第五章 生物信息的傳遞（上）——轉(zhuǎn)錄

1、第三章第三章 生物信息的傳遞（上）生物信息的傳遞（上） TranscriptionTranscription從從DNADNA到到RNARNA DNARNA 蛋白質(zhì) 復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 翻譯 逆轉(zhuǎn)錄 RNA 復(fù)制 RNA RNA 充當(dāng)信使的證據(jù)充當(dāng)信使的證據(jù) DNADNA與與RNARNA的比較的比較 基本概念基本概念 轉(zhuǎn)錄起始：轉(zhuǎn)錄起始：RNA聚合酶、啟動子聚合酶、啟動子 轉(zhuǎn)錄的基本過程轉(zhuǎn)錄的基本過程 轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄后加工 原核生物與真核生物原核生物與真核生物mRNA的特征比較的特征比較 RNA合成與合成與DNA合成異同點(diǎn)合成異同點(diǎn) Contents 思考題？ 一、一、基本概念與基本特征基本概念與基本特

2、征 基因轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行的。它是指以基因轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行的。它是指以DNADNA 的一條鏈為模板，按照堿基互補(bǔ)配對原則，合的一條鏈為模板，按照堿基互補(bǔ)配對原則，合 成成RNARNA的過程。的過程。 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄錄 RNADNA 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄(transcription) ： 參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì) 原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板:DNA 酶: RNA聚合酶 轉(zhuǎn)錄的場所：細(xì)胞核（真核生物） 轉(zhuǎn)錄的條件：需要酶和ATP(解旋酶和RNA聚合酶），以及其他蛋白 質(zhì)因子 轉(zhuǎn)錄的結(jié)果：mRNA RNARNA合成方向：合成方向：5 35 3 轉(zhuǎn)錄的不對稱性：轉(zhuǎn)錄的不對稱

3、性： 在在RNARNA的合成中，的合成中，DNADNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為的二條鏈中僅有一條鏈可作為 轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。轉(zhuǎn)錄的不對稱性。 編碼鏈與模板鏈編碼鏈與模板鏈 與與mRNAmRNA序列相同的那條序列相同的那條DNADNA鏈稱為鏈稱為編碼鏈，即編碼鏈，即 有義鏈有義鏈(sense strand)(sense strand)；將另一條根據(jù)堿基互補(bǔ)；將另一條根據(jù)堿基互補(bǔ) 原則指導(dǎo)原則指導(dǎo)mRNAmRNA合成的合成的DNADNA鏈稱為鏈稱為模板鏈，即反模板鏈，即反 義鏈義鏈(antisense strand)(antisense strand)。 GCAGT

4、ACATGTC 5 5 3 3 DNA CGTCATGTACAG 編碼鏈 模板鏈 GCAGUACAUGUCmRNA 轉(zhuǎn)錄 模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上 轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向 5 5 3 3 3 3 5 5 模板鏈模板鏈編碼鏈編碼鏈 編碼鏈編碼鏈模板鏈模板鏈 轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向 DNADNA分子上轉(zhuǎn)錄出分子上轉(zhuǎn)錄出RNARNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因。的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因。 結(jié)構(gòu)基因： 轉(zhuǎn)錄單元（transcription unittranscription unit） 一段從啟動子開始至終止子結(jié)束的DNA序列。 （一）（一） RNA聚合酶聚合酶 （二）（二） 啟動子啟動子(p

5、romoter) 二、參與轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵酶與元件二、參與轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵酶與元件 （一）（一） RNARNA聚合酶聚合酶 原核生物原核生物RNARNA聚合酶（大腸桿菌為例）聚合酶（大腸桿菌為例） 全酶全酶(holoenzyme)=(holoenzyme)=核心酶核心酶(core enzyme)+(core enzyme)+因子因子 亞基：識別啟動子，起始轉(zhuǎn)錄。亞基和其他肽鏈的結(jié) 合不很牢固，易脫離全酶。 核心酶：全酶脫離亞基剩下的2稱為核心酶。 核心酶本身就能催化核苷酸間磷酸二酯鍵的形成。 亞基：是酶和底物結(jié)合的部位和催化位點(diǎn)。利福平 (rifampicin)和利福霉素(rifamycin)通過

6、結(jié)合亞基， 對全酶有強(qiáng)烈的抑制作用，抑制RNA合成的起始，但不 抑制其延長。亞基基因rpoB突變可使細(xì)菌對利福平有 抗性。鏈霉溶菌素(streptolydigin)能抑制RNA鏈的延 長，rpoB突變卻可使細(xì)胞對鏈霉溶菌素亦發(fā)生抗性。 亞基：其作用是與模板DNA相結(jié)合。亞基 的堿性較強(qiáng)，適于與模板DNA相結(jié)合。肝素是一 種多價陰子，能和亞基結(jié)合，從而抑制DNA 與RNA聚合酶相結(jié)合，進(jìn)一步抑制轉(zhuǎn)錄作用。 亞基：功能現(xiàn)尚未知。然而，當(dāng)噬菌體T4感染 E.coli時，其亞基即在精氨酸上被ADP-核糖化。 這種修飾作用使該RNA聚合酶全酶對其原先識別 的啟動子的親和力減弱。所以有人認(rèn)為，亞基 的功能

7、可能是識別其相應(yīng)的啟動子。 大腸桿菌大腸桿菌RNA聚合酶的組成分析聚合酶的組成分析 亞亞 基基 基因基因相對分相對分 子量子量 亞基亞基 數(shù)數(shù) 組分組分功能功能 rpoArpoA36500365002 2核心酶核心酶核心酶組裝，啟動子識核心酶組裝，啟動子識 別別 rpoBrpoB1510015100 0 0 1 1核心酶核心酶 和和共同形成共同形成RNARNA合合 成的活性中心成的活性中心 rpoCrpoC1550015500 0 0 1 1核心酶核心酶 ？11000110001 1核心酶核心酶？ rpoDrpoD70000700001 1 因子因子存在多種存在多種 因子，用于因子，用于 識別

8、不同的啟動子識別不同的啟動子 原核生物原核生物RNA聚合酶的作用聚合酶的作用 識別啟動子。主要依賴于亞基， 亞基只參 與轉(zhuǎn)錄的起始，并決定轉(zhuǎn)錄的方向。 與DNA結(jié)合并使之解鏈，另外還具有解旋、 重新使DNA螺旋化作用。 催化RNA聚合反應(yīng)。負(fù)責(zé)三種RNA合成。 RNA聚合酶核心酶通過與不同的亞基結(jié)合， 識別不同的啟動子。 2. 真核生物真核生物RNA聚合酶聚合酶 細(xì)菌只有一種RNA聚合酶，它完成細(xì)胞中所有RNA 的合成。 真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)更加復(fù)雜。真核細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生三 種RNA聚合酶，位于不同的部位，且均有復(fù)雜的亞 基結(jié)構(gòu)。每種酶負(fù)責(zé)不同種類基因的轉(zhuǎn)錄。它們的一 般性質(zhì)見下表。 酶位置轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

9、 相對活 性 對-鵝膏蕈堿的 敏感性 RNA聚合 酶 核仁rRNA 50- 70% 不敏感 RNA聚合 酶 核質(zhì)hnRNA 20- 40% 敏感 RNA聚合 酶 核質(zhì)tRNA約10%存在物種特異性 真核細(xì)胞的三種真核細(xì)胞的三種RNARNA聚合酶特征比較聚合酶特征比較 RNA聚合酶的活性最顯著。位于核仁中，負(fù) 責(zé)轉(zhuǎn)錄rRNA基因(rDNA)，細(xì)胞內(nèi)絕大部分是rRNA。 其活性不被-鵝膏蕈堿所抑制。 RNA聚合酶位于核漿中，負(fù)責(zé)hnRNA的合 成。hnRNA是mRNA的前體。其活性可被低濃度的 -鵝膏蕈堿所迅速抑制， RNA聚合酶負(fù)責(zé)合成tRNA和許多小的核內(nèi) RNAs。聚合酶對-鵝膏蕈堿的反應(yīng)則

10、不盡相同： 在動物細(xì)胞中聚合酶可被高濃度-鵝膏蕈堿所抑制， 而在酵母和昆蟲細(xì)胞中則不會被抑制。 RNA聚合酶與聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別聚合酶的區(qū)別 RNA聚合酶DNA聚合酶 引物無有 產(chǎn)物較短，游離較長，與模板以氫 鍵相連 作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時進(jìn)行 外切酶活性無5 3，3 5 校對合成能力 無有 修復(fù)能力無有 某些常用的轉(zhuǎn)錄抑制劑某些常用的轉(zhuǎn)錄抑制劑 抑制劑抑制劑靶酶靶酶抑制作用抑制作用 利福霉素利福霉素細(xì)菌的全酶細(xì)菌的全酶與與亞基結(jié)合，阻止起始亞基結(jié)合，阻止起始 鏈霉溶菌素鏈霉溶菌素細(xì)菌的核心酶細(xì)菌的核心酶與與亞基結(jié)合，阻止延長亞基結(jié)合，阻止延長 放線菌素放線菌素D真核真核RN

11、A聚合酶聚合酶與與DNA結(jié)合，阻止延長結(jié)合，阻止延長 -鵝膏蕈堿鵝膏蕈堿真核真核RNA聚合酶聚合酶與與RNA聚合酶聚合酶結(jié)合結(jié)合 （二）（二） 啟動子啟動子(promoter)(promoter) 啟動子：啟動子：指能被指能被RNARNA聚合酶識別、結(jié)合并啟聚合酶識別、結(jié)合并啟 動基因轉(zhuǎn)錄的一段動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNADNA序列。序列。 原核生物啟動子特性原核生物啟動子特性 在基因表達(dá)調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄起始是關(guān)鍵，基因是 否能表達(dá)決定于在特定的啟動子起始過程。 只有RNA聚合酶能夠特異性地與啟動子相結(jié) 合。亞基起識別作用，沒有時，核心酶偶而 亦能起始RNA的合成，但有許多起始錯誤，而 且核心酶所合成的

12、RNA鏈的起始在某個基因的 兩條鏈上是隨機(jī)的。但當(dāng)存在時，則起始在 正確的位點(diǎn)上。 RNA聚合酶能否與啟動子相互作用是起始轉(zhuǎn) 錄的關(guān)鍵問題。 不同啟動子對RNA聚合酶的親和力各不同。 可能對調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的頻率，即對基因表達(dá)的 程度有重要不同。 一類是RNA聚合酶可以直接識別的啟動子。這類 啟動子應(yīng)當(dāng)總是能被轉(zhuǎn)錄。但實(shí)際上也不都如此，外 來蛋白質(zhì)可對其有影響，即該蛋白質(zhì)可直接阻斷啟動 子，也可間接作用于鄰近的DNA結(jié)構(gòu)，使聚合酶不能 和啟動子結(jié)合。 另一類啟動子在和聚合酶結(jié)合時需要有蛋白質(zhì)輔 助因子的存在。這種蛋白質(zhì)因子能夠識別與該啟動子 順序相鄰或甚至重疊的DNA順序。 1） 兩類不同的啟動子

13、兩類不同的啟動子 為什么RNA聚合酶能夠僅在啟動子處結(jié)合呢? RNA聚合酶分子上可能有一個活性中心能夠識 別出DNA雙螺旋上某特異序列的化學(xué)結(jié)構(gòu)； 啟動子處的核苷酸順序具有特異的形狀以便與 RNA聚合酶結(jié)合，就好像酶與其底物的結(jié)構(gòu)相恰恰適 合一樣。 2） 啟動子的共同順序啟動子的共同順序 利用“足跡法”和測序技術(shù)，對100多種啟動子 的順序進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在RNA合成開始位點(diǎn)的上游 大約10bp和35bp處有兩個共同的順序，稱為-10和- 35序列。這兩個序列的特征如下： -35區(qū)：T85T83G81A61C69A52 （-35序列, TTGACA區(qū)） -10區(qū)：T89A89T50A65A65

14、T100 （-10序列,TATA區(qū)） 大多數(shù)啟動子均有共同順序(consensus sequence)， 只有少數(shù)幾個核苷酸的差別。共同順序是啟動子的關(guān) 鍵部位。 啟動子的共同順序啟動子的共同順序 啟動子的共同順序啟動子的共同順序 TATA區(qū)：(又稱為-10序列或Pribnow盒) 酶的緊密結(jié)合位點(diǎn)（富含AT堿基，利于雙鏈打開） -10序列的突變不影響RNA聚合酶與啟動子結(jié)合的 速度，但會降低雙鏈解開的速度。 TATA盒決定著轉(zhuǎn)錄的方向。 -35序列是RNA聚合酶全酶的識別位點(diǎn)，對全 酶有很高的親和性。 如果-35序列發(fā)生突變或缺失，將大大降低對 全酶的親和性，即降低RNA聚合酶與啟動子的 結(jié)

15、合速度，但不影響轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近DNA 雙鏈的解開。 TTGACA區(qū)（又稱-35序列） 提供了RNA聚合酶全酶識別的信號 編碼鏈 AACTGTATATTA 模板鏈 TTGACATATAAT 3 5 DNA 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) Probnow盒子 啟動子 35 10 +1 轉(zhuǎn)錄區(qū) 53 RNA 轉(zhuǎn)錄起點(diǎn) 與新生RNA鏈第一個核甘酸相對應(yīng)DNA鏈上的堿基。 大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識別的啟動子區(qū) T85T83G81A61C69A52T89A89T50A65A50T96 典型啟動子的結(jié)構(gòu)典型啟動子的結(jié)構(gòu) -35 -10 轉(zhuǎn)錄起點(diǎn) TTGACA 16-19bp TATAAT 5-9bp 原核生物亦有少數(shù)啟動

16、子缺乏這兩個序列 （-35和-10)之一。在這種情況下，RNA聚合 酶往往不能單獨(dú)識別這種啟動子，而需要有輔 助蛋白質(zhì)的幫助。 E.coli RNA聚合酶與啟動子結(jié)合的過程可分為兩步： 酶識別啟動子，并與其結(jié)合形成“關(guān)閉”復(fù)合體(即 雙螺旋形式)。這一步所識別的是-35序列。 “關(guān)閉”復(fù)合體轉(zhuǎn)變?yōu)椤伴_放”復(fù)合體(即雙螺旋解 旋，兩條鏈分開)，此時酶的結(jié)合比較緊密。在這個轉(zhuǎn) 變中，富含AT堿基對的-10區(qū)約有17bp被解旋，暴露 出模板鏈。-10區(qū)的突變可阻礙開放復(fù)合體的形成。 許多突變改變了-10序列中的堿基，但并未減低其AT 對的水平，卻仍然能阻礙其融化為開放復(fù)合體，可見 -10區(qū)除了要易于

17、融化之外，還必須有特異的形狀，以 便RNA聚合酶能夠識別它。 RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合聚合酶與啟動子的結(jié)合 RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合模式圖聚合酶與啟動子的結(jié)合模式圖 真核生物啟動子真核生物啟動子 真核有真核有三種三種不同的啟動子和有關(guān)的元件不同的啟動子和有關(guān)的元件 啟動子啟動子最為復(fù)雜，它和原核的啟動子有很多不同最為復(fù)雜，它和原核的啟動子有很多不同 又稱rRNA基因啟動子或型啟動子。不同真核生 物型啟動子序列有較大的差異，缺乏保守性。目前 發(fā)現(xiàn)有兩個區(qū)域是轉(zhuǎn)錄必需的： -40+5近啟動子部分：為核心序列，其功能是 決定轉(zhuǎn)錄起始的精確位置。這一段序列的全部或部分 缺失，被同樣長度的寡聚核苷酸

18、替代，在選擇性位點(diǎn) 作單個堿基突變等變化，都會消除或強(qiáng)烈降低 rDNA 轉(zhuǎn)錄能力。 -165-40遠(yuǎn)啟動子部分：又稱上游控制元件 (UCE)，其功能是影響轉(zhuǎn)錄的頻率。這段序列受到缺失、 置換、插入等破壞，可造成轉(zhuǎn)錄下降100倍。 1） RNA聚合酶聚合酶啟動子啟動子 又稱蛋白質(zhì)基因啟動子或型啟動子。該啟動子 有四個區(qū)域?qū)D(zhuǎn)錄起始和活性起著調(diào)控作用，是真核 基因轉(zhuǎn)錄不可缺少的。 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：其堿基大多為A，兩側(cè)各有若干個 嘧啶核苷酸：YAYTCYYY。該序列對啟動子的強(qiáng)度和 確定起始位點(diǎn)方面都是必要的。 TATA盒：位于-25-30bp左右，是核心序列，又 稱Hogness box。其共有序列

19、： T85A97T93A85(A63/T37)A83(A50/T37) 基本上由AT組成，極少數(shù)啟動子中有GCbp。 2） RNA聚合酶聚合酶啟動子啟動子 TATA盒的作用在于決定轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)，序列的改變會是轉(zhuǎn) 錄位點(diǎn)偏移；缺失TATA盒，轉(zhuǎn)錄將在許多位點(diǎn)上開始。 TATA盒決定轉(zhuǎn)錄的效率： 如雞蛋清蛋白基因啟動子的TATA變?yōu)門AGA后，轉(zhuǎn)錄 效率大大下降； 兔珠蛋白中TATA盒是ATAAAA，人工突變?yōu)锳TGTAA 后，轉(zhuǎn)錄效率下降80%； 人的-珠蛋白基因的ATAAAA序列變?yōu)锳TGAAA、 ATACAA或 ATAGAA， -珠蛋白的產(chǎn)量大大降低，引起 地中海貧血癥。 少數(shù)蛋白質(zhì)基因缺乏T

20、ATA盒，如腺病毒DNA結(jié)合蛋白 （27KD）基因的上游沒有TATA盒。 上游調(diào)控區(qū)（UPE）：真核型啟動子上游具有多種 調(diào)控元件： CAAT盒：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游70-80bp處的CAAT 順 序 。 這 一 順 序 具 有 較 保 守 的 共 同 順 序 ： GGC/TCAATCT。RNA聚合酶可以識別一順序。用 人工方法誘導(dǎo)兔珠蛋白基因CAAT順序發(fā)生突變，兔 珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平降低。 GC盒：位于CAAT盒鄰近，共同順序：GGGCGG。 此外，在不同的啟動子上還有其它類型的UPE，他 們是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的位點(diǎn)，影響著轉(zhuǎn)錄活化和頻率。 遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)：在真核生物中，有些基因的啟動子遠(yuǎn) 上游

21、區(qū)域（-100bp以上）可大大增強(qiáng)啟動子的活性， 這種序列稱為增強(qiáng)子。 增強(qiáng)子有兩個特征： 與啟動子的相對位置不固定，而能有很大的變動； a. b. 能在兩個方向產(chǎn)生作用。一個增強(qiáng)子并不限于促 進(jìn)某一特殊啟動子的轉(zhuǎn)錄，它能刺激在它附近的任 一啟動子。首先被發(fā)現(xiàn)的增強(qiáng)子是SV40增強(qiáng)子。 SV40 增強(qiáng)子由兩個72bp重復(fù)串連而成，約在 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游200bp處，即107178和179 250序列。 缺失實(shí)驗(yàn)顯示兩個重復(fù)缺失一個并不產(chǎn)生什么影 響，如兩個均缺失即將大大降低活體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。有人 發(fā)現(xiàn)，如果將珠蛋白基因放在含有72bp重復(fù)的DNA 分子中，它的轉(zhuǎn)錄作用在活體內(nèi)將增高約200倍以上，

22、甚至當(dāng)此72bp順序位于離轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游1400bp或下 游3000bp時仍有作用。各個基因中的增強(qiáng)子順序差別 較大，但有一個基本的核心順序(core sequence)： AAAGGTGTGGGTTTGG RNA聚合酶能識別各種各樣不同的啟動子順序， 當(dāng)然，還是要依靠一些輔助因子。 例如，RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄爪蟾的5SRNA基因 時，需要一個轉(zhuǎn)錄因子，37KD的蛋白質(zhì)TFA的協(xié)助。 TFA結(jié)合在+45到+96的部位。它有雙重作用(另外 一個作用是在卵母細(xì)胞中與5SRNA相結(jié)合)。 另外還需要兩個因子(TFB和TFC)，但這兩 個因子對所有第類基因的轉(zhuǎn)錄都需要的。而TFA 則是對5S基因?qū)Ｒ坏摹?

23、3 3） RNARNA聚合酶聚合酶啟動子啟動子 在枯草桿菌(Bacillus subtilis)中首次發(fā)現(xiàn)不同啟動 子需要不同因子。 細(xì)胞中存在主要的因子，識別主要啟動子。此 外，還有另外一些因子，能夠識別另一些啟動子，并 促使核心酶起始轉(zhuǎn)錄。這些變異的因子在細(xì)胞中有特 別功能，通常能劇烈改變細(xì)胞RNA的合成方式，以便 在需要時使一組全新的基因得以表達(dá)。 噬菌體往往有其自己的因子，借以在噬菌體發(fā) 育的某一特殊階段開動其所需要的某些噬菌體基因的 轉(zhuǎn)錄。 不同啟動子需要不同不同啟動子需要不同因子因子 E.coli細(xì)胞中正常的因子稱為70(表示其分子量 為70KD)。 E.coli中有17個熱休克基

24、因，其基因表達(dá)依賴于 基因htpR，受熱休克反應(yīng)所誘導(dǎo)。hrpR的產(chǎn)物是一個 很不穩(wěn)定的32KD蛋白質(zhì)，它就是一種變異的因子， 稱為32。32能引導(dǎo)核心酶在熱休克基因的啟動子處 起始轉(zhuǎn)錄。 70和32識別的啟動子的順序是不同的。特別 是其-10順序幾乎完全不同。 E.coli另一種因子是在氮饑餓時起作用的，稱為 60。正常時E.coli細(xì)胞中僅有少量60，但當(dāng)介質(zhì)中 氨缺乏時，60大量增多，以開啟某些可利用其他氮源 的基因。這就是說，60能引導(dǎo)核心酶識別啟動子的另 一種共同順序。 60所識別的-35順序?qū)嶋H上位于-20處，因?yàn)? 10和-35順序之間的間距特別短，只有6bp。 E.coliE.

25、coli的不同的不同 因子識別不同的共同順序因子識別不同的共同順序 因子因子基因基因功用功用-35順序順序間隔距離間隔距離-10順序順序 70rpoD正常狀態(tài)正常狀態(tài)TTGACA10-18bpTATAAT 32rpoH熱休克熱休克CNCTTGAA13-15bpCCCCATNT 60rpoN氮的利用氮的利用CTGGNA6bpTTCGA 枯草桿菌正常因子(相當(dāng)于70)稱43，它能識 別70所識別的共同順序。從一組基因表達(dá)變換為另一 組基因表達(dá)往往需要更換因子。 B.subtilis在芽孢形成中產(chǎn)生新的因子： 在芽孢形成期開始時43即被37所取代。芽孢 形成開始時，在37的指導(dǎo)下，RNA聚合酶即能轉(zhuǎn)

26、錄 第一組芽孢形成基因。37分子較43略小。它在營養(yǎng) 型細(xì)胞中即已存在，但為量很少，而且也不和核心酶 結(jié)合形成全酶。 在芽孢形成開始后4h，29開始出現(xiàn)。它指導(dǎo) 另一組新基因的轉(zhuǎn)錄。29不存在于營養(yǎng)型細(xì)胞中，故 可能是芽孢形成基因在37轉(zhuǎn)錄下的表達(dá)產(chǎn)物。 目前尚不了解這種替代如何調(diào)控的，現(xiàn)在認(rèn)為機(jī) 制可能很復(fù)雜，牽涉到其他好幾種蛋白質(zhì)。這種替代 并不完全，而且被替代下的43也未完全被滅活。大約 還有10%的核心酶仍和43相結(jié)合，可能還有某些營 養(yǎng)型酶在芽孢形成時仍存在于細(xì)胞中。 在營養(yǎng)型細(xì)胞中存在一種32。它在芽孢形成早期 出現(xiàn)活性，指導(dǎo)某些啟動子起始轉(zhuǎn)錄。其含量極少， 不到1%。 在營養(yǎng)型細(xì)

27、胞中還有一種28，它的量不多，僅 代表RNA聚合酶總活性的一小部分，而在芽孢形成開 始時即告失活。然而奇怪的是，在某些不能形成芽孢 的突變株中，是找不到它的活性的。所以有人認(rèn)為， 28是表示營養(yǎng)已用竭，應(yīng)當(dāng)開始芽孢形成反應(yīng)的信號 系統(tǒng)的一個部分。 真核生物啟動子的結(jié)構(gòu)真核生物啟動子的結(jié)構(gòu) 核心啟動子（core promoter） 上游啟動子元件（upstream promoter element， UPE） 1 1、核心啟動子、核心啟動子 定義：定義：指保證指保證RNARNA聚合酶聚合酶轉(zhuǎn)錄正常起始所必轉(zhuǎn)錄正常起始所必 需的、最少的需的、最少的DNADNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn)序列，包括轉(zhuǎn)

28、錄起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn) 錄起始位點(diǎn)上游錄起始位點(diǎn)上游TATATATA區(qū)區(qū) 作用：選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，保證精確起始 TATA 常在-25bp左右，相當(dāng)于原核的-10序列 T T85 85A A9797T T9393A A8585A A6363A A8383A A5050 2 2、上游啟動子元件、上游啟動子元件 包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等 作用：控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。 CAAT：-70 - -80bp GGGCGG：-80 - -110bp 啟動子的效率啟動子的效率 各啟動子的效率是不一樣的，效率好的啟動子可 以使RNA轉(zhuǎn)錄重復(fù)的更快一些。即啟動子開始與酶結(jié) 合和開放型復(fù)合物的

29、形成速度，在各啟動子之間不一 樣。有的啟動子需要10min以上才啟動一次，有的僅 12s內(nèi)啟動一次。 啟動子的啟動速率是基本的限速步驟，在這一步 驟的基礎(chǔ)上，基因表達(dá)的速度就確定了。 即使是同一基因，其轉(zhuǎn)錄效率也是不固定。在不 同的生長情況下轉(zhuǎn)錄可根據(jù)需要而改變。 啟動子的效率及影響因素啟動子的效率及影響因素 E.coli轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)常常是通過調(diào)節(jié)蛋白的介導(dǎo)。調(diào) 節(jié)蛋白與啟動子或啟動子附近的序列相結(jié)合，從而增 高或降低RNA聚合酶起始的效率。 調(diào)節(jié)蛋白有： 阻遏蛋白(repressor)：能阻斷RNA聚合酶的結(jié)合， 從而抵制轉(zhuǎn)錄； 激活蛋白(activator)：能與RNA聚合酶結(jié)合并提 高其活性

30、。 調(diào)節(jié)蛋白對啟動子的影響調(diào)節(jié)蛋白對啟動子的影響 凡需要激活蛋白才能充分發(fā)揮作用的啟動子常常 與-35順序很不相似，這提示激活蛋白可以取代這個結(jié) 合位點(diǎn)。 作為一種啟動子的阻遏蛋白可能是另一種啟動子 的激活蛋白，反之亦然，這取決于其結(jié)合位點(diǎn)的準(zhǔn)確 位置。一種調(diào)節(jié)蛋白的名稱常常只是反映了它第一次 被發(fā)現(xiàn)時的功能。 調(diào)節(jié)蛋白對啟動子的影響調(diào)節(jié)蛋白對啟動子的影響 影響啟動子功能的調(diào)節(jié)蛋白影響啟動子功能的調(diào)節(jié)蛋白 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)對啟動子的影響對啟動子的影響在細(xì)胞中的功能在細(xì)胞中的功能 乳糖阻遏蛋白乳糖阻遏蛋白阻遏作用阻遏作用 阻止代謝乳糖的酶的合成阻止代謝乳糖的酶的合成(當(dāng)當(dāng) 乳糖不存在時乳糖不存在時)

31、 半乳糖阻遏蛋白半乳糖阻遏蛋白阻遏作用阻遏作用 阻止代謝半乳糖的酶的合成阻止代謝半乳糖的酶的合成 (當(dāng)半乳糖不存在時當(dāng)半乳糖不存在時) LexA阻遏蛋白阻遏蛋白阻遏作用阻遏作用 阻止阻止DNA修復(fù)酶的合成修復(fù)酶的合成(當(dāng)細(xì)當(dāng)細(xì) 胞胞DNA未受到損傷時未受到損傷時) 阻遏蛋白阻遏蛋白阻遏作用阻遏作用(啟動子啟動子PL和和PR) 阻止阻止生命周期中裂解期需酶生命周期中裂解期需酶 的合成的合成 阻遏蛋白阻遏蛋白激活作用激活作用(啟動子啟動子PRM) 通過激活自身啟動子而增加其通過激活自身啟動子而增加其 本身的合成本身的合成 影響啟動子功能的調(diào)節(jié)蛋白影響啟動子功能的調(diào)節(jié)蛋白 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)對啟動子的影響

32、對啟動子的影響在細(xì)胞中的功能在細(xì)胞中的功能 CAP蛋白蛋白激活作用激活作用 當(dāng)葡萄糖不存在時，增加代當(dāng)葡萄糖不存在時，增加代 謝其他糖類的酶的合成謝其他糖類的酶的合成 CAP蛋白蛋白阻遏作用阻遏作用 調(diào)節(jié)本身的基因，并阻止在調(diào)節(jié)本身的基因，并阻止在 葡萄不存在時所不需要的蛋葡萄不存在時所不需要的蛋 白質(zhì)的合成白質(zhì)的合成 AraC蛋白蛋白激活作用激活作用 當(dāng)阿拉伯糖存在時，增加利當(dāng)阿拉伯糖存在時，增加利 用阿拉伯糖所需要的蛋白質(zhì)用阿拉伯糖所需要的蛋白質(zhì) 的合成的合成 AraC蛋白蛋白阻遏作用阻遏作用 阻止代謝阿拉伯糖的酶的合阻止代謝阿拉伯糖的酶的合 成成(當(dāng)阿拉伯糖不存在時當(dāng)阿拉伯糖不存在時)

33、c蛋白蛋白激活作用激活作用 增加建立溶源狀態(tài)所需的噬增加建立溶源狀態(tài)所需的噬 菌體蛋白質(zhì)的合成菌體蛋白質(zhì)的合成 RNA聚合酶首先要在啟動子處使DNA解旋才能起 始轉(zhuǎn)錄。因此，DNA模板的超螺旋張力對啟動子效率 有影響，凡有利或不利于解旋的情況就會增高或降低 起始的頻率。 DNA旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)能使細(xì)菌的DNA保持超螺 旋狀態(tài)，故有利于解旋。DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制劑萘啶酮酸 可以抑制許多基因的表達(dá)。 拓?fù)洚悩?gòu)酶能阻止負(fù)超螺旋。編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶 的基因發(fā)生突變時可增強(qiáng)某些基因的表達(dá)。 模板的超螺旋張力模板的超螺旋張力對啟動子效率的影響對啟動子效率的影響 但是，增加負(fù)超螺旋不一定就會增強(qiáng)啟動子的功 能

34、，對某些啟動子可能正好相反。這可能在于負(fù)超螺 旋改變了啟動子的微細(xì)構(gòu)象，抑制了RNA聚合酶的功 能。詳細(xì)的機(jī)制還不明了，旋轉(zhuǎn)酶基因的啟動子本身 據(jù)信就有這樣的特性。這是有利于調(diào)節(jié)負(fù)超螺旋程度 的：當(dāng)細(xì)胞DNA的負(fù)超螺旋達(dá)到足夠的程度時，DNA 旋轉(zhuǎn)酶的合成就會自動放慢。 此外，某些啟動子對超螺旋張力很敏感，而另一 些則不很敏感?？赡苄灾皇敲總€啟動子對超螺旋的 依賴程度不同，這取決于其不同的順序。某些啟動子 的順序易于融化(故較不依賴于超螺旋)，而另一些的順 序較難融化。另一種說法是細(xì)菌染色體的不同區(qū)域本 來就有不同程度負(fù)超螺旋，因此，啟動子處于染色體 的什么區(qū)域就是一種重要因素。 原核生物R

35、NA聚合酶具有很大的全能性，幾乎不 依賴任何其他蛋白質(zhì)。但是，真核生物RNA聚合酶不 具有全能性，需要依賴于一系列蛋白因子才能識別和 結(jié)合到啟動子特定序列上，并啟動轉(zhuǎn)錄。 真核生物基因轉(zhuǎn)錄必需的蛋白因子統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)錄因 子。目前已經(jīng)分離純化或鑒定的轉(zhuǎn)錄因子有數(shù)百種， 分為兩類： a.普遍性轉(zhuǎn)錄因子：結(jié)合與啟動子及鄰近的序列。 b.轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子：結(jié)合與上游調(diào)控區(qū)和增強(qiáng)子區(qū)。 轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的影響轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的影響 上游序列在某些時候可作為一些激活劑的結(jié)合部位， 直接激活RNA聚合酶； 上游序列和拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)合，誘導(dǎo)DNA形成有利 的超螺旋狀態(tài)，有利RNA合成； 上游序列促使RNA聚合酶能更好地

36、接近啟動子區(qū) 段，或使DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合固定在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上； 上游序列可影響-10和-35區(qū)的DNA結(jié)構(gòu)。 上游上游DNA序列可增強(qiáng)啟動子的活性序列可增強(qiáng)啟動子的活性 轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物 原核生物轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物 轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄復(fù)合體轉(zhuǎn)錄復(fù)合體 TBPTBP TAFsTAFs TFIIATFIIA TFIIB TFIIFTFIIB TFIIF Pol II Pol II TFIIETFIIE RNA pol RNA pol 的轉(zhuǎn)錄起始的轉(zhuǎn)錄起始 真核生物轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物 轉(zhuǎn)錄的基本過程 1、起始位點(diǎn)的識別：RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作 用并與之相結(jié)合的過程。 因子能識別啟動子，并識別有義

37、鏈，它與核心酶結(jié)合， 引導(dǎo)核心酶定位到啟動子部位。 2、轉(zhuǎn)錄起始 RNA鏈上第一個核甘酸鍵的產(chǎn)生標(biāo)志著轉(zhuǎn)錄起始 當(dāng)聚合酶結(jié)合到啟動子上后，在啟動子附近將當(dāng)聚合酶結(jié)合到啟動子上后，在啟動子附近將DNADNA局部解局部解 鏈，約解開鏈，約解開1717個堿基對。（酶與啟動子結(jié)合的部位是個堿基對。（酶與啟動子結(jié)合的部位是ATAT富富 集區(qū)，有利于解鏈）集區(qū)，有利于解鏈） 第一個核苷三磷酸第一個核苷三磷酸( (常常是常常是GTPGTP或或ATP)ATP)結(jié)合到全酶上，結(jié)合到全酶上， 形成形成“啟動子啟動子- -全酶全酶- -核苷三磷酸核苷三磷酸”三元起始復(fù)合物。三元起始復(fù)合物。 第二個核苷酸參入，連結(jié)到

38、第一個核苷酸的第二個核苷酸參入，連結(jié)到第一個核苷酸的33羥基上，羥基上， 形成了第一個磷酸二酯鍵。形成了第一個磷酸二酯鍵。 因子從全酶上掉下，又去結(jié)合其它的核心酶。因子從全酶上掉下，又去結(jié)合其它的核心酶。 3 3、RNARNA鏈的延伸鏈的延伸 亞基脫落，亞基脫落，RNApolRNApol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松 弛，沿著弛，沿著DNADNA模板前移，方向?yàn)槟０迩耙?，方向?yàn)镈NADNA模板鏈的模板鏈的 3 53 5， 同時將核苷酸逐個加到生長的同時將核苷酸逐個加到生長的RNARNA鏈的鏈的3-OH3-OH端，使端，使RNARNA 鏈以鏈以 5 35 3方向延伸

39、。方向延伸。 在在核心酶核心酶作用下，作用下，NTPNTP不斷聚合，不斷聚合，RNARNA鏈不斷延長。鏈不斷延長。 核心酶核心酶 DNA RNA 4 4、轉(zhuǎn)錄終止、轉(zhuǎn)錄終止 終止子（terminator）：基因編碼區(qū)下游使 RNA聚合酶終止mRNA合成的密碼子。 強(qiáng)終止子內(nèi)部終止子 弱終止子 需要因子（rho factor） 又稱為依賴性終止子 （Rho-dependent terminator） 不依賴Rho ()因子的轉(zhuǎn)錄終止 依賴Rho ()因子的轉(zhuǎn)錄終止 轉(zhuǎn)錄的終止轉(zhuǎn)錄的終止 DNA分子上有終止轉(zhuǎn)錄的特殊信號，也是特定 的核苷酸序列，稱為終止子。 RNA聚合酶可以識別終止子，它在一種蛋

40、 白因子的幫助下，終止轉(zhuǎn)錄，放出RNA鏈；有 時，RNA聚合酶不需要蛋白因子的幫助即可終 止轉(zhuǎn)錄。 核心酶釋放了RNA后，也離開DNA。 DNA上的解鏈區(qū)重新形成雙螺旋。 兩類終止子共同的序列特征兩類終止子共同的序列特征 在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)前有一段回文序列?；匚男蛄械?兩個重復(fù)部分(每個720bp)由幾個不重復(fù)的 bp節(jié)段隔開?；匚男蛄械膶ΨQ軸一般距轉(zhuǎn)錄終 止點(diǎn)1624bp。 不依賴不依賴 因子的終止因子的終止 終止位點(diǎn)上游一般存在一個富含GC堿基的二重 對稱區(qū)（回文序列），RNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)； 在回文序列的下游方向又常有68個AT堿基對 (在模板鏈上為A、在mRNA上為U)； 兩類終止子的不同點(diǎn)兩

41、類終止子的不同點(diǎn) 發(fā)夾式結(jié)構(gòu)和寡聚U的共同作用使RNA從三元復(fù) 合物中解離出來。 終止效率與二重對 稱序列和寡聚U的 長短有關(guān)，長度 效率 依賴依賴 因子的終止因子的終止 因子：六聚體蛋白、水解各種核甘三 磷酸促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合 物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。 依賴因子終止子中回文序列的 GC對含量較少。在回文序列下 游方向的序列沒有固定特征， 其AT對含量比前一種終止子低。 轉(zhuǎn)錄的基本過程轉(zhuǎn)錄的基本過程 轉(zhuǎn)錄的抗終止轉(zhuǎn)錄的抗終止 由于不同的生理要求，在轉(zhuǎn)錄過程中有時即使 遇到終止信號，仍然需要繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，于是出現(xiàn) 了抗終止現(xiàn)象 。 抗終止是細(xì)菌操縱子和噬菌體在調(diào)控回路中對 轉(zhuǎn)錄進(jìn)行的

42、調(diào)控。 抗轉(zhuǎn)錄終止的兩種方式： 1.破壞終止位點(diǎn)RNA的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)； 2.依賴于蛋白因子的轉(zhuǎn)錄抗終止。 不論原核或真核生物的rRNAs和tRNAs都是以初 級轉(zhuǎn)錄本形式被合成的，然后再加工成為成熟的RNA 分子。然而絕大數(shù)原核生物的mRNA卻不需加工，仍 為初級轉(zhuǎn)錄本的形式。相反，真核生物從斷裂基因產(chǎn) 生的mRNA要經(jīng)過復(fù)雜的加工歷程，包括去除內(nèi)含子 的剪接反應(yīng)(splicing)。 RNA的加工和成熟包括三個 方面： RNA的一般加工過程 （55端加帽和端加帽和33端加尾）端加尾） RNA的剪接作用 RNA的編輯作用 RNARNA的加工和成熟的加工和成熟 真核生物mRNA前體稱為hnRNA，

43、又稱類似DNA的 RNA(D-RNA)。由hnRNA加工為成熟的mRNA，經(jīng)歷以 下過程： 5 5 端形成特殊的帽子結(jié)構(gòu) 端形成特殊的帽子結(jié)構(gòu) 5 5 端 的 一 個 核 苷 酸 總 是端 的 一 個 核 苷 酸 總 是 7 -7 - 甲 基 鳥 核 苷 三 磷 酸甲 基 鳥 核 苷 三 磷 酸 （m7Gpppm7Gppp），），mRNA5mRNA5端的這種結(jié)構(gòu)稱為端的這種結(jié)構(gòu)稱為帽子帽子 （capcap）。）。有三類： 帽子0：m7 G 5 ppp 5X 單細(xì)胞生物（如酵母） 帽子1：m7 G 5 ppp 5Xm 多細(xì)胞生物，主要形式 帽子2：m7 G 5 ppp 5XmpYm 占1015%

44、 真核生物真核生物mRNAsmRNAs的加工的加工 帽子結(jié)構(gòu)功能：帽子結(jié)構(gòu)功能： 能被核糖體小亞基識別，促使能被核糖體小亞基識別，促使mRNAmRNA和核糖和核糖 體的結(jié)合；體的結(jié)合； m7Gpppm7Gppp結(jié)構(gòu)能有效地封閉結(jié)構(gòu)能有效地封閉mRNA 5mRNA 5末末 端，以保護(hù)端，以保護(hù)mRNAmRNA免受免受55核酸外切酶的降解，核酸外切酶的降解， 增強(qiáng)增強(qiáng)mRNAmRNA的穩(wěn)定。的穩(wěn)定。 真核生物真核生物mRNAsmRNAs的加工的加工 33端加尾：端加尾： 由一種由一種360KD360KD特異性酶切除特異性酶切除33末端一段后，經(jīng)末端一段后，經(jīng)RNARNA 末端腺甘酸轉(zhuǎn)移酶催化加上末

45、端腺甘酸轉(zhuǎn)移酶催化加上polyApolyA尾巴（約尾巴（約200200個個A A）。）。 PolyA的功能：可能在于增加mRNA的穩(wěn)定性。 真核生物真核生物mRNAsmRNAs的加工的加工 多聚腺苷酸尾巴的添加多聚腺苷酸尾巴的添加 AAUAAAAAUAAA： 準(zhǔn)確切割 加polypoly（A A） 真核生物真核生物mRNAs的加工的加工 m7Gppp鳥甘酸轉(zhuǎn)移酶鳥甘酸轉(zhuǎn)移酶 通過剪接除去由內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的序列。 鏈內(nèi)部核苷酸甲基化。 主要是m6A，可能對mRNA前體的加工起識別作用。 真核生物真核生物mRNAs的加工的加工 真核生物rRNA的成熟過程比較清楚。哺乳動物 的初級轉(zhuǎn)錄本是一條45SRN

46、A鏈，約含110個甲基， 是在轉(zhuǎn)錄中或剛剛轉(zhuǎn)錄好時加工上去的。45SRNA被 加工成18S，5.8S和28SrRNAs。 幾乎所有甲基均連接在核糖基上，在成熟的 rRNAs中，這些甲基全部被保存。甲基的存在是初級 轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)變成熟的rRNA的標(biāo)志。 18SrRNA上大約有39個甲基是原來的，有4個 是后加上去的； 28SrRNA大約有74個甲基，全部是原來的。 真核生物真核生物rRNAsrRNAs的加工的加工 成熟的途徑可能多樣，因?yàn)橹虚g產(chǎn)物的長度在不 同途徑中是不一樣的，然而最終產(chǎn)物都是一樣的。 其中兩條途徑(HeLa途徑和L途徑)切割的位置是： 18S基因的5則； 18S和5.8S基因之間的

47、間隔區(qū)(soqacer)； 5.8和28S序列之間的間隔區(qū) (5.8S序列成為一個和28S rRNA通過堿基配對 相結(jié)合的小RNA)。 E.coli7個編碼rRNA的操縱子稱為rrnA-G。它 們在染色體上不連鎖。每個操縱子均轉(zhuǎn)錄為一個RNA 前體。這些rrn操縱子的組成基本相同，均含有順序?yàn)?16S-23S-5S的三個rRNA分子。 所有rrn操縱子均有雙重啟動子： 啟動子P1：位于16S序列起始位點(diǎn)的上游約 300bp處。P1可能是主要的啟動子。 啟動子P2：在P1的右方約110bp處。 原核生物原核生物rRNAs的加工的加工 加工加工rRNArRNA的酶是的酶是RNaseRNase。 在

48、r n e-細(xì)胞中缺乏成熟的rRNAs，而是30S前 體。該前體在體外被RNase切割成成熟的rRNA分子。 16S和23SrRNAs的前體分別稱p16和p23，它 們分別比16S和23S略長一些。在初級轉(zhuǎn)錄本中，由 于p16、p23的兩端的堿基都是互補(bǔ)的，它們分別形 成很大的發(fā)夾。其發(fā)夾頂?shù)沫h(huán)非常大，分別為1600個 核苷酸和2900個核苷酸。 tRNAtRNA的加工的加工 原核或真核生物中tRNA基因往往成簇存在。在 原核生物中，至少某些tRNAs能一起形成操縱子，并 由一個啟動子轉(zhuǎn)錄成一條長的前體RNA鏈。例如，T4 噬菌體中8個tRNA基因組成一簇。 E.coli中已找到兩個tRNA基

49、因簇，二者均除 tRNA基因外尚含有其他基因。這兩個基因簇均含有 tRNATyr的基因，故命名：tyrU簇，包括4個tRNA 基因，tRNAThr，tRNAGly，和tRNATyr；tyrT簇， 則僅包含兩個相同的基因，編碼tRNATyr。 在每個tRNA基因簇中，唯一的啟動子常位于第 一個tRNA基因之前。 在最后一個tRNA基因的后面還有編碼蛋白質(zhì)的 基因。 在tyrU簇中是基因tutB(編碼延長因子EF-Tu的 兩個基因之一)。 而在tyrT簇中是編碼蛋白質(zhì)P的基因(蛋白質(zhì)P是 一種類似魚精蛋白的多肽)。 E.coliE.coli中參與中參與tRNAtRNA加工的酶有：加工的酶有： 1.

50、 1. RNasePRNaseP：它是一種內(nèi)切核酸酶，負(fù)責(zé)切割所 有tRNA分子的5端。它是一種不尋常的酶。它由蛋 白質(zhì)和RNA二者組成，分子中RNA有375個堿基長(約 130KD)；而蛋白質(zhì)組分要小得多，大約只有20KD。 在E.coli中，基因rnpA編碼其蛋白質(zhì)組成，而rnpB編 碼RNA部分。這兩個基因相隔甚遠(yuǎn)。RNA和蛋白質(zhì)這 兩個組分對RNaseP的催化活性似乎都是必須的。 2. RNaseD：它能從RNA的3端一個一個地切 去堿基，以產(chǎn)生tRNA的真正的3端(5端由 RNaseP產(chǎn)生)。 3. RNase：有外切核酸酶的活性，它能夠?qū)RNA 完全分解完。以前認(rèn)為它也與tRNA

51、加工有關(guān)，但目前 認(rèn)為它可能僅和RNA的分解代謝有關(guān)。 在細(xì)菌中有兩種tRNA前體，其區(qū)別在于其3端的 序列。 型分子有CCA三聯(lián)體在其3端。但某些噬菌 體編碼的型分子則沒有CCA序列。當(dāng)其他堿基被一 個一個從前體分子上除去后，另由稱為tRNA核苷酸轉(zhuǎn) 移酶的將CCA加到3端上去。 真核生物中可能所有的tRNA前體都屬于型， 在成熟時都需要通過酶的作用，在其3端加上CCA序 列。 RNARNA的剪接的剪接 1. 酵母酵母tRNA的剪接的剪接 RNA的剪接就是要把斷裂基因的轉(zhuǎn)錄本中的內(nèi)含 子除去。 酵母胞核400個tRNA基因中約有40個是斷裂基 因。這些基因均只有一個內(nèi)含子，位于與反密碼子的3

52、 側(cè)相隔一個核苷酸之處，長度為14至46bp。不同的 tRNA基因中的內(nèi)含子不同，無任何可識別的共同順序。 所有內(nèi)含子中均有一段反密碼子互補(bǔ)的序列，反密碼 子被配對而使反密碼臂伸長了很多。在前體中僅反密 碼臂受到影響，其他部分仍保持其正常結(jié)構(gòu)。 酵母tRNAphe中的內(nèi)含子能與其反密碼子堿基配 對，從而改變了反密碼臂的結(jié)構(gòu)。此剪切過程可分為 兩個階段： 第一步是磷酸二酯鍵的斷裂，這不需要ATP。 這一步由一種內(nèi)切核酸酶所催化。 第二步是連接反應(yīng)，需要ATP的存在，由RNA 連接酶所催化。在無ATP時，產(chǎn)生的兩個tRNA半分子 不能連接起來。 識別信號可能位于前體tRNA的外顯子中的序列 和結(jié)構(gòu)

53、。 這兩個半分子具有獨(dú)特的末端：其5端有 OH基，而3有一個2,3 -環(huán)磷酸基。當(dāng)加入 ATP時，兩個tRNA半分子先發(fā)生堿基配對，形成成 熟tRNA分子的構(gòu)象，然后由RNA連接酶形成磷酸 二酯鍵而將兩個半分子共價連接起來。 2,3-環(huán)磷酸基的存在并不限于酵母，在植 物和哺乳動物的tRNA剪接反應(yīng)中也有環(huán)狀基團(tuán)的產(chǎn) 生。在人的HeLa細(xì)胞中，RNA連接酶能將帶有 2,3-環(huán)磷酸基的RNA和另一帶有5-OH基的RNA直 接連接起來。酵母tRNA前體也可以在爪蟾的卵母細(xì) 胞核提取液中正確地被剪接。這表示剪接反應(yīng)沒有 種屬特異性。爪蟾具有能識別酵母tRNA的內(nèi)含子的 酶類。 內(nèi)含子內(nèi)含子外顯子外顯子

54、2外顯子外顯子1 內(nèi)切酶內(nèi)切酶 53 外顯子外顯子1外顯子外顯子2 35 PHO 激酶激酶 外顯子外顯子2 外顯子外顯子2 外顯子外顯子2 A-P-P 3 3 3 連接酶連接酶-AMP 連接酶連接酶 ATP 內(nèi)含子內(nèi)含子 P 外顯子外顯子2 P 外顯子外顯子1 P OH 外顯子外顯子1P P 外顯子外顯子1P OH 3 5 5 5 AMP 磷酸酯酶磷酸酯酶P 環(huán)式磷酸環(huán)式磷酸 二酯酶二酯酶 pre-tRNA 成熟tRNA 四膜蟲的兩個主要rRNAs基因的初級轉(zhuǎn)錄本稱為 35S前體RNA，較小的rRNA的序列在5側(cè)，較大的 26SrRNA序列則在3側(cè)。在編碼26SrRNA序列存在 一個單一的，短

55、的(約400bp)內(nèi)含子。 如將這個35S前體RNA在體外溫育，可以發(fā)生自 動剪接作用:內(nèi)含子從前體中被切出，先呈線性RNA片 段，后來又環(huán)化為環(huán)狀RNA。 2. rRNA的剪接的剪接自身剪接反應(yīng)自身剪接反應(yīng) 某些真菌線粒體中的內(nèi)含子有很不尋常的結(jié)構(gòu)， 這些內(nèi)含子有編碼順序，這些順序的翻譯對于該順序 所在的內(nèi)含子的剪接是必須的。 編碼細(xì)胞色素b (cytb)的box基因在僅剪去內(nèi)含 子1時，會產(chǎn)生RNA成熟酶的mRNA。當(dāng)內(nèi)含子2亦被 剪去時，才是cytb的編碼順序的開端。 box基因中的外顯子1有417bp，編碼cytb的N 端139個密碼子。內(nèi)含子1有765bp，不編碼。外顯子 2非常短，

56、僅有5個密碼子。其后是一個很長的內(nèi)含子 2，含有840bp組成的開放讀框(ORF)，有280個密碼 子，其最后一個密碼子為終止密碼子。 3. 3. 能夠編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)含子的剪接能夠編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)含子的剪接 當(dāng)將內(nèi)含子1剪去后，翻譯即從外顯子1起始， 通讀過外顯子2而進(jìn)入內(nèi)含子2的ORF，產(chǎn)生一個有 423個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(其中144個是cytb的N端 氨基酸，279個則由內(nèi)含子2編碼）稱為RNA成熟酶 (maturase)。 RNA成熟酶是特異地用來剪去內(nèi)含子2的。這樣， 這個酶促反應(yīng)便成為一個非常敏感的負(fù)反饋徑路。去 除內(nèi)含子2后，外顯子1和2即與外顯子3相連接，因而 破壞了編碼成熟酶的

57、順序。 生物體內(nèi)內(nèi)含子的主要類型：生物體內(nèi)內(nèi)含子的主要類型： GU-AGGU-AG、AU-ACAU-AC、類內(nèi)含子、類內(nèi)含子、類內(nèi)含子類內(nèi)含子 參與參與RNARNA剪接的物質(zhì)：剪接的物質(zhì)： snRNAsnRNA（核內(nèi)小分子（核內(nèi)小分子RNARNA） snRNPsnRNP（與與snRNAsnRNA結(jié)合的核蛋白）結(jié)合的核蛋白） UACUACA - AG UG U4 U5 U6 E1 E2 U1U2 UACUACA - AG UGU6 E1 E2 U1、U4、U5 mRNA內(nèi)含子的去除必須非常精確，否則即使只 差一個核苷酸，也會產(chǎn)生錯義或移碼的蛋白質(zhì)。所以 可以肯定在內(nèi)含子與外顯子連接處的核苷酸序列

58、具有 高度的相似性。 剪接連接點(diǎn)(splicing junctions)是指在切斷和 重接位點(diǎn)處的兩旁的順序。在內(nèi)含子左側(cè)的連接點(diǎn)稱 為供體(donor)，在內(nèi)含子右側(cè)的稱為受體(acceptor)。 4. mRNA4. mRNA內(nèi)含子的剪接內(nèi)含子的剪接 細(xì)胞核中的剪接連接點(diǎn)細(xì)胞核中的剪接連接點(diǎn) 正確的剪接依賴于天然前體RNA分子的完整性。 一個外源基因如果存在于病毒順序中，仍能很好地被 剪接。另外，前體RNA亦能在不同的組織，或甚至不 同物種的細(xì)胞中被正確地剪接。這都表示剪接作用是 很保守的。 一個基因的外顯子可以和另一個基因的外顯子連 接。例如SV40(猴病毒40)早期轉(zhuǎn)錄單位的第1外顯子

59、 和小鼠珠蛋白的第3外顯子相連。 剪接作用與轉(zhuǎn)錄作用、 RNA的修飾無關(guān)。例如 HeLa細(xì)胞的核提取液能夠剪接純化的RNA前體，珠蛋 白RNAs即使缺少poly(A)尾鏈，也沒有加帽，仍能正 常地被剪接。 剪接過程可分為兩個階段，核內(nèi)剪接需要ATP。 在第一階段中，內(nèi)含子左端(供體位點(diǎn))處被切斷， 形成兩個分離的RNA分子，即左外顯子和右內(nèi)含子-外 顯子。左外顯子此時為線性分子，但右內(nèi)含子-外顯子 則不然：內(nèi)含子左端(5端)以5-2鍵與在內(nèi)含子右端上 游約30堿基處的CTGAC序列(共同序列)中的A相連接， 于是形成一個套索(lariat)。 剪接過程剪接過程套索的產(chǎn)生套索的產(chǎn)生 在第二階段，

60、在受體位點(diǎn)處被切斷而將此套索狀 的內(nèi)含子剪去；同時分離的右外顯子即與左外顯子相 連接。套索然后被“脫支(debranch)”而形成一線性 內(nèi)含子。 在這種剪接機(jī)構(gòu)中，有三個很短的共同順序，即 供體點(diǎn)、受體點(diǎn)和套索分支處的序列。 供體點(diǎn) 分支點(diǎn) 受體點(diǎn) 外顯子1GGUAPyAG外顯子2 分支點(diǎn) 外顯子1GGUAPyAG外顯子2 UG G外顯子1 A PyAG外顯子 2 UG G外顯子1 A PyAG外顯子2 外顯子1G外顯子2 UG APyAG 剪接反應(yīng)需要蛋白質(zhì)和RNA參與。 參與剪接反應(yīng)的蛋白質(zhì)：有4類 A. SR蛋白家族：含有S-Ser和R-Arg二肽重復(fù)序列， 起調(diào)控作用。 結(jié)合于多聚嘧