動物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)講解

1、實(shí)驗(yàn)時間實(shí)驗(yàn)內(nèi)容4月11日實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)用液的配制、除菌與分裝4月18日實(shí)驗(yàn)二 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)4月25日實(shí)驗(yàn)三 魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)（組織塊法）（ 1-5組） 401實(shí)驗(yàn)四 染色體制備（ 6-10 組） 3015月 2日實(shí)驗(yàn)三 魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)（組織塊法）（ 6-10組） 401實(shí)驗(yàn)四 染色體制備（ 1-5 組） 3015月 9日實(shí)驗(yàn)五 細(xì)胞的復(fù)蘇與凍存1實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)用液的配制、除菌與分裝【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握常見培養(yǎng)用液的配制方法。2. 掌握常用的滅菌方法。3. 了解每種培養(yǎng)用液的作用?！緦?shí)驗(yàn)原理】常用細(xì)胞培養(yǎng)用液包括磷酸鹽平衡鹽溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液

2、體培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Trypsin）和 EDTA 溶液。 PBS 用于清洗細(xì)胞、配制胰蛋白酶和EDTA 。培養(yǎng)基含有細(xì)胞生長需要的各種營養(yǎng)元素，使用時通常還需填加血清和抗生素。魚類細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基常用種類是MEM和 L-15 ；用于動物的一般是DMEM和 RPMI-1640 。胰蛋白酶可將貼壁的細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上消化下來，通常使用濃度為0.25% 或 0.125% 。EDTA用于清洗細(xì)胞表面，螯合Ca 2+等二價離子，使細(xì)胞易于為胰蛋白酶消化。細(xì)胞培養(yǎng)用的試劑必需是無菌的，PBS 和 EDTA 可以采用高壓滅菌，而培養(yǎng)基和胰蛋白酶溶液含生物活性物質(zhì)，配制好后通過過濾除菌。【試劑、材料與儀器】試劑

3、： NaCl ，KCl ， Na2HPO 4，KH 2PO4， EDTA ，胰蛋白酶，HEPES ，碳酸氫鈉，鹽酸， MEM或 PRMI-1640培養(yǎng)基干粉，GPS材料：三蒸水，蒸餾水瓶，藥匙，稱量紙，燒杯（250 mL 、1000 mL ），玻棒，精密pH試紙（ 6.8-8.0），容量瓶（250 mL 、 1000 mL ），移液管（ 5 mL 、 10 mL ），一次性注射器，一次性過濾器，普鑷，酒精燈，打火機(jī)，醫(yī)用酒精，酒精噴壺，消毒紗布，已高壓滅菌試劑瓶（ 500 mL 、 250 mL 、 100 mL ），記號筆，標(biāo)簽紙，橡膠手套，封口膜儀器：精密天平，高壓滅菌鍋，超凈工作臺，加液

4、槍，4冰箱【實(shí)驗(yàn)分組】實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行，每組 4人，每班 20人，共分 5組。配制 PBS并高壓滅菌，配制胰蛋白酶溶液并過濾除菌和分裝，配制 EDTA 溶液高壓滅菌并分裝，配制培養(yǎng)基，過濾除菌培養(yǎng)基并分裝。每個實(shí)驗(yàn)小組需準(zhǔn)備試劑有：胰酶50 mL ；EDTA50 mL ；培養(yǎng)基 90 mL （使用前加入 10 mL 血清）。【實(shí)驗(yàn)步驟】1 PBS（ 1000mL ）的配制分別稱取NaCl 8g； KCl 0.2g ；Na2HPO 412H 2O 2.9g ；KH 2PO 4 0.2g 于燒杯，加入800mL 三蒸水，玻棒攪動充分溶解后，倒入1000mL 容量瓶中，用三蒸水定容至刻度。PBS用于 2

5、 胰蛋白酶溶液和3 EDTA 溶液的配制，余下高壓滅菌備用。22胰蛋白酶溶液（ 0.25% ）的配制、除菌與分裝稱取 0.625g 胰蛋白酶于 250 mL 燒杯，加入 1 配制的 PBS 200 mL ，玻棒攪拌充分溶解后，倒入 250 mL 容量瓶中，用 PBS 定容至刻度。拿入超凈工作臺過濾除菌，并分裝至5個試劑瓶（ 100 mL ），每瓶 50 mL 。試劑瓶均在酒精燈火焰上燒口加蓋，貼好標(biāo)簽，封口膜封口，放 4 冰箱保存?zhèn)溆?。?biāo)簽上標(biāo)明：0.25% 胰蛋白酶液、配制日期、以及組號與組長姓名。3 EDTA （ 0.2）的配制、除菌與分裝稱取 0.5 g EDTA 于 250 mL 燒杯

6、，加入 1 配制的 PBS 200 mL ，溶解時加少量 NaHCO3，調(diào)整 pH 為 8.0，玻棒攪拌使 EDTA 充分溶解。 再用 PBS 定容到 250 mL 容量瓶里， 終濃度為 0.2% ，用濃鹽酸， 調(diào) pH 為 7.2-7.4。裝于 250 mL 試劑瓶中，高壓滅菌備用。在超凈工作臺內(nèi)， 將已滅菌的EDTA 溶液分裝至5 個無菌試劑瓶（ 100 mL ），每瓶 50 mL 。試劑瓶均在酒精燈火焰上燒口加蓋，貼好標(biāo)簽，封口膜封口，放4 冰箱保存?zhèn)溆?。?biāo)簽上標(biāo)明： 0.2% EDTA 、配制日期、以及組號與組長姓名。4培養(yǎng)基的配制、除菌與分裝將培養(yǎng)基干粉（MEM或 PRMI-1640

7、 ）倒入 1000 mL 燒杯，加 800mL 三蒸水，玻棒攪拌充分溶解； 再加入加1.8g HEPES 和 2.2g 碳酸氫鈉， 玻棒攪拌充分溶解，溶液呈橙色 （弱酸性， pH 在 7.0 左右）；再倒入 1000 mL 容量瓶，用三蒸水定容至刻度。工作前打開超凈工作臺上的紫外燈，滅菌 30 分鐘后， 關(guān)閉紫外燈， 打開吹風(fēng)和照明燈；帶橡膠手套，用酒精擦拭消毒雙手；超凈工作臺面用酒精噴灑，再用消毒紗布擦凈。在超凈工作臺中擺放好試劑瓶和濾器。將培養(yǎng)液拿入超凈工作臺過濾除菌，并分裝至5 個無菌試劑瓶 （100 mL ），每瓶 90 mL ，余下裝入500 mL 無菌試劑瓶，每瓶內(nèi)需加入無菌的GP

8、S（谷氨酰胺 -青霉素 -鏈霉素），輕輕搖勻，使之終濃度為1% 。試劑瓶均在酒精燈火焰上燒口加蓋，貼好標(biāo)簽，封口膜封口，放 4 冰箱保存?zhèn)溆?。?biāo)簽上標(biāo)明： MEM 或 PRMI-1640 、配制日期、以及組號與組長姓名。用于細(xì)胞培養(yǎng)時，培養(yǎng)基內(nèi)需要加入血清，生長培養(yǎng)基內(nèi)血清濃度為10% ?！咀⒁馐马?xiàng)】1. 濾過除菌時，將容量瓶內(nèi)的液體倒入燒杯內(nèi)，再拿到超凈臺里，采用一次性濾器或是抽濾法除菌。2. 培養(yǎng)基中的抗生素可在配置時加入青霉素和鏈霉素的粉末，也可在過濾除菌后加入無菌的液體，終濃度為 100 U/mL 青霉素和 100 g/mL鏈霉素?！舅伎碱}】1.配制細(xì)胞生長培養(yǎng)液時，需要添加哪些物質(zhì)，

9、為什么？如何調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH ？2. 生長培養(yǎng)基中的血清一般在什么時候添加，為什么？3. 細(xì)胞培養(yǎng)中的各種試劑的滅菌和除菌方法有哪些，如何使用？3實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞的傳代培養(yǎng)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握貼壁細(xì)胞換液和細(xì)胞傳代的方法。2. 了解細(xì)胞傳代培養(yǎng)的意義?！緦?shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞在培養(yǎng)瓶里的生長，分為貼壁生長和懸浮生長。貼壁生長細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長數(shù)天后，就會在培養(yǎng)瓶底部長滿，如果不進(jìn)行處理，就會繼續(xù)生長而產(chǎn)生堆積，最后因缺乏營養(yǎng)供給而死亡。因此當(dāng)細(xì)胞生長貼滿瓶底時，就需要將細(xì)胞消化下來，并接種成多瓶細(xì)胞，使細(xì)胞繼續(xù)生長。這一處理接種的過程就叫傳代，每接種一次就叫做傳一代。細(xì)胞傳代培養(yǎng)使得細(xì)胞增殖，可獲得大量細(xì)

10、胞供實(shí)驗(yàn)所需。傳代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一，是幾乎所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。接種后的細(xì)胞放在培養(yǎng)箱里靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度視動物種類而定。一般，溫水性魚類細(xì)胞的最適培養(yǎng)溫度為25-28 ，冷水魚類細(xì)胞為15-20，水生哺乳動物細(xì)胞為37。細(xì)胞培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)培養(yǎng)基營養(yǎng)缺乏、代謝產(chǎn)物增多、變酸等不適宜細(xì)胞生長因素，而此時細(xì)胞還未生長達(dá)到飽和密度（沒有貼滿底部），仍需繼續(xù)培養(yǎng)，因而需要更新營養(yǎng)液來更新營養(yǎng)成分，以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長繁殖的需要，這一過程叫換液。單純換液不需要接種細(xì)胞?！驹噭⒉牧吓c儀器】試劑：生長培養(yǎng)基 （ PRMI-1640或 MEM ，添加 10%小牛血清或胎牛血清） ，0.2

11、5%胰蛋白酶， 0.2% EDTA材料：細(xì)胞培養(yǎng)瓶，移液管（5 mL 、 10 mL ），無菌離心管，廢液缸，普鑷，酒精燈，打火機(jī)，醫(yī)用酒精，酒精噴壺，消毒紗布，記號筆，橡膠手套，封口膜儀器：生化培養(yǎng)箱或 CO 2 培養(yǎng)箱，倒置生物顯微鏡，超凈工作臺，加液槍，低速離心機(jī)， 4冰箱【實(shí)驗(yàn)分組】實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行，每組4 人，每班20 人，共分5 組?！緦?shí)驗(yàn)步驟】工作前打開超凈工作臺上的紫外燈，滅菌 30 分鐘后， 關(guān)閉紫外燈， 打開吹風(fēng)和照明燈；帶橡膠手套，用酒精擦拭消毒雙手；超凈工作臺面用酒精噴灑，再用消毒紗布擦凈。在超凈工作臺中擺放好移液管、離心管和培養(yǎng)瓶等。1 觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

12、，確定細(xì)胞是否需要傳代，當(dāng)細(xì)胞長滿瓶底時可以傳代；2 超凈工作臺準(zhǔn)備：將試劑瓶、培養(yǎng)瓶等培養(yǎng)用具用酒精噴灑，用消毒紗布擦凈，置于4超凈工作臺酒精燈左側(cè)；3 開蓋：旋開細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶蓋，將瓶蓋側(cè)立于（嚴(yán)禁倒扣放置）酒精燈旁，將培養(yǎng)瓶內(nèi)液體（舊培養(yǎng)基）倒入 15 mL 離心管， 3000 rpm/min 離心 5 min 備用。培養(yǎng)瓶瓶口、瓶蓋以及離心管管口、管蓋均需過酒精燈火焰后再蓋好；4 清洗細(xì)胞表面：打開移液管盒，用普鑷捏住移液管（ 5mL ）后部從盒子中拖出（注意移液管的管壁和管口不能碰到其他物品） ，安裝好加液槍，移液管管口和管壁均過酒精燈火焰。酌情吸取 2-4 mL EDTA 溶液，清洗

13、細(xì)胞表面，去掉殘留的舊培養(yǎng)基以及漂浮的死細(xì)胞，再倒棄 EDTA 溶液；5 胰酶消化：用移液管吸取2 mL 胰蛋白酶，從培養(yǎng)瓶側(cè)面加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，蓋好瓶蓋后，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)80% 的細(xì)胞收回突起變圓時，立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離胰酶；6 中和消化：用移液管吸取舊培養(yǎng)基上清液3 mL （也可用新鮮生長培養(yǎng)基），加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，終止胰酶消化，并反復(fù)輕輕吹打消化好的細(xì)胞使其脫離瓶壁并分散；7 沉淀細(xì)胞：將細(xì)胞懸液吸入15 mL 的離心管中， 1000 rpm/min 離心 8 分鐘，獲得細(xì)胞沉淀；8 加入新鮮培養(yǎng)基：倒棄上清液，保留細(xì)胞沉淀（注意只能倒一次，不能反復(fù)倒），然后用另一新移液管

14、吸取10 mL 的新鮮培養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶中5mL ，余下 5mL 加入離心管內(nèi)懸浮細(xì)胞沉淀，吸取離心管中的細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，與另外5mL 培養(yǎng)基混勻；9 接種細(xì)胞：吸取5 mL 上述的細(xì)胞懸液，加入另一個新細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，接種后2 個培養(yǎng)瓶中的懸液各 5 mL；10. 靜置培養(yǎng)：蓋上瓶蓋，擰緊，標(biāo)記（包括細(xì)胞名稱、代數(shù)、傳代日期），放入常規(guī)的生化培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)（如果放入CO 2 培養(yǎng)箱，瓶蓋擰緊后再稍回轉(zhuǎn)）；11. 觀察細(xì)胞：每天觀察細(xì)胞生長狀況，并確定是否進(jìn)行第2 代的傳代。【注意事項(xiàng)】1. 傳代培養(yǎng)時要注意無菌操作，所有操作要盡量靠近酒精燈火焰，手不能在瓶口上方操作，以免污染氣體進(jìn)入瓶

15、內(nèi)。要防止細(xì)胞之間的交叉污染，每次最好只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作，每一種細(xì)胞使用一套器材。每種試劑使用一個移液管，培養(yǎng)用液要嚴(yán)格分開。2. 堅(jiān)持每天觀察細(xì)胞，生長致密時即可傳代。如發(fā)現(xiàn)有污染跡象，應(yīng)丟棄污染的細(xì)胞。3. 細(xì)胞消化時要注意觀察，不要消化過度，否則細(xì)胞不宜存活。吹打細(xì)胞時，確保瓶壁所有地方均吹打到，吹打時動作要輕柔，不要用力過大，以防細(xì)胞破碎。4. 培養(yǎng)箱不要反復(fù)多次開關(guān)，以免影響溫度的穩(wěn)定和增加污染的機(jī)率?！舅伎碱}】1. 貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法及注意事項(xiàng)。2. 常用的細(xì)胞消化液有哪些？各種消化液的作用原理分別是什么？3. 懸浮生長的細(xì)胞如何傳代培養(yǎng)？5實(shí)驗(yàn)三魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)（組織塊法）

16、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)的組織塊法。2. 了解細(xì)胞原代培養(yǎng)的酶消化法和機(jī)械分離法?！緦?shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)常用方法有組織塊法、酶消化法和機(jī)械分離法等。組織塊法是直接從生物體獲取組織，切割成微小的組織塊，然后貼附于培養(yǎng)瓶底部，通過培養(yǎng)液供給營養(yǎng)，在合適的溫度中孵育，讓組織塊周邊慢慢地長出細(xì)胞來，經(jīng)消化傳代，獲得大量均一的細(xì)胞，用于傳代培養(yǎng)和相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。【試劑、材料與儀器】試劑： MEM培養(yǎng)基， GPS，兩性霉素B，硫酸慶大霉素，表皮生長因子（EGF ），成纖維生長因子（FGF ）材料：試驗(yàn)幼魚，原代培養(yǎng)瓶，無菌培養(yǎng)皿，移液管（5 mL ），無菌離心管（

17、15 ml ），解剖探針，手術(shù)剪，眼科剪，眼科鑷，手術(shù)刀，醫(yī)用酒精，燒杯（250 mL ），廢液缸，普鑷，酒精燈，打火機(jī)，消毒紗布，酒精噴壺，記號筆，橡膠手套，封口膜儀器：生化培養(yǎng)箱或CO 2 培養(yǎng)箱，倒置生物顯微鏡，超凈工作臺，加液槍，4冰箱【實(shí)驗(yàn)分組】實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行，每組4 人，每班20 人，共分5 組，每組中分別取肌肉、鰭條、肝和鰾4 種組織。【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 試劑配制抗生素培養(yǎng)基（AIM ）： 90 mL 培養(yǎng)液（ 2MEM ） + 5 mL GPS （ 10） +5 mL 兩性霉素 B（ 250 g/mL） +1 mL 硫酸慶大霉素（ 50 mg/mL ）混合， 4保存?zhèn)溆?。原代培養(yǎng)基

18、： 80 mL 培養(yǎng)液+ 2 mL GPS (10 ) + 20 mL FBS + EGF （ 2 g/mL）+ FGF（ 25 ng/mL ）混合， 4保存?zhèn)溆?。傳代培養(yǎng)基：90 mL 培養(yǎng)液+ 1 mL GPS (10 ) + 10 mL FBS 混合， 4保存?zhèn)溆谩?. 組織分離和細(xì)胞培養(yǎng)工作前打開超凈工作臺上的紫外燈，滅菌 30 分鐘后， 關(guān)閉紫外燈， 打開吹風(fēng)和照明燈；帶橡膠手套，用酒精擦拭消毒雙手；超凈工作臺面用酒精噴灑，再用消毒紗布擦凈。在超凈工作臺中擺放好培養(yǎng)皿、移液管和培養(yǎng)瓶。將滅過菌的手術(shù)器械（解剖刀2 把，眼科鑷2 把，眼科剪1 把）插入盛有醫(yī)用酒精的玻璃燒杯中浸泡備用。

19、以下操作均在超凈臺里進(jìn)行：1) 殺幼魚與消毒體表：用解剖探針破壞幼魚腦后，將幼魚置于酒精中，浸泡30 秒。62) 取肌肉與鰭條： 用消毒紗布托住魚體， 用手術(shù)剪取下鰭條或背部肌肉， 并置于盛有 AIM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（ 1）內(nèi)浸泡消毒，培養(yǎng)皿上寫上組織名稱。3) 用紗布擦去手術(shù)器械上的殘余組織，將手術(shù)器械放入盛有醫(yī)用酒精的燒杯中涮洗浸泡。用眼科剪打開體腔，用眼科鑷取出肝或鰾，并置于盛有AIM的培養(yǎng)皿（ 2）內(nèi)浸泡消毒，培養(yǎng)皿上寫上組織名稱。注意：取體表和體內(nèi)不同的組織時，手術(shù)器械應(yīng)分開并浸泡消毒，防止組織細(xì)胞交叉污染。4)組織塊在 AIM內(nèi)浸泡 2 小時，每半小時換1 次 AIM 培養(yǎng)基。換液

20、方法：涮洗AIM中的組織塊，倒去舊液，用移液管吸取新鮮AIM 加入培養(yǎng)皿內(nèi)。5) 用眼科鑷夾取組織塊，移入無菌培養(yǎng)皿（3）內(nèi)，用手術(shù)刀切除和刮去多余的組織，如脂肪和壞死組織，血液、筋膜等，再用新移液管吸AIM 清洗組織塊1-2 次。6) 將組織塊移入無菌培養(yǎng)皿（ 4）內(nèi)，用手術(shù)刀將組織塊切成約 1mm2 的小塊，用新移液管吸取 AIM 少量，將組織碎塊浸潤。7) 打開培養(yǎng)瓶蓋，用新移液管吸取濕潤的微小組織塊（約20-30 個），接種于 25 cm2 培養(yǎng)瓶底部，用移液管將組織塊涂抹均勻，培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋過酒精燈火焰后再蓋好擰緊，培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記（包括組織名稱和原代培養(yǎng)日期）。8) 將培養(yǎng)瓶拿到

21、培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置貼壁 2 小時，再將培養(yǎng)瓶側(cè)放半小時，用移液管將殘余液體吸出。9) 用新移液管從細(xì)胞培養(yǎng)瓶側(cè)面緩慢加入 4-5 mL 原代 培養(yǎng)基， 培養(yǎng)瓶保持豎立， 培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋過酒精燈火焰后再蓋好擰緊。小心將細(xì)胞培養(yǎng)瓶拿入培養(yǎng)箱內(nèi)，緩慢輕柔地將培養(yǎng)瓶平放（讓培養(yǎng)基慢慢浸潤組織塊，避免組織塊脫離瓶壁漂?。o置培養(yǎng)。10)注意觀察細(xì)胞生長情況，大約 1-2 周后， 細(xì)胞開始從組織塊底部延伸出來。當(dāng)細(xì)胞長滿時，可消化傳代，原瓶可保留繼續(xù)生長細(xì)胞?！咀⒁馐马?xiàng)】1 盡量選取幼年的生物體組織或者繁殖能力較強(qiáng)的組織，如幼魚、胚胎、腫瘤組織等，作為實(shí)驗(yàn)材料。2 原代培養(yǎng)時要注意無菌操作，所有操作要盡量

22、靠近酒精燈火焰，手不能在瓶口上方操作，以免污染氣體進(jìn)入瓶內(nèi)。要防止組織之間的交叉污染，注意更換移液管。3 組織塊要靜置貼壁2 小時，能黏附于瓶壁時，再與加入培養(yǎng)液，操作要輕且緩慢，勿使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有貼壁，細(xì)胞則不易生長。 如組織塊漂浮， 需重新貼壁！【思考題】1. 細(xì)胞原代培養(yǎng)（組織塊法）的方法及注意事項(xiàng)。2. 常用的細(xì)胞原代培養(yǎng)方法有哪些？分別適用于哪些組織？7實(shí)驗(yàn)四細(xì)胞的凍存【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.掌握細(xì)胞保存的方法2.熟悉細(xì)胞凍存的原理【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時脫離生長狀態(tài)而保持細(xì)胞特性，在需要的時候

23、再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。凍存細(xì)胞還起到了細(xì)胞保種的作用，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種。細(xì)胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑二甲基亞砜（DMSO ，終濃度5 - 15% ），可使溶液冰點(diǎn)降低，在緩慢凍結(jié)條件下，細(xì)胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷。采用 “慢凍快融 ”的方法能較好地保證細(xì)胞的存活。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開始為-1- -2 /min ，當(dāng)溫度低于 - 25時可加速，到- 80之后可直接投入液氮內(nèi)（-196 ）。【試劑、材料與儀器】試劑：生長培養(yǎng)基 （ PRMI-1640或 MEM ，添加 10%小牛血清或胎牛血清） ，0.25%胰蛋白酶， 0.2% EDTA ，

24、二甲基亞砜（DMSO ），液氮，異丙醇材料：凍 存管，移液管（ 2 mL 、5 mL ），無菌離心管，廢液缸，普鑷，酒精燈，打火機(jī)，消毒紗布，醫(yī)用酒精，酒精噴壺，記號筆，橡膠手套，封口膜儀器：倒置生物顯微鏡，超凈工作臺，加液槍，低速離心機(jī)，4冰箱， -80冰箱，程序降溫盒，液氮罐，制冰機(jī)【實(shí)驗(yàn)分組】實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行，每組4 人，每班20 人，共分5 組?！緦?shí)驗(yàn)步驟】工作前打開超凈工作臺上的紫外燈，滅菌 30 分鐘后， 關(guān)閉紫外燈， 打開吹風(fēng)和照明燈；帶橡膠手套，用酒精擦拭消毒雙手；超凈工作臺面用酒精噴灑，再用消毒紗布擦凈。程序降溫盒盛裝異丙醇，使用前4預(yù)冷。在超凈工作臺中擺放好凍存管、移液管、離心

25、管和試劑瓶。凍存管上作好標(biāo)記，包括細(xì)胞名稱，代數(shù)和凍存日期。1.收集細(xì)胞：取待凍存的細(xì)胞，倒棄舊液，用移液管吸取2-4 mL EDTA 清洗細(xì)胞表面，棄去，再吸取2 mL 胰蛋白酶加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，消化1-2 分鐘，輕輕拍打瓶側(cè)，使細(xì)胞脫離瓶底。加入2 mL 培養(yǎng)基將細(xì)胞輕輕吹打沖洗下來，移入15 mL 離心管， 10008rpm/min 離心 7 min ，棄上清，保留離心管底部細(xì)胞沉淀。2.細(xì)胞凍存液的配制：在 15 mL 離心管中依次加入： DMSO 0.6 mL 、新鮮培養(yǎng)液1.8 mL和血清 0.6 mL ，作為 A 液（ 3 mL ）。輕輕吹打混勻，離心管加蓋后立即插入冰里。注意吸取

26、試劑時，移液管均需更換，不能混用。3.凍存細(xì)胞：在 1 步獲得的細(xì)胞沉淀中，加入3 mL 培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，制成細(xì)胞懸?。?B 液）。吸取細(xì)胞懸液（ B 液）與 A 液均勻混合?；旌蠒r，從離心管底部向上緩慢拖著滴加，邊加邊轉(zhuǎn)動移液管，使細(xì)胞與凍存液充分混勻?；旌虾蠹?xì)胞懸液為6 mL ，分裝于凍存管中，每管1-1.5 mL ，蓋好凍存管蓋，放入盛有異丙醇的程序降溫盒中，立即放入 -80， 24 小時后，將裝有細(xì)胞的凍存管轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)，并做好記錄?！咀⒁馐马?xiàng)】1 凍存液需現(xiàn)配現(xiàn)用，配制好后放置在冰中，保持低溫。凍存液中含20% 血清和 10%DMSO ，配制時添加血清和DMSO 要錯開，即血清

27、和 DMSO 二者不能直接混合。2 程序降溫盒要提前裝好異丙醇，且4預(yù)冷。3 凍存管內(nèi)細(xì)胞的密度通常為105-106 個 / mL ，一般鋪滿一個25 cm2 的細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞量可以凍存 1-2mL 。4 準(zhǔn)備進(jìn)行凍存的細(xì)胞，要處于對數(shù)生長期，即細(xì)胞傳代后24h 左右，且細(xì)胞生長狀態(tài)良好，這樣才能保證凍存細(xì)胞復(fù)蘇時，有較高的存活率。5 要準(zhǔn)確記錄凍存細(xì)胞的種類，代數(shù)，凍存時間和凍存者的姓名。【思考題】1 為什么要配制細(xì)胞凍存（A 液），并將細(xì)胞懸液（B 液）與之混合？2 凍存細(xì)胞時，為什么要加入二甲基亞砜？為什么要緩慢降溫？9實(shí)驗(yàn)五細(xì)胞的復(fù)蘇【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握細(xì)胞復(fù)蘇的方法2. 熟悉細(xì)胞

28、復(fù)蘇的原理【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞復(fù)蘇時要快速融化，必須將凍存在-196液氮中的細(xì)胞快速融化，使細(xì)胞凍存時產(chǎn)生的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。復(fù)蘇后的細(xì)胞可繼續(xù)進(jìn)行傳代增殖，做實(shí)驗(yàn)材料和再次凍存?！驹噭?、材料與儀器】試劑：生長培養(yǎng)基（PRMI-1640或 MEM ，添加 10%小牛血清或胎牛血清）材料：細(xì)胞培養(yǎng)瓶，移液管（5 mL 、 10 mL ），無菌離心管，廢液缸，普鑷，酒精燈，打火機(jī)，消毒紗布，醫(yī)用酒精，酒精噴壺，記號筆，橡膠手套，封口膜儀器：生化培養(yǎng)箱或CO 2 培養(yǎng)箱，倒置生物顯微鏡，超凈工作臺，加液槍，低速離心機(jī)，水浴鍋，液氮罐【實(shí)驗(yàn)分組】實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)

29、行，每組4 人，每班20 人，共分5 組?！緦?shí)驗(yàn)步驟】工作前打開超凈工作臺上的紫外燈，滅菌 30 分鐘后， 關(guān)閉紫外燈， 打開吹風(fēng)和照明燈；帶橡膠手套，用酒精擦拭消毒雙手；超凈工作臺面用酒精噴灑，再用消毒紗布擦凈。將水浴鍋預(yù)熱至 37，在超凈工作臺中擺放好移液管、離心管和培養(yǎng)瓶。1.取出凍存管： 根據(jù)細(xì)胞凍存記錄找到所需細(xì)胞存放之處，從液氮罐中取出待復(fù)蘇細(xì)胞。2.迅速解凍：立即將凍存管放入37溫水中迅速解凍，要不斷晃動凍存管，大約在1min內(nèi)使凍存管內(nèi)液體完全溶解。取出凍存管，酒精噴灑擦拭凍存管蓋周邊，拿入超凈工作臺。3.加培養(yǎng)液：吸取凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液，加入離心管，再向離心管內(nèi)加入5-8 m

30、L 生長培養(yǎng)液， 1000 rpm/min 離心 8min，獲得細(xì)胞沉淀。倒棄上清，加入4-5 mL 生長培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻細(xì)胞，將細(xì)胞移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶。4. 貼壁與換液： 將細(xì)胞于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 24 小時，觀察細(xì)胞貼壁情況。 吸去舊液， 加入新鮮生長培養(yǎng)基。10【注意事項(xiàng)】1. 細(xì)胞復(fù)蘇時，注意融化凍存細(xì)胞速度要快，可不時搖動冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段（ -5 0）。這樣復(fù)蘇的凍存細(xì)胞存活率高，細(xì)胞生長及形態(tài)良好。2.由于凍存的細(xì)胞中會有部分細(xì)胞死亡，靜置培養(yǎng)24 小時后，可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上的死細(xì)胞棄去，更換新鮮培養(yǎng)液。3. 如果凍存的細(xì)胞保存時間較長或之前細(xì)胞復(fù)蘇時，

31、細(xì)胞存活率不高，可以直接在培養(yǎng)瓶內(nèi)加入凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液和5 mL 的新鮮培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)10-12h 后，更換新鮮培養(yǎng)基?！舅伎碱}】1 復(fù)蘇細(xì)胞時，為什么要快速融化？2 如果凍存管內(nèi)的細(xì)胞密度偏低，復(fù)蘇時如何處理？11實(shí)驗(yàn)六染色體制備【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握培養(yǎng)細(xì)胞的染色體的制備方法2. 熟悉細(xì)胞染色體制備的原理【實(shí)驗(yàn)原理】每一物種的細(xì)胞一般都具有一定數(shù)目、形狀和大小的染色體。在秋水仙素的作用下可使分裂細(xì)胞阻斷在中期，此時染色體形態(tài)最典型，然后通過低滲、固定、染色等步驟，便可在顯微鏡下呈現(xiàn)出其形態(tài)?！驹噭⒉牧吓c儀器】試劑：生長培養(yǎng)基 （ PRMI-1640或 MEM ，添加 10%小牛血清或胎牛血清） ，0.25%胰蛋白酶， 0.2% EDTA ， PBS，冰醋酸，甲醇，秋水仙堿，95% 乙醇， HCl， Giemsa 染液，雙蒸水材料：細(xì)胞培養(yǎng)瓶，移液管（5 mL 、10 mL ），無菌離心管，載玻片，膠頭滴管，染色缸，廢液缸，普鑷，酒精燈，打火機(jī)，消毒紗布，醫(yī)用酒精，酒精噴壺，記號筆，橡膠手套，封口膜儀器：生化培養(yǎng)箱或 CO 2 培養(yǎng)箱，倒置生物顯微鏡，超凈工作臺，加液槍，低速離心機(jī)，切片烘干機(jī)，制冰機(jī)，水浴鍋【實(shí)驗(yàn)分組】實(shí)驗(yàn)分組