實驗血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜及課件

1、實驗血紅蛋白及其衍生物的吸收光 譜及 1 實驗二實驗二 血紅蛋白血紅蛋白 及其衍生物的吸收光譜測定及其衍生物的吸收光譜測定 實驗血紅蛋白及其衍生物的吸收光 譜及 2 目的要求目的要求 u掌握掌握722型分光光度計的使用型分光光度計的使用 u了解血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜的測定了解血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜的測定 u掌握血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制掌握血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 實驗血紅蛋白及其衍生物的吸收光 譜及 3 實驗原理實驗原理 溶液中的物質(zhì)在光的照射激發(fā)下，產(chǎn)溶液中的物質(zhì)在光的照射激發(fā)下，產(chǎn) 生了對光吸收的效應(yīng)，物質(zhì)對光的吸收是生了對光吸收的效應(yīng)，物質(zhì)對光的吸收是 具有選擇性的，各種不同的物

2、質(zhì)都具有其具有選擇性的，各種不同的物質(zhì)都具有其 各自的吸收光譜，因此當(dāng)某單色光通過溶各自的吸收光譜，因此當(dāng)某單色光通過溶 液時，其能量就會被吸收而減弱，光能量液時，其能量就會被吸收而減弱，光能量 減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān) 系，也即符合于比色原理系，也即符合于比色原理-朗伯朗伯-比耳定律比耳定律 u分光光度計的使用分光光度計的使用 實驗血紅蛋白及其衍生物的吸收光 譜及 4 l 朗伯比爾定律：朗伯比爾定律： A=lc ：摩爾吸光系數(shù)：摩爾吸光系數(shù) c：溶液的濃度：溶液的濃度 l：液層的厚度：液層的厚度 A：物質(zhì)的吸光度：物質(zhì)的吸光度 實驗血紅蛋白及其

3、衍生物的吸收光 譜及 5 u比色皿的使用比色皿的使用 手持毛玻璃面，不可觸碰光滑面手持毛玻璃面，不可觸碰光滑面 使用前要再用少量（大約使用前要再用少量（大約1-2ml）待測溶液）待測溶液 潤洗潤洗1次次 使用時比色皿光滑面對準(zhǔn)光路使用時比色皿光滑面對準(zhǔn)光路 使用后及時清洗（用海綿刷沾取肥皂液清使用后及時清洗（用海綿刷沾取肥皂液清 洗比色皿，并用自來水沖洗干凈，隨后用洗比色皿，并用自來水沖洗干凈，隨后用 蒸餾水潤洗蒸餾水潤洗1-2次）次） 實驗血紅蛋白及其衍生物的吸收光 譜及 6 u血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜測定血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜測定 血紅蛋白血紅蛋白(Hb)與與O2結(jié)合生成結(jié)合生成

4、氧合血紅蛋白氧合血紅蛋白 (HbO2)，與，與CO結(jié)合生成結(jié)合生成碳氧血紅蛋白碳氧血紅蛋白(HbCO)。 因其血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)不同，當(dāng)光線分別透因其血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)不同，當(dāng)光線分別透 過各種過各種Hb溶液時，所吸收的光波也各異，可顯溶液時，所吸收的光波也各異，可顯 出特有的吸收光譜。這些吸收光譜可作為它們定出特有的吸收光譜。這些吸收光譜可作為它們定 性和定量分析的基礎(chǔ)。性和定量分析的基礎(chǔ)。 實驗血紅蛋白及其衍生物的吸收光 譜及 7 如如HbO2在可見光波長在可見光波長400600nm范圍范圍 內(nèi)有內(nèi)有3個特征的吸收峰，其峰值分別在個特征的吸收峰，其峰值分別在415、 541和和576nm處，當(dāng)

5、氧合血紅蛋白轉(zhuǎn)為碳氧處，當(dāng)氧合血紅蛋白轉(zhuǎn)為碳氧 血紅蛋白（血紅蛋白（HbCO），此時光譜發(fā)生改變，），此時光譜發(fā)生改變， 在波長在波長419、540和和569nm處出現(xiàn)三個特征處出現(xiàn)三個特征 的吸收峰，其中在的吸收峰，其中在500600nm范圍內(nèi)范圍內(nèi)2個個 特征的吸收峰如下圖。特征的吸收峰如下圖。 實驗血紅蛋白及其衍生物的吸收光 譜及 8 項目項目吸收峰數(shù)吸收峰數(shù)吸收光譜（吸收光譜（nm） HbO22541 577 HbCO2540 569 實驗血紅蛋白及其衍生物的吸收光 譜及 9 實驗血紅蛋白及其衍生物的吸收光 譜及 10 儀器和試劑儀器和試劑 1儀器：試管；吸量管；儀器：試管；吸量管；

6、量筒；量筒；722型分型分 光光度計；光光度計；CO發(fā)生器。發(fā)生器。 2試劑：試劑： （1）濃）濃H2SO4； （2）甲酸；）甲酸； （3）蒸餾水；）蒸餾水； （4）血紅蛋白溶液。）血紅蛋白溶液。 （5）NaOH； 實驗血紅蛋白及其衍生物的吸收光 譜及 11 實驗操作實驗操作 u 預(yù)熱儀器預(yù)熱儀器 u 選定波長選定波長 u 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)T=100 u 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)“0”點點 u 測定測定 u 關(guān)機關(guān)機 分光光度計的使用分光光度計的使用 實驗血紅蛋白及其衍生物的吸收光 譜及 12 用草酸鉀抗凝，取靜脈血，邊取邊輕輕搖動，用草酸鉀抗凝，取靜脈血，邊取邊輕輕搖動， 即制得全血。即制得全血。 （1）氧合血紅蛋

7、白（）氧合血紅蛋白（HbO2）液：）液： 加蒸餾水加蒸餾水20ml， 取全血取全血0.1ml（3滴）盛于滴）盛于 小燒杯中，混勻，此即小燒杯中，混勻，此即HbO2液，呈鮮紅色。液，呈鮮紅色。 （2）碳氧血紅蛋白（）碳氧血紅蛋白（HbCO) 液：液： 取上述取上述HbO2液約液約5ml于試管中，通于試管中，通CO氣體氣體 （濃硫酸與甲酸在（濃硫酸與甲酸在CO發(fā)生器中反應(yīng)發(fā)生）約發(fā)生器中反應(yīng)發(fā)生）約10 秒鐘，秒鐘，HbO2即變成櫻桃紅色的即變成櫻桃紅色的HbCO溶液。溶液。 1樣品的制備樣品的制備： 實驗血紅蛋白及其衍生物的吸收光 譜及 13 2吸光度測定：吸光度測定： （1）將如上制備的）將如

8、上制備的2種血紅蛋白液分別種血紅蛋白液分別 盛于比色杯內(nèi)，在盛于比色杯內(nèi)，在722型分光光度計上以蒸型分光光度計上以蒸 餾水為空白調(diào)節(jié)吸光度零點和餾水為空白調(diào)節(jié)吸光度零點和100%（每一每一 次讀數(shù)均應(yīng)用空白管調(diào)節(jié)零點和次讀數(shù)均應(yīng)用空白管調(diào)節(jié)零點和100%）。）。 （2） 先從波長先從波長500600nm分別測定分別測定 HbO2，碳氧血紅蛋白的吸光度（在相應(yīng)峰，碳氧血紅蛋白的吸光度（在相應(yīng)峰 值的值的10nm范圍內(nèi)每隔范圍內(nèi)每隔2nm記錄一次吸光度記錄一次吸光度 讀數(shù)，其余均每隔讀數(shù)，其余均每隔10nm記錄一次吸光度讀記錄一次吸光度讀 數(shù)）。數(shù)）。 實驗血紅蛋白及其衍生物的吸收光 譜及 14

9、 3.吸收光譜曲線的繪制吸收光譜曲線的繪制 以吸光度為縱坐標(biāo)，波長為橫坐標(biāo)描以吸光度為縱坐標(biāo)，波長為橫坐標(biāo)描 點，并將各點連接成曲線，即為血紅蛋白點，并將各點連接成曲線，即為血紅蛋白 及其衍生物的吸收光譜，但由于使用儀器及其衍生物的吸收光譜，但由于使用儀器 不同，繪制出的血紅蛋白及其衍生物的吸不同，繪制出的血紅蛋白及其衍生物的吸 收光譜必有一些差異，對收光譜必有一些差異，對722型分光光度計型分光光度計 來說，峰值誤差在來說，峰值誤差在3nm5nm波長內(nèi)是允波長內(nèi)是允 許的。許的。 實驗血紅蛋白及其衍生物的吸收光 譜及 15 注意事項注意事項 u 分光光度計應(yīng)放在干燥處，使用溫度為分光光度計應(yīng)放在干燥處，使用溫度為535。遠(yuǎn)。遠(yuǎn) 離強電場、磁場離強電場、磁場 u 每次做完實驗時，應(yīng)立即洗凈比色皿每次做完實驗時，應(yīng)立即洗凈比色皿 u 為了防止光電管疲勞。不測定時必須將比色皿為了防止光電管疲勞。不測定時必須將比色皿 暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長光電管使用壽命暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長光電管使用壽命 u 當(dāng)儀器停止工作時，切斷電源，電源開關(guān)同時當(dāng)儀器停止工作時，切斷電源，電源開關(guān)同時 切斷。并且用套子蓋住儀器，做好使用登記切斷。并且用套子蓋住儀器，做好使用登記