基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用

1、最新 精品 Word 歡迎下載 可修改基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用一、 課程設(shè)計(jì)目的 了解工業(yè)生產(chǎn)中的新型育種技術(shù)并比較不同育種技術(shù)的優(yōu)勢；學(xué)習(xí)理解基因工程育種技術(shù)及其操作原理；研究基因工程育種技術(shù)在人干擾素生產(chǎn)中的創(chuàng)新。二、 課程設(shè)計(jì)題目描述與要求本文介紹一種二十世紀(jì)七十年代發(fā)展起來的一種新型生物技術(shù)基因工程，介紹其在育種中的應(yīng)用。文中重點(diǎn)介紹了基因工程育種的一般步驟，以及近年來出現(xiàn)的運(yùn)用基因工程進(jìn)行定向育種的主要新技術(shù)：基因的定點(diǎn)突變，易錯(cuò)PCR，DAN重排及基因組重排。之后，應(yīng)用基因工程育種技術(shù)重組大腸桿菌BL21(pBAI)生產(chǎn)人干擾素a2b, 通過優(yōu)化補(bǔ)料分批培養(yǎng)時(shí)葡萄

2、糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表達(dá)量和表達(dá)速率。不同的葡萄糖流加方式有各自的優(yōu)點(diǎn),采用恒速流加葡萄糖的方式,hIFNa2b的表達(dá)量達(dá)到6 540 mg/L,高于目前已知文獻(xiàn)中hIFNa2b的最高表達(dá)量5 200 mg/L。三、課程設(shè)計(jì)報(bào)告內(nèi)容引言基因工程是二十世紀(jì)七十年代發(fā)展起來的一種新型生物技術(shù)，其發(fā)展從根本上改變了生物技術(shù)的研究和開發(fā)應(yīng)用模式。1972年美國的Berg和Jackson等人將猿猴病毒基因組SV 40DNA、噬菌體基因以及大腸桿菌半乳糖操縱子在體外重組獲得成功。翌年，美國斯坦佛大學(xué)的Cohen和Boyer等人在體外構(gòu)建出含有四環(huán)素和鏈霉素連個(gè)抗性基因的重組質(zhì)粒分子，將之導(dǎo)

3、入大腸桿菌后，該重組質(zhì)粒得以穩(wěn)定復(fù)制，并賦予受體細(xì)胞相應(yīng)的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的誕生。在二十世紀(jì)八十年代以來，隨著大批大批成果的出現(xiàn)及應(yīng)用，基因工程帶來了一場新的革命。利用這些技術(shù)，可以直接地、有針對性地在DNA分子水平上改造生物的遺傳性狀。通過轉(zhuǎn)入外源基因，微生物和動(dòng)、植物細(xì)胞可以產(chǎn)生出自身原來沒有的蛋白質(zhì)。同樣，利用重組DNA技術(shù)，也可以使一些原來存在量極低但有重要工業(yè)或醫(yī)學(xué)用途的小分子(抗生素)或蛋白質(zhì)之外的大分子物質(zhì)得以大量生產(chǎn)。特別是隨著重組DNA技術(shù)的完善和發(fā)展，以基因水平為核心的現(xiàn)代分子定向育種技術(shù)越來越受到工業(yè)微生物育種學(xué)家的關(guān)注，并展示了良好的應(yīng)用前景。1、基因工程

4、育種基因工程育種是在基因水平上，運(yùn)用人為方法將所需的某一供體生物的遺傳物質(zhì)提取出來，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，與載體連接，然后導(dǎo)入另一細(xì)胞，使外源遺傳物質(zhì)在其中進(jìn)行正常復(fù)制和表達(dá)引，與前幾種育種技術(shù)相比，基因工程育種技術(shù)是人們在分子生物學(xué)指導(dǎo)下的一種自覺的、能像工程一樣可預(yù)先設(shè)計(jì)和控制的育種新技術(shù)，它可實(shí)現(xiàn)超遠(yuǎn)緣雜交，因而是最新最有前途的一種育種新技術(shù)?；蚬こ碳夹g(shù)的全部過程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段與基因載體的體外連接、外源基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞和目標(biāo)基因的表達(dá)等主要環(huán)節(jié)。1.1 基因工程育種的一般步驟是：(1)目的基因的獲得：一般通過化學(xué)合成法、物理化學(xué)法(包括密度

5、梯度離心法、單鏈酶法、分子雜交法)、鳥槍無性繁殖法、酶促合成法(逆轉(zhuǎn)錄法)、Norther雜交分析法、cDNA文庫篩選法、雜交篩選法、編碼序列富集(磁珠捕獲)、產(chǎn)物導(dǎo)向法、Nod連接片段篩選法、外顯子捕獲法及外顯子擴(kuò)增法、剪接位點(diǎn)篩選法、作圖克隆法、雜交細(xì)胞克隆法、消減雜交法、相同序列克隆法、差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR法、顯微克隆與微克隆法和插入誘變法等方法獲得目的基因。(2)載體的選擇：基因工程載體主要是質(zhì)粒和病毒，載體一般為環(huán)狀DNA，其要求有自我復(fù)制能力、分子小、拷貝數(shù)多、易連接和易篩選等特點(diǎn)。(3)重組子體外構(gòu)建：主要方法有粘性末端連接法、平端連接法、人工接頭連接法和同聚物加尾連接法。(4)

6、重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞：其主要途徑有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射、電穿孔法、快速冷凍法和炭化纖維介導(dǎo)法等。(5)重組體篩選和鑒定：以合適的篩選方法選擇具有最佳性能的突變重組子，重組體篩選和鑒定主要通過表型法、DNA鑒定篩選法，選擇性載體篩選法、分子雜交選擇法、免疫學(xué)方法和mRNA翻譯檢測法等方法來實(shí)現(xiàn)。1.2 運(yùn)用基因工程進(jìn)行定向育種的新技術(shù)12.1 基因的定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變(sitespecific mutagenesis或sitedirected mutagenesis)是指在目的DNA片斷(例如：一個(gè)基因)的指定位點(diǎn)引入特定的堿基對的技術(shù)，其包括寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、盒式誘變以及以PCR為基礎(chǔ)的定

7、點(diǎn)突變。近十年來，定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了長足的發(fā)展，并且在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了很多新技術(shù)。例如：重疊延伸PCR法(Overlap Extension PCR簡稱EOPCR)、大引物PCR法(Megaprimer PCR)、一步重疊延伸PCR(OnestepOverlap Extension PCR，簡稱OOEPCR)、單管大引物PCR(Singletube Megaprimer PCR)、快速定點(diǎn)誘變法、多位點(diǎn)環(huán)狀誘變法TAMS(Targeted Amplification of Mutant Strand)定點(diǎn)誘變技術(shù)。在這些技術(shù)中，單管大引物PCRTAMS定點(diǎn)誘變技術(shù)最為簡單和適用，并得到廣泛的應(yīng)

8、用。單管大引物PCR Picard等和HKe等分別建立了單管大引物PCR法。該法省去了傳統(tǒng)上以PCR為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變中第1輪PCR產(chǎn)物的純化過程，實(shí)現(xiàn)了在同一管中先后進(jìn)行2輪PCR反應(yīng)的定點(diǎn)突變目標(biāo)。在上述2組研究者建立的方法中，后者提出的方案更加巧妙、簡單(圖1)。其只需設(shè)計(jì)Tm值不同的2個(gè)側(cè)引物，在第1輪PCR反應(yīng)中用Tm值低的側(cè)引物(F1)和誘變引物，在較低的退火溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生大引物；然后再加入Tm值高的側(cè)引物(F2)，在較高的退火溫度下進(jìn)行第2輪反應(yīng)，擴(kuò)增出含突變位點(diǎn)的整個(gè)DNA產(chǎn)物。Ke等在此方法中還提出了2條更為細(xì)致、有效的改進(jìn)措施，使PCR產(chǎn)物的最終產(chǎn)量和純度均有所提高

9、。這2條改進(jìn)措施為：(1)在第1輪PCR反應(yīng)中，誘變引物的濃度僅為側(cè)引物的1，以減少誘變引物在第2輪PCR中的干擾作用；(2)在第l輪PCR反應(yīng)后，亦即第2輪PCR反應(yīng)前，增加5個(gè)循環(huán)的不對稱擴(kuò)增，這有利于提高其后的擴(kuò)增效率。這種單管大引物法的優(yōu)點(diǎn)是：實(shí)現(xiàn)了在同一管中先后進(jìn)行2輪PCR反應(yīng)，大幅簡化了操作步驟，并且省時(shí)、省力。在對多個(gè)樣品進(jìn)行操作時(shí)，該方法的優(yōu)點(diǎn)更為突出。在以PCR為基礎(chǔ)的誘變方法中，該法是引入單位點(diǎn)突變最簡單、最經(jīng)濟(jì)的方法。圖1 單管大引物PCR過程Figure 1 The process of Singletube megaprimer PCRTAMS定點(diǎn)誘變技術(shù) 2021

10、年，Young等報(bào)道了一種有目的地?cái)U(kuò)增突變鏈的定點(diǎn)誘變技術(shù)(Targeted amplification of mutant strand，TAMS)。該技術(shù)能夠一次引入多個(gè)位點(diǎn)的突變，并且能夠有目的地?cái)U(kuò)增突變鏈，從而使突變效率幾乎達(dá)到100。該方法主要分3步(圖2)：(1)線性單鏈DNA模板的制備：通過線性PCR制備單鏈DNA模板；(2)突變鏈的合成：該步驟需用2個(gè)錨錠引物(即Anchor5和Anchor3)和多個(gè)誘變引物(Mut1和Mut2)。(3)有目的地?cái)U(kuò)增突變鏈：設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(PCR5和PCR3)，使其3端堿基分別與錨錠引物引入的突變堿基配對，擴(kuò)增引物只能退火到突變鏈而不是親本鏈。在

11、多位點(diǎn)的突變試驗(yàn)中，TAMS誘變技術(shù)應(yīng)該是首選方法。定點(diǎn)突變技術(shù)已在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能改造上取得了很大成功。例如，利用定點(diǎn)突變改變酪氨酰-tRNA合成酶的活性中心，從而使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中加入二硫鍵，顯著提高了該酶的穩(wěn)定性。圖2 TAMS定點(diǎn)誘變技術(shù)原理和操作過程Figure 2 The principle and operation process of TAMS12.2 易錯(cuò)PCRDNA聚合酶在進(jìn)行擴(kuò)增目的DNA時(shí)會(huì)以一定的頻率發(fā)生堿基錯(cuò)配，這一現(xiàn)象恰好提供了一種對特定基因進(jìn)行隨機(jī)誘變的可能方法。利用PCR過程中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配進(jìn)行特定基因隨機(jī)誘變的技術(shù)就稱為易錯(cuò)PCR

12、(Error_prone PCR，簡稱EPPCR)。此方法的原理與操作如圖3，其操作過程是在Taq DNA聚合酶催化的PCR反應(yīng)體系中，利用Mn替代天然的輔助因子Mg，使Taq DNA聚合酶缺乏校對活性，同時(shí)使反應(yīng)體系中各種dNTP的比例失衡，因此導(dǎo)致堿基的錯(cuò)配率大大增加，通常約為0.1。另外，還可以在該反應(yīng)體系中加入dITP等三磷酸脫氧核苷類似物來控制錯(cuò)配水平。這種方法可以將錯(cuò)配率最大提高至20?？讟s等利用易錯(cuò)PCR使D-海因酶對底物的水解活性提高了2.4倍；黃瑛等用易錯(cuò)PCR使短小芽孢桿菌YZ02脂肪酶活性提高了1.31倍，Km值由8.24mmol/L降低至7.717mmol/L，在pH8

13、.0時(shí)的穩(wěn)定性也較野生型脂肪酶有所提高。圖3 易錯(cuò)PCR示意圖Figure 3 Sketch of error-prone PCR12.3 DAN重排DNA重排(DNA shufling)技術(shù)是一種利用重組文庫的體外定向進(jìn)化技術(shù)，Stemmer于1993年首先提出。DNA重排的基本原理是首先將同源基因(單一基因的突變體或基因家族)切成隨機(jī)大小的DAN片段，然后進(jìn)行PCR重聚。那些帶有同源性和核苷酸序列差異的隨機(jī)DAN片段在每一輪循環(huán)中互為引物和模板，經(jīng)過多次PCR循環(huán)后能迅速產(chǎn)生大量的重組DNA，從而創(chuàng)造出新基因。其操作的原理和步驟如圖4。圖4 DNA重排的原理及操作步驟Figure 4 Th

14、e principle and operation process of DNA shufflingZhao等在此基礎(chǔ)上發(fā)明了一種更加簡化交叉延伸程序( STEP)(圖5)。此技術(shù)是在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中以2個(gè)以上相關(guān)的DNA片段為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物先在一個(gè)模板鏈上延伸，隨之進(jìn)行多輪變性、短暫復(fù)性(延伸)過程。在每一輪PCR循環(huán)中，那些部分延伸的片段可以隨機(jī)地與含不同突變的模板進(jìn)行雜交，使延伸繼續(xù)，并由于模板轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復(fù)進(jìn)行直到獲得全長基因片段，重組的程度可以通過調(diào)整時(shí)間和溫度來控制。此方法省去了將DNA酶切成片段這一步，致使DNA重排方法進(jìn)一步簡化。圖5 交叉延

15、伸程序的基本過程Figure 5 Basic procedure of staggered extension process近幾年來，提高DNA重排技術(shù)捕獲變異的能力一直是研究人員努力的方向。Ostermie等以核酸外切酶代替DNaseI對靶序列進(jìn)行消化，發(fā)明了遞減法建立雜交酶技術(shù)（ITCHY)，使得非同源性序列間也能發(fā)生重排，擴(kuò)大了該技術(shù)的用途。Hiraga等開發(fā)的SISDC技術(shù)在組件內(nèi)部引入了限制性內(nèi)切酶識別標(biāo)記，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶代替DNase I產(chǎn)生重排片段。Bergquist等開發(fā)的DOGS技術(shù)則是根據(jù)保守模體區(qū)序列特征設(shè)計(jì)簡并引物，擴(kuò)增出保守同源區(qū)后再用重排操作生成突變富集體。

16、由于此方法是在突變耐受的保守區(qū)直接增加轉(zhuǎn)轍組的幾率，所以其產(chǎn)生的突變頻率大大增加。DNA重排的最大特點(diǎn)是在反復(fù)突變過程中引進(jìn)了重組這一自然進(jìn)化中最重要的過程，而且其對可操作的靶序列的長度沒有任何要求，可以達(dá)到幾萬kb。通過多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導(dǎo)致功能的明顯提高，同時(shí)還打破了傳統(tǒng)物種之間由于生殖隔離導(dǎo)致不能重組的界限。12.4 基因組重排基因組重排(genome shufling)技術(shù)是受DNA重排的啟發(fā)，于2l世紀(jì)出現(xiàn)的全基因組改組技術(shù)。這種技術(shù)將分子定向進(jìn)化的對象從單個(gè)基因擴(kuò)展到整個(gè)基因組，可以在更為廣泛的范圍內(nèi)對菌種的目的性狀進(jìn)行優(yōu)化組合。首先，利用經(jīng)典的誘變育種技術(shù)獲

17、得含有目標(biāo)性狀的基因組庫，然后利用原生質(zhì)體融合技術(shù)將這些發(fā)生正向突變的菌株的全基因組進(jìn)行多輪隨機(jī)重組，從而快速篩選表型得到較大改進(jìn)的雜交菌種。該技術(shù)巧妙地采用了多輪循環(huán)原生質(zhì)體融合技術(shù)，將各種親本制成原生質(zhì)體-融合-再生-再制成原生質(zhì)體-融合-再生)，即遞歸原生質(zhì)體融合(recursive protoplast fusion)的方法。Zhang等于2021年首次報(bào)道應(yīng)用基因組重排方法快速地使弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)產(chǎn)生泰樂菌素的能力得到提高。該方法以營養(yǎng)缺陷型為出發(fā)菌株，僅用了1年時(shí)間，通過兩輪基因組改組就從24 000株菌株中分離到2組共14株泰樂菌素高產(chǎn)菌株，

18、其泰樂菌素產(chǎn)量高于通過經(jīng)典誘變育種方法所篩得的生產(chǎn)菌株SF21，而后者(SF21)是用經(jīng)典誘變育種方法在長達(dá)20年的時(shí)間中先后篩選過約1 000 000個(gè)菌株后才獲得的。由此可見，此技術(shù)大大減少了工作量，并縮短了篩選時(shí)間。四川抗菌素工業(yè)研究所的徐波等以產(chǎn)量性狀為標(biāo)記特征，應(yīng)用基因組重排的方法在一年之內(nèi)使替考拉寧產(chǎn)量提高了65.3。除上述技術(shù)外，近年來又出現(xiàn)了一些新技術(shù)，例如：部分基因片段改組、單鏈DNA家族改組(SSDNAs)、簡并引物基因改組(DOGS)、瞬時(shí)模板的隨機(jī)嵌合、單向引物的隨機(jī)重組、自我復(fù)制、體外隨機(jī)引發(fā)重組(RPR)、酶法體外隨機(jī)-定位誘變(randomsitedirected

19、 mutagenesis)、交錯(cuò)延伸剪接PCR等。2、基因工程育種技術(shù)在大腸桿菌種的應(yīng)用大腸桿菌是迄今為止研究的最為詳盡的原核細(xì)菌，其K-12MG1655株的4 000多kb的染色體DNA已測序完畢，全基因共含有4 405個(gè)開放閱讀框，其中大部分基因的生物功能已被鑒定。作為一種成熟的基因克隆表達(dá)受體，大腸桿菌被廣泛用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，如基因的分離擴(kuò)增、DNA序列分析、基因的表達(dá)產(chǎn)物功能鑒定等。由于大腸桿菌繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制，大腸桿菌的分子遺傳學(xué)背景已相當(dāng)明了，不斷完善的基因操作技術(shù)可將大腸桿菌構(gòu)建成為用于異源蛋白生產(chǎn)的分子工廠。因此，利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌工程菌，以規(guī)

20、模化生產(chǎn)真核生物基因尤其是人類基因的表達(dá)產(chǎn)物，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。現(xiàn)在已有100多種異源蛋白通過大腸桿菌基因工程菌實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，其中包括一些結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜的人體蛋白，如HAS、pro-UK、MT、M-CSF及Hb等。工業(yè)中常用于生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白如人胰島素、人生長激素、人干擾素、人白細(xì)胞介素和抗體。以下以生產(chǎn)人干擾素為例介紹其應(yīng)用。人干擾素a2b (Human Interferona2b,hIFNa2b)是由165個(gè)氨基酸組成的多肽,具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、修復(fù)DNA結(jié)構(gòu)損傷等作用。hIFNa2b在臨床上廣泛應(yīng)用,對肝炎、呼吸道病毒感染、皰疹病毒感染等均具有治療作用。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長快速

21、、發(fā)酵成本低、表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn),是生產(chǎn)外源蛋白的理想表達(dá)體系。在大腸桿菌溫度誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白的發(fā)酵過程中,如何控制升溫誘導(dǎo)后菌體的生長,提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率,是實(shí)現(xiàn)高密度高表達(dá)的關(guān)鍵。本文采用大腸桿菌BL21(pBAI)表達(dá)hIFNa2b,其表達(dá)通過溫控型PL啟動(dòng)子調(diào)控。考察了補(bǔ)料方式對hIFNa2b生產(chǎn)速率的影響,hIFNa2b表達(dá)水平達(dá)到6 540 mg/L。2.1 材料與方法2.1.1材料菌株宿主菌E. coli BL21(DE3)BF-dcm ompT hsdS (r-Bm-B) gal(DE3),重組質(zhì)粒為pBAI,帶有氨芐青霉素耐藥性標(biāo)記,hIFNa2b基因表達(dá)受PL啟動(dòng)子和質(zhì)粒c

22、I857編碼的蛋白調(diào)控。培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L,酵母抽提物5 g/L,NaCl 10 g/L),滅菌后加入100 mg/L氨芐青霉素鈉。分批發(fā)酵培養(yǎng)基為含葡萄糖5 g/L的LB培養(yǎng)基。未特別注明的補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)基均為含葡萄糖5 g/L的2LB培養(yǎng)基(蛋白胨20 g/L,酵母抽提物10 g/L,NaCl 10 g/L),補(bǔ)料液為400 g/L的葡萄糖。培養(yǎng)基配制所用蛋白胨和酵母抽提物均為Oxoid產(chǎn)品,其余試劑為國產(chǎn)分析純,采用去離子水配制。2.1.2培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)從-20C保藏的甘油管中取出1ml菌液,接入裝有30 ml種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶,于搖床200

23、r/min,30C下培養(yǎng)10 h,為一級種子;將一級種子以1.5%的接種量轉(zhuǎn)接至裝有70 ml LB培養(yǎng)基的500 ml錐形瓶中,相同條件培養(yǎng)9 h,為二級種子。發(fā)酵罐培養(yǎng)將二級種子以6%的接種量接入5 L發(fā)酵罐(RIBE-5型)中。培養(yǎng)液裝量為2.5 L，生長階段控制溫度30C,表達(dá)階段控制溫度42C，發(fā)酵過程中控制pH為7.0,通氣量4 L/min，初始攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min,發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)速逐漸提高以維持溶氧大于20%。補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程中,初始葡萄糖耗盡后采用3種不同的葡萄糖流加方式，即恒pH流加、恒速流加、恒比供應(yīng)速率流加。恒pH方式為當(dāng)pH超過7.0時(shí)自動(dòng)補(bǔ)入葡萄糖；恒速流加以5

24、.4 g/(Lh)的速率流加葡萄糖；恒比供應(yīng)速率(QG)為0.27 g/(gh)，每小時(shí)根據(jù)菌體濃度調(diào)整葡萄糖的流加速率。2.1.3測定方法菌體濃度測定采用濁度法,測定波長600 nm處的光密度(OD600),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌體干重。葡萄糖測定采用葡萄糖測定試劑盒(上?？菩郎锛夹g(shù)研究所)測定。乙酸測定采用氣相色譜法5。hIFNa2b的電泳測定采用三(羥甲基)甲基甘氨酸(=0.15)-SDS-聚丙烯酰胺三層膠系統(tǒng)分離目的蛋白6,凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色,用圖像分析系統(tǒng)(Smart View analysis program,上海復(fù)日科技有限公司)定量。取發(fā)酵液于12 000 r/min,4C下離

25、心10 min,得到的菌體用Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L, pH 7.0,4C)洗滌,然后溶于上樣緩沖液中12mmol/L、pH 6.8 Tris-HCl,甘油(=0.05),SDS(7.5 g/L),巰基乙醇(=0.02),溴酚蘭(0.5 g/L。2.2結(jié)果與討論2.2.1分批發(fā)酵在5 L罐中分批培養(yǎng),結(jié)果見圖6和表1。培養(yǎng)2.5 h升溫誘導(dǎo),此時(shí)菌體處于對數(shù)生長期,升溫對于菌體生長的影響并不顯著,表達(dá)初期菌體比生長速率較升溫前略有下降。分批發(fā)酵中葡萄糖耗完時(shí),乙酸積累達(dá)到最大值1.1 g/L。hIFNa2b的表達(dá)水平達(dá)到749 mg/L,是相同培養(yǎng)基條件下?lián)u瓶培養(yǎng)的2.9倍。

26、誘導(dǎo)后1 h,hIFNa2b比生產(chǎn)速率為162 mg/(gh),生產(chǎn)速率為275 mg/(Lh)；誘導(dǎo)后期比生產(chǎn)速率下降至95 mg/(gh),但由于菌體濃度增大,生產(chǎn)速率達(dá)到363 mg/(Lh)。圖6分批培養(yǎng)時(shí)菌體()、葡萄糖()、乙酸()及hIFNa2b()的變化曲線Fig.6Profiles of dry cell weight (), residual glucose(), acetic acid () and hIFNa2b () in batch cultivation2.2.2 葡萄糖流加對于hIFNa2b生產(chǎn)水平的影響要獲得hIFNa2b的高體積表達(dá)水平,則需維持較高的比生產(chǎn)

27、速率,并且增大菌體密度,流加葡萄糖是一種很好的選擇。恒pH流加葡萄糖培養(yǎng)4 h后升溫誘導(dǎo)表達(dá)hIFNa2b,此時(shí)殘?zhí)菨舛葹?.9 g/L。6 h時(shí)初始葡萄糖耗盡,溶氧迅速回升,開始用恒pH法補(bǔ)加葡萄糖,即pH高于設(shè)定值時(shí)蠕動(dòng)泵自動(dòng)加入葡萄糖溶液1 s。此補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)記為FB1,結(jié)果見圖7和表1。升溫誘導(dǎo)后,菌體生長明顯減慢,升溫后2 h菌體的比生長速率為0.425 h-1,與升溫前的0.710 h-1相差很大,這與誘導(dǎo)時(shí)環(huán)境和細(xì)胞生理狀態(tài)有關(guān)。與分批發(fā)酵相比較,升溫誘導(dǎo)時(shí)(2.5 h)菌體處于對數(shù)生長前期,培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)充分,而本實(shí)驗(yàn)中于4 h升溫誘導(dǎo)時(shí)菌體處于對數(shù)生長后期,培養(yǎng)基中的營

28、養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)被大量消耗,難以維持對數(shù)期的比生長速率。進(jìn)入恒pH補(bǔ)料階段后,菌體比生長速率下降的趨勢進(jìn)一步明顯,發(fā)酵末期菌體比生長速率僅為0.025 h-1。圖7恒pH補(bǔ)料分批培養(yǎng)(FB1)中菌體()、葡萄糖()、乙酸()及hIFNa2b()的變化曲線Fig.7Profiles of dry cell weight (), residual glucose(),acetic acid () and hIFNa2b () in pH-statfed-batch cultivation (FB1)hIFNa2b表達(dá)量在11.5 h達(dá)到2 400 mg/L,是分批發(fā)酵的3. 2倍。誘導(dǎo)初期的2 h內(nèi),h

29、IFNa2b比生產(chǎn)速率為148 mg/(gh),生產(chǎn)速率高達(dá)730 mg/(Lh)。后期hIFNa2b表達(dá)速率明顯減慢,發(fā)酵末期僅為10 mg/(gh)。在恒pH補(bǔ)料分批培養(yǎng)中,能較好地控制葡萄糖的流加,使得發(fā)酵后期沒有乙酸積累。但是恒pH流加方式下的葡萄糖流加是基于有機(jī)氮源的異化代謝引起pH上升,隨著培養(yǎng)基的氮源如氨基酸的逐漸消耗,減少了氨離子的產(chǎn)生,從而不易引起發(fā)酵液pH上升,導(dǎo)致葡萄糖補(bǔ)加速率的降低,使得培養(yǎng)過程中特別是發(fā)酵后期葡萄糖的供應(yīng)不足。如圖8所示,培養(yǎng)過程中葡萄糖流加速率rG從2.83 g/h下降到1.99g/h,葡萄糖比消耗速率QG從0.115 g/(gh)下降到0.087

30、g/(gh),限制了hIFNa2b的表達(dá)。與分批培養(yǎng)相比,雖然hIFNa2b的比生產(chǎn)速率有所下降,但總產(chǎn)量和菌體hIFNa2b含量大幅提高,說明菌體濃度升高有利于提高h(yuǎn)IFNa2b表達(dá)水平,恒pH流加是一種操作方便的流加方式。圖8恒pH補(bǔ)料分批培養(yǎng)(FB1)中葡萄糖濃度()、葡萄糖流加速率()及葡萄糖比消耗速率()的變化曲線Fig.8Profiles of residual glucose(), feeding rate of glu-cose () and specific consumption rate of glucose() in pH-stat fed-batch cultivat

31、ion (FB1)恒速補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)中hIFNa2b平均生產(chǎn)速率是恒pH補(bǔ)料時(shí)的1.65倍,表明葡萄糖供應(yīng)的改善提高了hIFNa2b的表達(dá)水平,盡管葡萄糖的比消耗速率還是從誘導(dǎo)初期的0.28 g/(gh)下降到0.21g/(ga2b的比生產(chǎn)速率僅27 mg/(gh),大大低于恒pH補(bǔ)料分批培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)FB1。通過恒速補(bǔ)糖方式取得了hIFNa2b非常高的表達(dá)量,但這是通過延長發(fā)酵時(shí)間和提高菌體濃度實(shí)現(xiàn)的,過低的比生產(chǎn)速率大大影響發(fā)酵生產(chǎn)效率。2.3誘導(dǎo)前添加有機(jī)氮源對hIFNa2b生產(chǎn)水平的影響許多基因工程菌外源基因的表達(dá)顯示出與生長速率相關(guān)的特性,而補(bǔ)料分批培養(yǎng)中,隨著菌體濃度的提高,誘導(dǎo)初期的比生長速

32、率明顯下降,反映了營養(yǎng)的限制。因此在誘導(dǎo)前1.5 h補(bǔ)充有機(jī)氮源(酵母提取物25 g),以滿足菌體生長和產(chǎn)物合成的需要。初始葡萄糖耗完后,采用恒比供應(yīng)速率(0.27 g/(gh)的方式補(bǔ)充葡萄糖,發(fā)酵過程記為FB3,結(jié)果見圖9和表1。圖9補(bǔ)料分批培養(yǎng)FB3中菌體()、葡萄糖()、乙酸()及hIFNa2b()的變化曲線Fig.9Profiles of dry cell weight (), residual glucose(), acetic acid () and hIFNa2b () in fed-batch cultivation FB3 (yeast extract was added at6.5 h)采用恒比供應(yīng)速率流加方式,葡萄糖流速根據(jù)菌體總量變化而變化,能夠較好地滿足細(xì)胞代謝及重組蛋白表達(dá)所需的能量需求,同時(shí)也避免了乙酸和殘?zhí)堑姆e累,平均比生產(chǎn)速率為恒速流加時(shí)的2倍?？梢钥闯?加入酵母抽提物,滿足了菌體生長的需要,使得誘導(dǎo)前后均有較高的比生長速率,表達(dá)期平均比生長速率達(dá)到0.106 h-1。升溫誘導(dǎo)5.5 h后,hIFNa2b表達(dá)量即達(dá)到5530mg/L,hIFNa2b最大比生產(chǎn)速率為124 mg/(gh),hIFNa2b的平均生產(chǎn)速率大幅提高,達(dá)1 006 mg/(Lh)。分批發(fā)酵和不同補(bǔ)料分批發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果歸納于表1?？梢钥闯鯢B3添加的酵母提取