分解纖維素的微生物的分離(2.25)

1、2021/3/131 2021/3/132 目標(biāo)目標(biāo): : 1 1、知道纖維素酶的種類及作用、知道纖維素酶的種類及作用 2 2、初步掌握從土壤中分離出分解、初步掌握從土壤中分離出分解 纖維素的微生物的實(shí)驗(yàn)方法纖維素的微生物的實(shí)驗(yàn)方法 2021/3/133 一、基礎(chǔ)知識(shí)一、基礎(chǔ)知識(shí) 2021/3/134 思考:纖維素是地球上含量最豐富的多 糖類物質(zhì),植物每年產(chǎn)生的纖維素超過 70億噸,但卻不會(huì)在地球上大量的積累, 為什么? 2021/3/135 2021/3/136 在草食性動(dòng)物的消化道內(nèi),共生 有分解纖維素的微生物,其產(chǎn)生纖維 素酶而分解纖維素。 人沒有分解纖維素的能力。 草食性動(dòng)物是怎樣消化

2、纖維素的草食性動(dòng)物是怎樣消化纖維素的? 2021/3/137 下列生物能分解纖維素的是（下列生物能分解纖維素的是（ ） 人人 兔兔 牛牛 蘑菇蘑菇 纖維桿菌纖維桿菌 A. B. C. D. C 即即: :能分解能分解纖維素纖維素的微生物有各種細(xì)菌、的微生物有各種細(xì)菌、 真菌和少數(shù)放線菌真菌和少數(shù)放線菌, ,動(dòng)物則為草食性動(dòng)物。動(dòng)物則為草食性動(dòng)物。 2021/3/138 纖維二糖纖維二糖 C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 葡萄糖葡萄糖纖維素纖維素 2021/3/139 取二支取二支20mL20mL的試管的試管 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn):纖維素酶分解纖維素的實(shí)驗(yàn)纖維素酶分解纖維素的實(shí)驗(yàn) 各加入

3、一張濾紙條各加入一張濾紙條 各加入各加入pH4.8pH4.8, ,物質(zhì)量為物質(zhì)量為0.1mol/L0.1mol/L的的 醋酸醋酸鈉緩沖液醋酸醋酸鈉緩沖液11ml11ml和和10ml10ml 甲甲 乙乙 在乙試管中加入在乙試管中加入1mL1mL纖維素酶纖維素酶 兩支試管固定在錐形瓶中兩支試管固定在錐形瓶中, ,放在放在 140r/min140r/min的搖床上振蕩的搖床上振蕩1h1h 結(jié)果結(jié)果: :乙試管的濾紙條消失乙試管的濾紙條消失 討論討論: :乙試管的濾紙條為什么會(huì)消失乙試管的濾紙條為什么會(huì)消失? ?甲試管的作用是什甲試管的作用是什 么么? ? 2021/3/1310 自變量:纖維素酶的有

4、無 自變量的控制: 乙試管-1mL纖維素酶溶液 甲試管-等量的緩沖液 (不能加蒸餾水,會(huì)影響溶液的pH)。 實(shí)驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)分析:P:P2727的小實(shí)驗(yàn)是如何構(gòu)成對(duì)照的小實(shí)驗(yàn)是如何構(gòu)成對(duì)照? ? 2021/3/1311 （二）纖維素分解菌的篩選 1、篩選纖維素分解菌的方法是 _。該方法可以通 過_反應(yīng)直接篩選。 剛果紅染色法剛果紅染色法 顏色顏色 2021/3/1312 2 2、其原理是、其原理是: :剛果紅可以與纖維素剛果紅可以與纖維素 形成形成_,_,當(dāng)纖維素被當(dāng)纖維素被 _分解后分解后, ,紅色復(fù)合物無法紅色復(fù)合物無法 形成形成, ,出現(xiàn)以出現(xiàn)以_為中為中 心的心的_, ,我們可以通過我們可

5、以通過 _來篩選纖維素分解菌。來篩選纖維素分解菌。 紅色復(fù)合物紅色復(fù)合物 纖維素酶纖維素酶 纖維素分解菌纖維素分解菌 透明圈透明圈 是否產(chǎn)生透明圈是否產(chǎn)生透明圈 2021/3/1313 2021/3/1314 練一練練一練: 1.1.下列關(guān)于纖維素酶的說法下列關(guān)于纖維素酶的說法, ,錯(cuò)誤的是錯(cuò)誤的是 A. 纖維素酶是一種復(fù)合酶纖維素酶是一種復(fù)合酶,至少包括三種至少包括三種 B. 纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖 C. 纖維素酶可用于去掉植物的細(xì)胞壁纖維素酶可用于去掉植物的細(xì)胞壁 D. 葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖 2021/3/1

6、315 2.利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解 菌菌,下列說法錯(cuò)誤的是下列說法錯(cuò)誤的是 A. 剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物 B. 剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物 C. 剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物 D. 若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈,則說明已篩則說明已篩 選出了纖維素分解菌選出了纖維素分解菌 2021/3/1316 土壤取樣土壤取樣選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)梯度稀釋梯度稀釋 將樣品涂布到鑒將樣品涂布到鑒 別纖維素分解菌別纖維素分解菌 的培養(yǎng)基上的培養(yǎng)基上 挑

7、選產(chǎn)生挑選產(chǎn)生 透明圈的透明圈的 菌落菌落 2021/3/1317 生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系,在富含纖在富含纖 維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對(duì)提維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對(duì)提 高高,因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾 率要高于普通環(huán)境。率要高于普通環(huán)境。 2021/3/1318 將將濾紙濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌埋在土壤中能使纖維素分解菌 相對(duì)集中相對(duì)集中, ,實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解 菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深將濾紙埋于深 約約10cm10cm左右的土壤中左右

8、的土壤中。 2021/3/1319 2021/3/1320 2021/3/1321 培養(yǎng)基成分分析培養(yǎng)基成分分析 培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成 提供主要營養(yǎng)物質(zhì)提供主要營養(yǎng)物質(zhì) 纖維素粉纖維素粉 5g碳源（能源）碳源（能源） NaNO3 1g氮源、無機(jī)鹽氮源、無機(jī)鹽 KCl 0.5g ,Na2HPO47H2O 1.2g KH2PO4 0.9g, MgSO4 7H2O 0.5g 無機(jī)鹽無機(jī)鹽 酵母膏酵母膏 0.5g 生長因子、碳源、生長因子、碳源、 氮源氮源 水解酪素水解酪素 0.5g氮素、生長因子氮素、生長因子 溶解后溶解后,蒸餾水定容至蒸餾水定容至 1000mL 水水 2021/3/1322 提示提

9、示: :可用可用培養(yǎng)基與之對(duì)照培養(yǎng)基與之對(duì)照, , 或者將或者將。 2021/3/1323 本實(shí)驗(yàn)的流程與課題本實(shí)驗(yàn)的流程與課題2 2中的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同中的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同? ? 課題課題2 2是將土樣制成的是將土樣制成的菌懸液菌懸液直直 接涂布接涂布在以尿素為唯一氮源的在以尿素為唯一氮源的選擇性選擇性 培養(yǎng)基培養(yǎng)基上上, ,直接分離直接分離得到菌落。得到菌落。 本課題本課題通過通過選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng), ,使纖維素使纖維素 分解菌得到分解菌得到增殖增殖后后, ,再再將菌液將菌液涂布涂布在在 鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基上上。其他步驟基本一致。其他步驟基本一致。 思考思考: : 2021/3/132

10、4 2021/3/1325 比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目分解尿素的細(xì)菌分解尿素的細(xì)菌纖維素分解菌纖維素分解菌 選選 擇擇 培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基 原理原理 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 類型類型 目的目的 鑒鑒 定定 培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基 原理原理 現(xiàn)象現(xiàn)象 方法方法 將細(xì)菌涂布在只有將細(xì)菌涂布在只有 尿素做氮源的選擇尿素做氮源的選擇 培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上 將細(xì)菌培養(yǎng)在只有將細(xì)菌培養(yǎng)在只有 纖維素粉做碳源的纖維素粉做碳源的 選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)基上 固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基 篩選菌株篩選菌株選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng),增加濃度增加濃度 2021/3/1326 101102103104 105106 2021/3/1327 20

11、21/3/1328 培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)提供的主要營養(yǎng)物質(zhì) CMC-Na 510g 碳源碳源 酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生長因子碳源、氮源、生長因子 KH2PO4 0.25g無機(jī)鹽無機(jī)鹽 土豆汁土豆汁 100mL碳源、生長因子碳源、生長因子 瓊脂瓊脂 15g凝固劑凝固劑 上述物質(zhì)溶解后上述物質(zhì)溶解后,加蒸餾加蒸餾 水定容至水定容至1000mL 水水 鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基 (水溶性羧甲基纖維素鈉水溶性羧甲基纖維素鈉) 2021/3/1329 2021/3/1330 2021/3/1331 方法一中方法一中NaCl溶液的作用溶液的作用? 思考思考:

12、 漂洗作用漂洗作用,洗去與纖維素結(jié)合不洗去與纖維素結(jié)合不 牢的剛果紅牢的剛果紅,以免出現(xiàn)的透明圈不夠以免出現(xiàn)的透明圈不夠 清晰。清晰。 2021/3/1332 比較比較 項(xiàng)目項(xiàng)目 分解尿素的細(xì)菌分解尿素的細(xì)菌纖維素分解菌纖維素分解菌 選選 擇擇 培培 養(yǎng)養(yǎng) 原理原理 培養(yǎng)基類培養(yǎng)基類 型型 目的目的 鑒鑒 定定 培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基 原原 理理 現(xiàn)現(xiàn) 象象 方方 法法 在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng) 中中, ,細(xì)菌合成的脲酶將尿素細(xì)菌合成的脲酶將尿素 分解成了氨分解成了氨, ,氨會(huì)使培養(yǎng)基氨會(huì)使培養(yǎng)基 的堿性增強(qiáng)的堿性增強(qiáng), ,pHpH升高。在培升高。在培 養(yǎng)基中加入酚紅指示劑養(yǎng)

13、基中加入酚紅指示劑, ,如如 果果pHpH升高指示劑會(huì)變紅升高指示劑會(huì)變紅 剛果紅可以與纖維素形成剛果紅可以與纖維素形成 紅色復(fù)合物紅色復(fù)合物,當(dāng)纖維素被當(dāng)纖維素被 纖維素酶催化分解后紅色纖維素酶催化分解后紅色 復(fù)合物無法形成復(fù)合物無法形成,培養(yǎng)基培養(yǎng)基 上就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解上就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解 菌為中心的透明圈菌為中心的透明圈 觀察菌落周圍是否有紅色的觀察菌落周圍是否有紅色的 環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌 觀察菌落周圍是否出現(xiàn)觀察菌落周圍是否出現(xiàn) 透明圈來篩選纖維素分解菌透明圈來篩選纖維素分解菌 脲酶檢測(cè)法脲酶檢測(cè)法剛果紅染色法剛果紅染色法 2021/3/1333 2

14、021/3/1334 四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 1.1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選 出菌落出菌落 對(duì)照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明對(duì)照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明 培養(yǎng)基制作合格。培養(yǎng)基制作合格。 如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落,則說明可能獲得了則說明可能獲得了 分解纖維素的微生物。分解纖維素的微生物。 2.2.分離的結(jié)果是否一致分離的結(jié)果是否一致 由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌 的數(shù)量的數(shù)量,因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所

15、取土因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土 樣的環(huán)境不同樣的環(huán)境不同,不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不 同的分離結(jié)果。同的分離結(jié)果。 2021/3/1335 為了確定分離得到的是纖維素分解菌為了確定分離得到的是纖維素分解菌, , 還需要進(jìn)行還需要進(jìn)行_實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn), ,纖維素酶的纖維素酶的 發(fā)酵方法有發(fā)酵方法有_ _ 發(fā)酵和發(fā)酵和_ _ 發(fā)酵。纖發(fā)酵。纖 維素酶測(cè)定方法是對(duì)纖維素酶分解濾紙等纖維素酶測(cè)定方法是對(duì)纖維素酶分解濾紙等纖 維素所產(chǎn)生的維素所產(chǎn)生的_ _ 含量進(jìn)行定量測(cè)定。含量進(jìn)行定量測(cè)定。 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶 液體液體 固體固體 五、課題延

16、伸五、課題延伸 2021/3/1336 分解分解 纖維纖維 素的素的 微生微生 物的物的 分離分離 纖維素酶纖維素酶種類、作用、催化活力種類、作用、催化活力 剛果紅染色剛果紅染色篩選原理篩選原理 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 設(shè)設(shè) 計(jì)計(jì) 土壤取樣土壤取樣 選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng) 涂布培養(yǎng)涂布培養(yǎng) 純化培養(yǎng)純化培養(yǎng) 前置染色法前置染色法 后置染色法后置染色法 富含纖維素土壤富含纖維素土壤 增大分解菌含量增大分解菌含量 染色鑒別染色鑒別 分離出分解菌分離出分解菌 課堂總結(jié)課堂總結(jié) 2021/3/1337 練一練練一練 1、在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌、在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌,符合下列哪一生物學(xué)符合下

17、列哪一生物學(xué) 觀點(diǎn)觀點(diǎn)?（ ） A、生物結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)的觀點(diǎn)、生物結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)的觀點(diǎn) B、生物結(jié)構(gòu)與功能整體性觀點(diǎn)、生物結(jié)構(gòu)與功能整體性觀點(diǎn) C、生物與環(huán)境相適應(yīng)的觀點(diǎn)、生物與環(huán)境相適應(yīng)的觀點(diǎn) D、生物發(fā)展進(jìn)化的觀點(diǎn)、生物發(fā)展進(jìn)化的觀點(diǎn) 2、從土壤中分離獲得某種微生物的步驟是（、從土壤中分離獲得某種微生物的步驟是（ ） 土壤取樣土壤取樣 梯度稀釋梯度稀釋 選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng) 菌懸液涂布平板菌懸液涂布平板 挑選出單個(gè)菌落挑選出單個(gè)菌落 A、 B、 C、 D、 3、有關(guān)選擇培養(yǎng)正確的敘述是（、有關(guān)選擇培養(yǎng)正確的敘述是（ ） A、可以增加纖維素分解菌的濃度、可以增加纖維素分解菌的濃度 B、可以減

18、少纖維素分解菌的濃度、可以減少纖維素分解菌的濃度 C、所用培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基、所用培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基 D、所用培養(yǎng)基是平板培養(yǎng)基、所用培養(yǎng)基是平板培養(yǎng)基 C B A 2021/3/1338 1111年年39.39.【生物生物 選修選修1:1:生物技術(shù)實(shí)踐（生物技術(shù)實(shí)踐（1515分）分） 有些細(xì)菌可分解原油有些細(xì)菌可分解原油, ,從而消除由原油泄漏造成從而消除由原油泄漏造成 的土壤污染。某同學(xué)欲從污染的土壤中篩選出高的土壤污染。某同學(xué)欲從污染的土壤中篩選出高 效降解原油的菌株?；卮饐栴}效降解原油的菌株?；卮饐栴}: : 在篩選過程中在篩選過程中, ,應(yīng)將土壤樣品稀釋液接種于以應(yīng)將土壤樣品稀釋液接種于以 為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上, , 從功能上講從功能上講, ,該培養(yǎng)基屬于該培養(yǎng)基屬于 培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。 純化菌種時(shí)純化菌種時(shí), ,為了得到單菌落為了得到單菌落, ,常采用的接種方常采用的接種方 法有兩種法有兩種, ,即即 和和 。 石油石油 選擇選擇 平板劃線法平板