第四章 固定化 2012

1、第四章第四章 酶及微生物細(xì)胞的固定化酶及微生物細(xì)胞的固定化 第一節(jié)第一節(jié) 固定化酶固定化酶 第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化 水溶性酶水溶性酶水不溶性載體水不溶性載體 水不溶性酶水不溶性酶 （固定化酶）（固定化酶） 固定化技術(shù)固定化技術(shù) n酶的固定化是將酶與水不溶性載體結(jié)合，制備固定化酶的酶的固定化是將酶與水不溶性載體結(jié)合，制備固定化酶的 過程過程 n固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)(immobilized enzyme)是指被固定在某一有限空是指被固定在某一有限空 間內(nèi)不再能自由流動而仍有催化活性的酶。間內(nèi)不再能自由流動而仍有催化活性的酶。 1.1 固定化酶的優(yōu)

2、、缺點(diǎn)： n優(yōu)點(diǎn)： q純化簡單，底物與產(chǎn)物容易分開 q可反復(fù)使用 q穩(wěn)定性高 q反應(yīng)條件易控制，可以裝塔連續(xù)反應(yīng)； q較水溶性酶更適合于多酶反應(yīng) q增加產(chǎn)物的收得率，提高產(chǎn)物質(zhì)量 1.1 固定化酶的優(yōu)、缺點(diǎn)： n缺點(diǎn)： q載體與試劑較貴 q酶固定化回收率低 q胞內(nèi)酶固定化還要增加分離成本； 1.適用于水溶性小分子底物 1.2 評價固定化酶的指標(biāo) n 酶活：在25，具有最適底物濃度，最適 緩沖液離子強(qiáng)度和pH 系統(tǒng)內(nèi)一分鐘轉(zhuǎn)化一個 微摩爾底物所需的酶量。 n 活力回收率=固定化酶總活力/被固定化游 離酶總活力*100%，或稱偶聯(lián)效率、活力保留 百分?jǐn)?shù)。 n 操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。 連續(xù)測

3、活條件下固定化酶活力下降為最初 活力一半所需要的時間（t1/2） 共價結(jié)合 酶酶 固定化固定化 間歇間歇 可溶可溶 交聯(lián)包埋吸附 間歇間歇連續(xù)連續(xù) （一）吸附法 物理吸附法 將酶固定到非水溶性載體上的方法 優(yōu)點(diǎn)：固定化時酶分子的構(gòu)象很少或基 本不發(fā)生變化。 缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸附。 常用吸附劑： 無機(jī)載體： 氧化鋁、活性碳、皂土、硅藻土、多孔玻璃、硅膠。 有機(jī)載體： 火棉膠膜、膠質(zhì)膜、微孔玻璃載體。 選擇吸附劑的原則： 要有巨大的比表面積； 要有活潑的表面； 要控制顆粒形狀、大小，便于裝柱進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)。 n物理吸附法的特點(diǎn) q操作簡便 q費(fèi)用較省 q可供選擇的載體類型多,有的可以再生。 q酶

4、與載體的相互作用較弱，被吸附的酶容易從載體 上脫落 離子吸附法離子吸附法 通過離子鍵將酶結(jié)合到具有離子交換基團(tuán)通過離子鍵將酶結(jié)合到具有離子交換基團(tuán) 的非水溶性載體上的方法的非水溶性載體上的方法 第一個離子結(jié)合法固定化酶： DEAE Cellulose 固定化過氧化氫酶 第一個工業(yè)化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶 選擇吸附劑的原則： n對酶有高親和力，不會引起酶失活；對酶有高親和力，不會引起酶失活； n吸附容量大，不吸附反應(yīng)產(chǎn)物和酶抑制劑。吸附容量大，不吸附反應(yīng)產(chǎn)物和酶抑制劑。 常用吸附劑 陰離子交換劑 DEAE Cellulose 二乙基氨基乙基纖維素二乙

5、基氨基乙基纖維素 DEAESephadex A-50 DEAESepharose 陽離子交換劑 CM CM Cellulose Cellulose 羧甲基纖維素羧甲基纖維素 IRC-50IRC-50 IRC-120 IRC-120 n影響吸附操作因素： q等電點(diǎn) qpH q鹽濃度 q溫度 n離子結(jié)合法的特點(diǎn) q操作簡便,處理?xiàng)l件溫和，可以得到較多高活性的固 定化酶。 q載體和酶的結(jié)合力不夠牢固，易受緩沖液種類和pH 的影響。 （二）包埋法 Entrapping Method 將酶物理包埋在高聚物內(nèi)的方法 1.網(wǎng)格型網(wǎng)格型 將酶包裹在高分子凝膠的微小格子中將酶包裹在高分子凝膠的微小格子中 聚丙烯

6、酰胺、海藻酸、角叉菜膠（卡拉膠）等 2.微膠囊型 將酶包裹在球形高分子半透膜中將酶包裹在球形高分子半透膜中 聚酰胺、聚脲、聚酯 n包埋法的特點(diǎn) n 不需要化學(xué)修飾氨基酸殘基。 n 反應(yīng)條件溫和，很少顯著改變酶的結(jié)構(gòu)。 n 包埋時只適用于小分子的底物和產(chǎn)物。 n 對酶、粗酶制劑和微生物都能進(jìn)行固定。 n 無E-載體之間的化學(xué)反應(yīng)，只有載體凝固 過程。 （三）共價鍵結(jié)合法 將酶蛋白分子上的非必需官能團(tuán)和聚合物載體上 的反應(yīng)基團(tuán)通過共價鍵形成不可逆的連接的方法 n技術(shù)要點(diǎn) n將所選用的載體上的有關(guān)基團(tuán)活化，然后 和酶蛋白上有關(guān)基團(tuán)（游離氨基、游離羧 基、巰基、咪唑基、酚基、羥基、甲硫基、 吲哚基）發(fā)

7、生偶聯(lián)反應(yīng)。 常用方法 n重氮化法 n烷基化法 n芳基化法 重氮化法 常用載體 天然高分子。如纖維素，葡聚糖凝膠 （Aephadex），瓊脂糖（Agarose，Sepharose）， 卡那膠，淀粉及其衍生物。（利用-OH） 人工合成的高聚物，如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯， 聚乙烯醇，氨基酸共聚物等。（利用-NH2） 無機(jī)載體，如多孔玻璃，硅膠等。（要加上一個 基團(tuán)），苯胺基多孔玻璃 n共價法的特點(diǎn)： q酶和載體的結(jié)合比較牢固，酶不易脫落。故使用的 半衰期較長。 q制備條件復(fù)雜，反應(yīng)劇烈，易引起酶蛋白高級結(jié)構(gòu) 發(fā)生變化。 q載體不會引起蛋白質(zhì)的變性，經(jīng)得起一定的pH，濃 度的改變。 （四）交聯(lián)法 利用

8、雙功能或多功能試劑與酶之間發(fā)生 分子交聯(lián)把酶固定化的方法 雙功能試劑：雙功能試劑： 常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O O H C CH2 CH2 CH2 C H 圖 酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不 溶性的固定化酶； n交聯(lián)法特點(diǎn)交聯(lián)法特點(diǎn) n帶有二個以上的功能基團(tuán)。帶有二個以上的功能基團(tuán)。 n反應(yīng)比較劇烈條件比較嚴(yán)格。反應(yīng)比較劇烈條件比較嚴(yán)格。 n操作方便，活力回收不高。操作方便，活力回收不高。 1.4 固定化酶的性質(zhì) n酶固定后，酶本身的結(jié)構(gòu)必然受到擾動 n同時酶固定后，由于擴(kuò)散限制效應(yīng)、空間位阻 作用以及載體性質(zhì)等因素必然對酶的性質(zhì)產(chǎn)生 影響 n活性下降，穩(wěn)定性提高 固

9、定化酶的動力學(xué)方程 nKm=Km/ Km表觀米氏常數(shù) n= Si/S 分配系數(shù) Si 微環(huán)境 S 宏觀環(huán)境 n載體與底物帶相同電荷， SiS， S， 1 max SK SV V m 固定化細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)固定化細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn) 與固定化酶相比 n（1）免去了破碎細(xì)胞提取酶的手續(xù) n（2）酶在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性較高，完整細(xì)胞 固定化后酶活性損失少 n（3）固定化細(xì)胞制備的成本比固定化酶低 n（4）無需輔酶再生 固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用 乙酰乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酸 乙酰乙酰 -D Ala Aminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶 DLDL氨基酸的拆分氨基酸的拆分 固定化酶在工

10、業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用 DL DL氨基酸的拆分氨基酸的拆分 R-CH-COOH - NHCOCH3 H2O氨基?；?N-乙酰-DL-氨基酸 R NHCOCH3H COOH N-乙酰-D-氨基酸 COOH H2NH R L-氨基酸 泵泵 儲 罐 反應(yīng)產(chǎn)物 離子交 換樹脂 A-D- Ala 固定化酶 柱子 L-Ala L-Ala A-D-Ala A-L-Ala A-D-Ala 氨基酰化酶來源的比較氨基?；竵碓吹谋容^ n豬腎 難以大批量獲得。 n米曲霉 發(fā)酵周期長（7296h），菌體得率低，生產(chǎn)成本高。 nNJU9980 發(fā)酵周期縮短為36h，菌體得率為相同培養(yǎng)條件下米曲霉的23倍， 發(fā)酵成本低，穩(wěn)定性

11、較好。 圖 NJU9980形態(tài)特征圖 (400) Fig Morphology of NJU 9980 (400) Fixed bed reactors Fixed bed reactors 固定床反應(yīng)器固定床反應(yīng)器 Fluidized bed reactorsFluidized bed reactors 流化床反應(yīng)器流化床反應(yīng)器 Cell recycle system Cell recycle system 細(xì)胞再循環(huán)系統(tǒng)細(xì)胞再循環(huán)系統(tǒng) Cell recycle system Cell recycle system 細(xì)胞再循環(huán)系統(tǒng)細(xì)胞再循環(huán)系統(tǒng) n優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) n結(jié)構(gòu)簡單 n溫度pH易控制 n能處理膠狀和非水溶性底物 Cell recycle system Cell recycle system 細(xì)胞再循環(huán)系統(tǒng)細(xì)胞再循環(huán)系統(tǒng)