從瓊脂糖凝膠中回收并純化DNA片段

1、實驗三實驗三 從瓊脂糖凝膠中回收并從瓊脂糖凝膠中回收并 純化純化DNA片段片段 一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?v學(xué)習(xí)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后回收并純化學(xué)習(xí)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后回收并純化DNADNA片段片段 的方法的方法 二、實驗原理二、實驗原理 v本試劑盒是從瓊脂糖凝膠中回收純化本試劑盒是從瓊脂糖凝膠中回收純化DNA片段的試片段的試 劑盒。試劑盒采用了特別的凝膠溶解劑盒。試劑盒采用了特別的凝膠溶解Buffer，其具，其具 有較強的緩沖性能并含有有較強的緩沖性能并含有pH指示劑，方便判斷溶液指示劑，方便判斷溶液 的的pH值是否適合與值是否適合與DNA制備膜結(jié)合，其溶膠能力制備膜結(jié)合，其溶膠能力 很強

2、，無需加熱，在室溫（很強，無需加熱，在室溫（15-25）條件下即可快）條件下即可快 速溶解凝膠。本試劑盒結(jié)合速溶解凝膠。本試劑盒結(jié)合DNA制備膜技術(shù)，具有制備膜技術(shù)，具有 高效、快速、方便之特點，全套操作只需高效、快速、方便之特點，全套操作只需20分鐘便分鐘便 可完成。可完成。 三、實驗材料三、實驗材料 v水浴鍋、離心機、移液器水浴鍋、離心機、移液器 vPCR擴增的擴增的spiC基因基因 v瓊脂糖凝膠回收試劑盒（瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0，Takara） 四、實驗步驟四、實驗步驟 v1. 使

3、用使用TAE緩沖液或緩沖液或TBE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，緩沖液制作瓊脂糖凝膠， 然后對目的然后對目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。 v2. 在紫外燈下切出含有目的在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用的瓊脂糖凝膠，用 紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時應(yīng)注意盡量切除不紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時應(yīng)注意盡量切除不 含目的含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高 DNA回收率。膠塊超過回收率。膠塊超過300 mg時，請使用多個時，請使用多個 Column進(jìn)行回收，否則嚴(yán)重影響收率。進(jìn)行回收，否則嚴(yán)重影響收率。注注:切膠時切膠時 請注意不要將請

4、注意不要將DNA長時間暴露于紫外燈下，以防止長時間暴露于紫外燈下，以防止 DNA損傷。損傷。 v3. 切碎膠塊。膠塊切碎后可以加快操作步驟切碎膠塊。膠塊切碎后可以加快操作步驟6的膠塊的膠塊 溶解時間，提高溶解時間，提高DNA回收率。回收率。 v4. 稱量膠塊重量，計算膠塊體積。計算膠塊體積時，稱量膠塊重量，計算膠塊體積。計算膠塊體積時， 以以1mg=1l進(jìn)行計算。進(jìn)行計算。 v5. 向膠塊中加入膠塊溶解液向膠塊中加入膠塊溶解液Buffer GM，Buffer GM 的加量如下：的加量如下： 凝膠濃度凝膠濃度 Buffer GM使用量使用量 1.0 3個凝膠體積量個凝膠體積量 1.01.5 4個

5、凝膠體積量個凝膠體積量 1.52.0 5個凝膠體積量個凝膠體積量 v6. 均勻混合后室溫均勻混合后室溫15-25溶解膠塊（膠濃度較大或溶解膠塊（膠濃度較大或 比較難溶時可以在比較難溶時可以在37加熱）。此時應(yīng)間斷振蕩混加熱）。此時應(yīng)間斷振蕩混 合，使膠塊充分溶解（約合，使膠塊充分溶解（約510分鐘）。分鐘）。 v7. 當(dāng)凝膠完全溶解后，觀察溶膠液的顏色，如果溶當(dāng)凝膠完全溶解后，觀察溶膠液的顏色，如果溶 膠液顏色由黃色變?yōu)槌壬蚍凵?，向上述膠塊溶解膠液顏色由黃色變?yōu)槌壬蚍凵蛏鲜瞿z塊溶解 液中加入液中加入3 M醋酸鈉溶液（醋酸鈉溶液（pH5.2）10l，均勻混合，均勻混合 至溶液恢復(fù)黃色。當(dāng)

6、分離小于至溶液恢復(fù)黃色。當(dāng)分離小于400 bp的的DNA片段時片段時 ，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。的異丙醇。 v8. 將試劑盒中的將試劑盒中的Spin Column安置于安置于Collection Tube 上。上。 v9. 將上述操作步驟將上述操作步驟7的溶液轉(zhuǎn)移至的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，中， 12,000 rpm離心離心1分鐘，棄濾液。如將濾液再加入分鐘，棄濾液。如將濾液再加入 Spin Column中離心一次，可以提高中離心一次，可以提高DNA的回收率。的回收率。 v10. 將將700 l的的Buffer WB加入加入Spin C

7、olumn中，室溫中，室溫 12,000 rpm離心離心30秒鐘，棄濾液。秒鐘，棄濾液。 v11. 重復(fù)操作步驟重復(fù)操作步驟10。 v12. 將將Spin Column安置于安置于Collection Tube上，室溫上，室溫 12,000 rpm離心離心1分鐘。分鐘。 v13. 將將Spin Column安置于新的安置于新的1.5 ml的離心管上，的離心管上， 在在Spin Column膜的中央處加入膜的中央處加入30 l滅菌蒸餾水或滅菌蒸餾水或 Elution Buffer，室溫靜置，室溫靜置1分鐘。分鐘。 v注）將滅菌蒸餾水或注）將滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至加熱至60使用使用 時有利于提高洗脫效率。時有利于提高洗脫效率。 v14. 室溫室溫12,000 rpm離心離心1分鐘洗脫分鐘洗