中藥提取物及活性部位抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性探究

1、中藥提取物及活性部位抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性探究 摘要：目的篩選抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme, ACE）活性的中藥及活性部位。方法采用體外模型比較8味中藥提取物對ACE的抑制作用，并提取純化抑制ACE作用最大的中藥提取物的活性部位。結(jié)果8味中藥提取物均能抑制ACE活性。金銀花提取物70 %甲醇洗脫部位對ACE抑制率為87.3 %，主要成分為綠原酸，重結(jié)晶純度80.4 %。結(jié)論金銀花提取物對ACE具有較強的抑制效果，活性部位主要成分為綠原酸。 關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶；中藥提取物；活性部位；綠原酸 中圖分類號：R285.5文獻標

2、識碼：A文章編號：1672-979X(2009)-01-0020-04 Research on Inhibition of Traditional Chinese Medicine Extracts and Active Fraction on Angiotensin Converting Enzyme CAO Xiao-Gang1, YU Gang1, YE Xiao-Li2, WANG Li-Jun1, LI Xue-Gang1* (1. College of Pharmacy, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2. Colle

3、ge of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China) Abstract：Objective To screen the traditional Chinese medicine extracts and active fraction with inhibition on angiotensin converting enzyme (ACE). Methods An in vitro model was employed to compare the inhibiting activities of eight s

4、pecies of traditional Chinese medicine extracts on ACE, and the active fraction of the extract with the maximum inhibition was extracted and purified. Results The eight species of traditional Chinese medicine extracts all could inhibit the ACE activity. The inhibition ratio of the fraction from Loni

5、cera japonica eluted with 70 % methanol was 87.3 %, and the main ingredient was chlorogenic acid with the purity of 80.4 % after recrystallization.Conclusion The extract from Lonicera japonica has a stronger inhibition on ACE and the main ingredient of active fraction is chlorogenic acid. Key words：

6、HPLC; angiotensin converting enzyme; traditional Chinese medicine extract; active fraction; chlorogenic acid 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是哺乳動物體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓的關(guān)鍵酶之一，主要催化血管緊張素轉(zhuǎn)化為具有較強升壓作用的血管緊張素?？ㄍ衅绽╟aptopril），西拉普利（cilazapril），依那普利（enalapril），賴諾普利（lisinopri）等藥物的臨床應(yīng)用表明，抑制ACE活性能有效的降低血壓，但長期使用，耐受性差，常

7、見不良反應(yīng)，限制了臨床使用1,2。中藥來源于天然動植物，資源豐富3，篩選能有效抑制ACE活性的中藥具有重要的現(xiàn)實意義。本實驗采用體外模型4，以馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）為ACE反應(yīng)底物，產(chǎn)物馬尿酸為測定指標，卡托普利為陽性對照，研究中藥提取物及活性部位抑制ACE的效果，旨在為開發(fā)降血壓中藥提供科學依據(jù)。 1儀器與試藥 1.1儀器 LC-6AD型高效液相色譜儀（日本島津）；SPD-M20A紫外檢測儀（日本島津）；FW177型中草藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限）；YP6000N電子天平（上海精密儀器科技有限）；pH5-3C型酸度計（四川成都方舟科技有限）；Avanti

8、J-30i高速冷凍離心機（美國Beckman）；HHW-21CU-600恒溫水浴鍋（上海福瑪試驗設(shè)備有限）；TG16-W微量高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限）；U-1800型紫外-可見分光光度計（日本日立）。 1.2試藥 馬尿酸（Sigma），HHL（Sigma），卡托普利（Sigma）；綠原酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：0753-200411）；聚酰胺（中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司）；酸棗仁、何首烏、絞股藍、金銀花、苦丁茶、羅布麻、女貞子、靈芝（重慶萬和大藥房。經(jīng)鑒定，酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu

9、 ex H.F.Chow.的干燥成熟種子；何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根；絞股藍為葫蘆科植物絞股藍Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino的干燥全草；金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thumb.的干燥花蕾；苦丁茶為冬青科植物大葉冬青l(xiāng)lex latifolia Thunb.的葉；羅布麻為夾竹桃科植物羅布麻Apocynum venetum L.的干燥葉；女貞子為木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ait. 的干燥成熟果實；靈芝為多孔菌科真菌紫芝 Ganoderm

10、a sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子實體）；甲醇（色譜純，天津四友公司）；其它試劑均為分析純。 2方法與結(jié)果 2.1溶液配制 硼酸鹽緩沖液：稱取硼酸 3.1 g和氯化鈉8.8 g，450 mL蒸餾水溶解，滴加1 mol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)pH 8.3，加蒸餾水至500 mL，即得濃度為0.1 mol/L的硼酸鹽緩沖液。 磷酸鉀緩沖液：稱取K2HPO43H2O 2.15 g和KH2PO4 0.08 g，蒸餾水溶解，定容至1 000 mL，即得濃度為10 mmol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 8.0）。 HHL溶液：取HHL適量，加硼酸鹽緩沖液配成濃度為5 mmol/L 的H

11、HL溶液。 馬尿酸對照液：取馬尿酸適量，加硼酸鹽緩沖液配成濃度為0.1 mmol/L的馬尿酸對照液。 卡托普利溶液：取卡托普利適量，加硼酸鹽緩沖液配成濃度為2 mg/mL的卡托普利溶液。 2.2中藥提取物的制備 粉碎中藥材，40目過篩，準確稱取2.5 g，用工業(yè)酒精為提取溶劑，固液比16，超聲提取3次，每次20 min，合并提取液，濃縮蒸干，加硼酸鹽緩沖液定容至25 mL，溶解混勻，4 保存?zhèn)溆谩?2.3ACE的制備 參照文獻5，取兔肺組織，加磷酸鉀緩沖液清洗，切成小塊后勻漿，4 ，5 000 r/min離心30 min，棄沉淀，4 ，10 000 r/min離心上清60 min，收集上清得A

12、CE，20 保存，使用時用磷酸鉀緩沖液稀釋4倍。 2.4供試品溶液的制備 按表1順序加入溶液，37 保溫5 min后，加入5 L ACE溶液啟動反應(yīng)， 37 保溫30 min后加入1 mol/L HCl溶液300 L終止反應(yīng)，10 000 r/min離心10 min，吸取上清作為供試品溶液。 2.5馬尿酸含量測定 2.5.1色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性實驗色譜柱ODS-C18（250 mm4.6 mm,5 m），流動相甲醇-水-三氟乙酸體積比30700.01，檢測波長228 nm，流速1.0 mL/min，柱溫 25 ，進樣量20 L，馬尿酸對照品的理論塔板數(shù)為5 184。對照品及何首烏提取物反應(yīng)液色

13、譜見圖1。 A：馬尿酸對照品；B：何首烏提取物反應(yīng)液；1：馬尿酸 圖1馬尿酸對照品及何首烏HPLC圖 2.5.2方法驗證 線性：分別精密吸取0.1 mmolL-1（0.017 9 gL-1）馬尿酸對照液1，5，10，15，20，25 L進樣，按上述色譜條件測得峰面積為縱標準（Y），進樣量（g）為橫坐標（X）作圖，進行線性回歸，方程為Y5.550 3104X-98.3，r0.999 7，表明馬尿酸對照品進樣量在0.020.45 g范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。 供試品溶液的穩(wěn)定性取同一供試品溶液，在上述色譜條件下間隔4 h進樣1次，連續(xù)測定5次，RSD2.12 %。表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)

14、定。 精密度：精密吸取適宜濃度的馬尿酸對照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進樣5次，RSD1.62 %。 重復(fù)性：取同一中藥提取物，制備供試液，在上述色譜條件下測定峰面積，RSD2.79 %（n5）。 加樣回收率實驗：取6份相同體積的同一供試品溶液，1份用于測定樣品含量，其它5份分別加入0.1 mmolL-1（0.017 9 gL-1）馬尿酸對照品溶液6，7，8，9，10 L作為混合液，分別測定樣品液，混合液中馬尿酸含量并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。 2.5.3測定法取制備的供試品溶液，按上述色譜條件測定陽性對照卡托普利和8味中藥提取物空白組和試驗組的馬尿酸峰面積，結(jié)果見表3。 2.6計算ACE抑

15、制率 參照文獻6，按式（1）計算陽性對照卡托普利和8味中藥提取物對ACE的抑制率R（%），結(jié)果見表4。 式（1）中， A和B分別為空白對照組和試驗組馬尿酸的峰面積（mAUS）。 由表4可見，8味中藥提取物對ACE抑制率均大于40 %，其中金銀花提取物抑制率（88.1 %）最大，接近陽性對照卡托普利的抑制率（91.3 %）。 2.7金銀花活性部位的分離及成分鑒別 按2.2項方法制備金銀花浸膏，加蒸餾水制成含生藥0.4 g/mL溶液，加等體積的無水乙醚，提取3次，分別將乙醚部位和水部位蒸干，配成濃度為50 mg/mL的供試品溶液，測定馬尿酸含量并計算ACE抑制率，乙醚部位抑制率5.21 %，水部位

16、抑制率80.2 %。表明金銀花抑制ACE活性的有效部位為極性部位。 用100200目聚酰胺吸附，水部位依次用3倍柱體積的蒸餾水，30 %甲醇，50 %甲醇和70 %甲醇水溶液洗脫，收集各組份洗脫液，濃縮蒸干，分別配成濃度為5 mg/mL的溶液，按2.4項方法制備供試品溶液，測定馬尿酸峰面積并計算ACE抑制率，結(jié)果見表5。 由表5可見，蒸餾水和30 %甲醇部位抑制ACE作用不明顯，50 %甲醇部位對ACE有一定的抑制作用，70 %甲醇部位顯示了較強的抑制ACE的作用。 70 %甲醇部位經(jīng)真空冷凍干燥后為黃色粉末，熔程204210 ，水溶液呈酸性，使石蕊試紙變紅，可與碳酸氫納反應(yīng)產(chǎn)生CO2，紫外掃

17、描最大吸收波長320 nm，薄層色譜（TLC）紫外（365 nm）下顯藍色熒光，與綠原酸對照品Rf值及斑點顏色一致；樣品經(jīng)甲醇重結(jié)晶2次后，紅外掃描，IR/cm-1：3 359，2 972，1 686，1 639，1 601，1 289，1 189，977，818，特征峰與綠原酸對照品基本一致。由此推斷，70 %甲醇部位主要成分為綠原酸，參照文獻7測定重結(jié)晶后粉末中綠原酸含量為80.4 %；蒸餾水及30 %甲醇部位經(jīng)鑒定不含綠原酸，50 %甲醇部位含少量綠原酸。 3討論 3.1我們用高效液相色譜法測定馬尿酸含量，選用甲醇與水為流動相，甲醇比例過高，分離效果下降；甲醇比例太低，馬尿酸保留時間過長

18、；峰形有拖尾現(xiàn)象，主要是由于馬尿酸中羧基產(chǎn)生電離，在固定相表面存在雙保留機制。在流動相中加入少量三氟乙酸（約0.1%），抑制羧基的電離，可改善峰形。文獻報道4，流動相為乙腈-超純水（體積比2575，各含0.05 %三氟乙酸及0.1 %三乙胺），保留時間過短，馬尿酸與其它雜質(zhì)峰不能良好分離。我們用甲醇-水-三氟乙酸（體積比30700.01）為流動相等梯度洗脫，樣品分離效果良好，保留時間適宜。 3.2金銀花是國家確定的名貴藥材之一，主要有效成分為綠原酸。從分子結(jié)構(gòu)看，綠原酸和能夠有效抑制ACE活性的丹酚酸B5都具有鄰苯二酚酸結(jié)構(gòu)，因此推測，鄰苯二酚酸結(jié)構(gòu)可能為抑制ACE的活性基團。此外，杜仲8、茵陳蒿9等中藥材具有較強的降血壓作用，可能也與含有綠原酸類物質(zhì)有關(guān)。 參考文獻： 1肖國豪，蔡福喜. 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑的副作用J. 醫(yī)學綜述，1998，4（8）：432-435 2袁源. 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的臨床常見不良反應(yīng)J. 錦州醫(yī)學院學報，1998，19（6）：34-35 3丁林生，孟正木中藥化學M. 南京：東南大學出版社，2005：1. 4程艷霞，任，何林. 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑體外篩選模型的建立J. 華西醫(yī)學，2004，19（4）：590-591. 5高小平，徐大勇，鄧義龍，等. 從丹參中篩選血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑J. 中國中藥雜志，20