基化水平升高。 w 低甲基化可誘導(dǎo)原癌基因和轉(zhuǎn)座子成分活化，基因印跡缺失以及 染色體不穩(wěn)定性增加，最終誘發(fā)腫瘤 w 在整體低甲基化的水平下，某些抑癌基因發(fā)生高甲基化，導(dǎo)致基 因沉默，對腫瘤抑制能力低下 w甲基化水平與腫瘤生物學(xué)特性密切相關(guān)，甲基化水平與腫瘤生物學(xué)特性密切相關(guān)，DNA甲基化水平越低，染甲基化水平越低，染 色體越容易發(fā)生功能異常，腫瘤的浸潤能力就越高，臨床分期也愈色體越容易發(fā)生功能異常，腫瘤的浸潤能力就越高，臨

14、床分期也愈 晚晚 腫瘤的去甲基化治療 DNA甲基化程度依賴于DNMT活性。正常甲 基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用， DNMT1是DNMT3啟動CpG核苷酸從頭甲基化的保證，而 DNMT3則使甲基化水平穩(wěn)定在正常需要水平（去甲基化） 抑制DNMT活性藥物是治療腫瘤的新希望 胞苷類似物通過共價鍵與DNMT形成不可逆的復(fù)合物從而 競爭性抑制其活性,使DNA甲基化隨細胞分裂進行性丟失, 部分地逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表型。 中國測序論壇 甲基化的檢測方法甲基化的檢測方法 高效液相色譜法 w組織DNA提取(酚-氯仿法) wDNA的水解 w 取相當(dāng)于50微克DNA的溶液用40%的氫氟 酸溶解,調(diào)

15、整DNA濃度為1g/L。100C水浴3 h使DNA水解完全。氮氣吹干備用。上樣前將 處理好的DNA樣品加入200 微升新鮮配制的 0.05 moL/L磷酸二氫鉀溶液溶解。 w胞嘧啶3.36 min; 5-甲基胞嘧啶4.33 min;腺嘌 呤7.06min;鳥嘌呤8.43 min;胸腺嘧啶13.98 min 一、甲基化分型 絕大多數(shù)的DNA 甲基化分型均基于聚合酶鏈反應(yīng)( PCR )的方法, 使用 亞硫酸氫鈉處理過的DNA 作為模板。PCR 引物設(shè)計上通常存在2 種策略: 甲基化非依賴性PCR( methy lationindependent PCR, M IP)引物: 甲基化特異性PCR (

16、m ethylat ion specific PCR, MSP)引物。 （1） 甲基化特異性甲基化特異性PCR (m ethylat ion2specif ic PCR,M S PCR ) 該法是檢測基因組DNA 甲基化水平的一種常用方法, 原理是DNA 經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后, 非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏? 而甲基化的胞嘧 啶保持不變。在PCR 反應(yīng)時, 有兩套不同的引物對: 其一引物序列來自經(jīng)處理后的甲基化DNA 鏈, 若用該對引物能擴增出 片段, 說明該檢測位點發(fā)生了甲基化; 另一引物來自經(jīng)處理后的非甲基化DNA 鏈, 若用該對引物能擴增出片 段, 說明該檢測位點沒有甲基化。 兩對引物都具有很高的特異性, 與未經(jīng)處理的DNA 序列無互補配對。 M S PCR 是一種快速檢測方法, 只需極少量的DNA 用于分析。 不足之處在于: 引物的選擇和設(shè)計非常關(guān)鍵, 否則易導(dǎo)致假陽性; 如果亞硫酸氫鈉對DNA 處理不完全, 也易導(dǎo)致假陽性; M SP 法是以引物中所有CpG 位點胞嘧啶均甲基化為前提設(shè)計的, 而事實 上甲基化的CpG 島中卻并非每個CpG 位點都完全甲基化, 所以,M SP 法 常常存在目標(biāo)片段難擴增, 或者特異性差等問題, 不能反映整個CpG 島甲 基化狀態(tài)的缺陷。 w