植株生理生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

1、根系活力的測(cè)定（TTC 法）植株根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長(zhǎng)情況和活力水平直接影響地上部分的生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。一、原理氯化三苯基四氮唑（TTC ）是標(biāo)準(zhǔn)氧化電位為 80mV的氧化還原色素，溶于水中成為無色溶液， 但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比較穩(wěn)定， 不會(huì)被空氣中的氧自動(dòng)氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗(yàn)的氫受體，植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，蘋果酸得到增強(qiáng)，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標(biāo)。二、材料、設(shè)備儀器及試劑（一）材料水培或砂培小麥、玉米等植物根系。（二）儀器設(shè)備

2、1. 分光光度計(jì)；2.分析天平（感量 O.lmg）； 3.電子頂載天平（感量 0.1g）; 4.溫箱；5.研缽；6. 三角瓶50ml ； 7.漏斗；8.量筒100ml ； 9.吸量管10ml ； 10.刻度試管10ml ； 11.試管架；12.容 量瓶10ml ； 13.藥勺；14.石英砂適量；15.燒杯10ml、1000ml。（三）試劑1、乙酸乙酯（分析純）。2、次硫酸鈉（Na2S2O4 ），分析純，粉末。3、 1 % TTC溶液|準(zhǔn)確稱取 TTC 1.0g，溶于少量水中。定容到 100ml。4、 0.4 % TTC溶液準(zhǔn)確稱取 TTC 0.4g，溶于少量水中。定容到 100ml。5、磷酸緩

3、沖液（1/15mol/L , pH7）:6、 |lmol/L硫酸：用量筒取比重1.84的濃硫酸55ml，邊攪拌邊加入盛有 500ml蒸餾水的燒杯中，冷卻后稀釋至1000ml。7、0.4mol/L琥珀酸稱取琥珀酸 4.72g,溶于水中，定容至 100ml即成。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、定性測(cè)定(1) 配制反應(yīng)液：把 1%TTC溶液、O.4mol/L的琥珀酸和磷酸緩沖液按1:5:4比例混合。(2) 把根仔細(xì)洗凈，把地上部分從莖基切除。將根放入三角瓶中，倒入反應(yīng)液，以浸沒根為度，置37 C左右暗處放 13h，以觀察著色情況，新根尖端幾毫米以及細(xì)側(cè)根都明顯地變成紅色，表明該處 有脫氫酶存在。2、定量測(cè)定(1)

4、TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取0.4 % TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少許 Na2S2O4粉搖勻后立即產(chǎn)生紅色的甲腙。再用 乙酸乙酯定容至刻度，搖勻。然后分別取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲腙25卩g、50卩g、100卩g、150卩g、200卩g的標(biāo)準(zhǔn)比色系列，以空白作參比，在485nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2) 稱取根尖樣品0.5g，放入10ml燒杯中，加入0.4 %TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液 10ml, 把根充分浸沒在溶液內(nèi)，在 37C下暗保溫13h,此后加入1mol/L

5、硫酸2ml，以停止反應(yīng)(與此同 時(shí)做一空白實(shí)驗(yàn)，先加硫酸，再加根樣品，其他操作同上)。(3) 把根取出，吸干水分后與乙酸乙酯34ml和少量石英砂一起在研缽內(nèi)磨碎，以提出甲月替。紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯把殘?jiān)礈於?、三次，皆移入試管，最后加乙酸乙酯使總量?10ml，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)485nm下比色，以空白試驗(yàn)作參比測(cè)出吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出四氮唑還原量。四、結(jié)果計(jì)算單位質(zhì)量鮮根的四氮唑還原強(qiáng)度C從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出的四氮唑還原量(mg);W 樣品質(zhì)量(g);t 反應(yīng)時(shí)間(h)。6 / 9植物體內(nèi)硝酸還原酶活力的測(cè)定硝酸還原酶（nitrate reductase, NR）,是植物氮

6、素同化的關(guān)鍵酶，它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽（NO3 +NADH+H NO2 +NAD十+山0）。產(chǎn)生的亞硝酸鹽與對(duì)-氨基苯磺酸（或?qū)?氨基 苯磺酰胺）及a -萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。生成的紅色偶氮化合物在 540 nm有最大吸收峰，可用分光光度法測(cè)定。硝酸還原酶活性可由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示。一般單位鮮重以卩g氮/ （g h）為單位。NR的測(cè)定可分為活體法和離體法?；铙w法步驟簡(jiǎn)單，適合快速、多組測(cè)定；離體法復(fù)雜，但重復(fù)性較好。I離體法一、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實(shí)驗(yàn)材料水稻、小麥或其他植物葉片、幼穗等。（二）試劑1、 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：|準(zhǔn)確稱

7、取分析純 NaNO2 0.9857g溶于無離子水后定容至 1000mL ,然后再吸取 5mL定容至1000mL，即為含亞硝態(tài)氮的 1卩g/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。2、 |0.1mol/L pH7.5 的磷酸緩沖液：Na2HPO4 12出0 30.0905g 與 WH2PO4 2出0 2.4965g 加無離子水溶解后定容至1000mL 03、1 %磺胺溶液:1.0g磺胺溶于100mL濃度為3mol/L的HCI中（25mL濃鹽酸加水定容至 100mL即 為 3mol/L HCl ）。4、 0.02 %萘基乙烯胺溶液：| 0.0200g萘基乙烯胺溶于100 mL無離子水中，貯于棕色瓶中。5、0.1 mol/L

8、 KNO 3 溶液:2.5275g KNO 3 溶于 250mL0.1 mol/L pH7.5 的磷酸緩沖液。6、0.025 mol/L pH8.7 的磷酸緩沖液：| 8.8640g W2HPO4 12出0, 0.0570g K2HPO4 -3H2O 溶于 1000mL 無離子水中。7、提取緩沖液： 0.1211g半胱氨酸、0.0372g EDTA溶于100mL 0.025 mol/L pH8.7的磷酸緩沖液中。& 2mg/mL NADH 溶液:2mg NADH 溶于1mL0.1 mol/L pH7.5 磷酸緩沖液中（臨用前配制）。（三）儀器設(shè)備冷凍離心機(jī)，分光光度計(jì)，天平（感量0.1 mg

9、）,冰箱，恒溫水浴，研缽，剪刀，離心管，具塞試管，移液管，洗耳球。二、實(shí)驗(yàn)步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取7支潔凈烘干的15mL刻度試管按表1順序加入試劑，配成02.0卩g的系列標(biāo)準(zhǔn)亞硝態(tài)氮溶液。搖勻后在25C下保溫30min，然后在540nm下比色測(cè)定。以亞硝態(tài)氮（卩g）為橫坐標(biāo)（X），吸 光度值為縱坐標(biāo)（Y ）建立回歸方程。表1配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)各物質(zhì)加入量試劑/mL12管號(hào)67345亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液00.20.40.81.21.62.0蒸餾水2.01.81.61.20.80.40.01%磺胺44444440.02%萘基乙烯胺4444444每管含亞硝態(tài)氮/卩g00.20.40.81.21.62.0（二）

10、樣品中硝酸還原酶活力測(cè)定1、酶的提取稱取0.5g鮮樣，剪碎于研缽中置于低溫冰箱冰凍30min，取出置冰浴中加少量石英砂及4mL提取緩沖液，研磨勻漿，轉(zhuǎn)移于離心管中在4C、4000r/min下離心15min，上清液即為粗酶提取液。2、酶的反應(yīng)取粗酶液0.4mL于10 mL試管中，加入1.2mL0.1mol/L KNO 3磷酸緩沖液和 0.4mLNADH 溶液,混勻，在25C水浴中保溫 30min，對(duì)照不加NADH溶液，而以0.4mL0.1mol/L pH7.5磷酸緩沖液代替。3、終止反應(yīng)和比色測(cè)定保溫結(jié)束后立即加入 1mL磺胺溶液終止酶反應(yīng)，再加1mL萘基乙烯胺溶液，顯色15min后于4000r

11、/min下離心5min ,取上清液在540nm下比色測(cè)定吸光度。 根據(jù)回歸方程計(jì)算出反應(yīng)液中所產(chǎn)生 的亞硝態(tài)氮總量（卩g） 0三、結(jié)果計(jì)算樣品中硝酸還原酶活性x 反應(yīng)液酶催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量（卩g）；Vt 提取酶時(shí)加入的緩沖液體積，mL ;V S酶反應(yīng)時(shí)加入的粗酶液體積，mL;W 樣品鮮重，g ；t 反應(yīng)時(shí)間，hoU活體法一、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）實(shí)驗(yàn)材料水稻、小麥或其他植物葉片、幼穗等。（二）試劑1、 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：|準(zhǔn)確稱取分析純 NaNO2 0.9857g溶于無離子水后定容至 1000mL,然后再吸取 5mL定容至1000mL，即為含亞硝態(tài)氮的 1卩g/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。2、 1

12、%磺胺溶液:1.0g磺胺溶于100mL濃度為3mol/L的HCI中（25mL濃鹽酸加水定容至 100mL即 為 3mol/L HCl ） o3、 0.02 %萘基乙烯胺溶液：| 0.0200g萘基乙烯胺溶于100 mL無離子水中，貯于棕色瓶中。4、0.1 mol/L KNO 3 溶液:2.5275g KNO 3 溶于 250mL0.1 mol/L pH7.5 的磷酸緩沖液。5、 3。三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸，水溶后定容至 100mL（三）儀器設(shè)備真空泵、真空干燥器、小燒杯、玻璃瓶塞、其他用具同離體法。二、實(shí)驗(yàn)步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：同離體法（二）酶反應(yīng)及活性測(cè)定1、 取樣：稱取作物葉片 1

13、.02.0g 4份，剪成1cm左右的小段，放于小燒杯中，用直徑略小于燒杯直 徑的玻璃瓶塞將材料全部壓于杯底，其中1份作對(duì)照，另外 3份做酶活性測(cè)定用。2、 反應(yīng)：先向?qū)φ展苤屑尤?1mL 30%三氯乙酸，然后各管中都加入9mL 0.1mol/L KNO 3溶液，混勻后立即放入干燥器中，抽氣1min再通入空氣，再抽真空，反復(fù)幾次，以排除組織間隙的氣體，至葉片完全軟化沉入杯底，以便底物溶液進(jìn)入組織。最后通入氮?dú)饷芊夂?，?5C黑暗中反應(yīng)30min，再分別向測(cè)定管（對(duì)照管除外）加入1mL 30%三氯乙酸終止酶反應(yīng)。3、比色測(cè)定：將各管搖勻靜置 2min 后，各取 2mL 反應(yīng)液，加入 1mL 磺胺和

14、 1mL 萘基乙烯胺，搖 勻顯色 15min 后，于 4000r/min 下離心 5min ，取上清液于 540nm 處測(cè)其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 出反應(yīng)液中生成的亞硝態(tài)氮總量（卩g）。三、結(jié)果計(jì)算同離體法。葉綠素含量的測(cè)定一、原理根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯-比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度 C和葉層厚度L成正比，即：式中：a為比例常數(shù)，當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，葉層厚度為1cm時(shí)，a為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)可通過測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下

15、的吸光度 而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性。今欲測(cè)定葉綠素混合提取液中葉綠素a,葉綠素b和類胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在3個(gè)特定波長(zhǎng)下的吸光度 A，并根據(jù)葉綠素a,葉綠素b和類胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠素a,葉綠素b時(shí)為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長(zhǎng)應(yīng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。已知葉綠素a,葉綠素b的80%丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為 663nm和645nm ,已知 在波長(zhǎng)663nm下，葉綠素a,葉綠素b在該溶液中的吸光系數(shù)分別為 82.04和9.

16、27，在波長(zhǎng)645nm下 分別為16.75和45.60,可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：(1)(2)式(1)、(2)中的A663和A645為葉綠素溶液在波長(zhǎng) 663nm和645nm時(shí)的吸光度，Ca、Cb分別為 葉綠素a、葉綠素b的濃度，以mg/L為單位。解方程組(1)、(2)得：(3)(4)將Ca與Cb相加即得葉綠素總量 Ct(5)另外，由于葉綠素 a、葉綠素b在652nm的吸收峰相交，兩者有相同的吸光系數(shù)(均為34.5),也可以在此波長(zhǎng)下測(cè)定一次吸光度(A652)而求出葉綠素 a、葉綠素b總量：在有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時(shí)測(cè)定出溶液中類胡蘿卜素的含量。Lichte nthale

17、r等對(duì)Arnon法進(jìn)行了修正，提出了80%丙酮提取液中3種色素含量的計(jì)算公式：（7）（8） （9）式中：Ca與Cb分別為葉綠素a、葉綠素b的濃度；Cx?c為類胡蘿卜素的總濃度；A663、A646和A470分別為葉綠素色素提取液在波長(zhǎng)663nm、646nm和470nm下的吸光度。由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時(shí)，計(jì)算公式也有所不同。葉綠素 a、葉綠素b在95%乙醇中最大吸收峰的波長(zhǎng)分別為665nm和649nm，類胡蘿卜素為470nm，可據(jù)此列出以下關(guān)系式：（10）（11） （12）二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料新鮮（或烘干）的植物葉片。（二）儀器設(shè)備

18、分光光度計(jì)、電子天平、研缽、棕色容量瓶、小漏斗、定量濾紙、吸水紙、擦鏡紙、滴管。（三）試劑1、95%乙醇（或80%丙酮）；2、石英砂；3、碳酸鈣粉。三、實(shí)驗(yàn)步驟（1）取新鮮葉片（或其他綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，用打孔器剪取葉片組或剪碎（去掉中脈），混勻。（2） 稱取混勻后的新鮮樣品0.2g,共三份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉以及95%乙醇23mL （或80%丙酮，以下同），研磨成勻漿，再加 95%乙醇10mL，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置 35min。（3） 取濾紙一張，置漏斗中，用乙醇濕潤(rùn)，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25mL棕色容量 瓶中，用少量95%乙醇沖洗研缽，研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分?。?）用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直到濾紙和殘?jiān)袩o綠色為止。 最后用乙醇定容至 25mL，搖勻。（5） 把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以 95%乙醇為空白，在波長(zhǎng) 665nm、