實(shí)驗(yàn)一小鼠睪丸、附睪及輸精管精子采集、運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)與結(jié)構(gòu)觀察[重要知識(shí)]

1、任課教師：吳雨龍任課教師：吳雨龍 任課班級(jí)：任課班級(jí)：0707級(jí)級(jí) 實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)九 小鼠睪丸、附睪及輸精管精小鼠睪丸、附睪及輸精管精 子采集、運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)與結(jié)構(gòu)觀察子采集、運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)與結(jié)構(gòu)觀察 實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)九 小鼠睪丸、附睪及輸精管精小鼠睪丸、附睪及輸精管精 子采集、運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)與結(jié)構(gòu)觀察子采集、運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)與結(jié)構(gòu)觀察 1 重點(diǎn)輔導(dǎo) 1. 1.認(rèn)識(shí)雄性小鼠睪丸、附睪、輸精管等認(rèn)識(shí)雄性小鼠睪丸、附睪、輸精管等 生殖器官結(jié)構(gòu)及位置特點(diǎn)；生殖器官結(jié)構(gòu)及位置特點(diǎn)； 2.2.掌握小鼠睪丸、附睪及輸精管精子采掌握小鼠睪丸、附睪及輸精管精子采 集方法；集方法； 3.3.掌握血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法精子計(jì)數(shù)和運(yùn)動(dòng)掌握血細(xì)

2、胞計(jì)數(shù)板法精子計(jì)數(shù)和運(yùn)動(dòng) 能力檢查的方法；能力檢查的方法； 4.4.通過(guò)睪丸、附睪及輸精管精子運(yùn)動(dòng)能通過(guò)睪丸、附睪及輸精管精子運(yùn)動(dòng)能 力檢測(cè)，認(rèn)識(shí)精子在睪丸產(chǎn)生后，在力檢測(cè)，認(rèn)識(shí)精子在睪丸產(chǎn)生后，在 附睪內(nèi)成熟的過(guò)程；附睪內(nèi)成熟的過(guò)程； 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?2 重點(diǎn)輔導(dǎo) 5. 5. 掌握精子抹片方法；掌握精子抹片方法； 6. 6. 掌握染色法進(jìn)行精子結(jié)構(gòu)觀察和頂體掌握染色法進(jìn)行精子結(jié)構(gòu)觀察和頂體 結(jié)構(gòu)觀察的方法，認(rèn)識(shí)精子的正常結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)觀察的方法，認(rèn)識(shí)精子的正常結(jié)構(gòu)； 7. 7. 使學(xué)生得到小鼠精子操作的基礎(chǔ)訓(xùn)練。使學(xué)生得到小鼠精子操作的基礎(chǔ)訓(xùn)練。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?3 重點(diǎn)輔導(dǎo) 哺乳動(dòng)物的精子

3、哺乳動(dòng)物的精子在睪丸內(nèi)形成，并必須經(jīng)過(guò)在睪丸內(nèi)形成，并必須經(jīng)過(guò) 在附睪內(nèi)發(fā)生一系列形態(tài)、生理和生化方面的在附睪內(nèi)發(fā)生一系列形態(tài)、生理和生化方面的 變化而最終達(dá)到成熟，才能獲得向前運(yùn)動(dòng)的能變化而最終達(dá)到成熟，才能獲得向前運(yùn)動(dòng)的能 力，這種向前運(yùn)動(dòng)能力的獲得是精子受精能力力，這種向前運(yùn)動(dòng)能力的獲得是精子受精能力 的重要指標(biāo)。哺乳動(dòng)物精子包括頭部和尾部?jī)傻闹匾笜?biāo)。哺乳動(dòng)物精子包括頭部和尾部?jī)?個(gè)主要部分，頸部介于頭部和尾部之間，形成個(gè)主要部分，頸部介于頭部和尾部之間，形成 頭部和尾部的連接。精子頭部主要由核組成，頭部和尾部的連接。精子頭部主要由核組成， 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 4 重點(diǎn)輔導(dǎo) 頭部頂端是頂

4、體，頂體包圍核的前端形成帽狀。頭部頂端是頂體，頂體包圍核的前端形成帽狀。 精子頸部變細(xì)并形成頭部和尾部的連接。尾部精子頸部變細(xì)并形成頭部和尾部的連接。尾部 是精子的運(yùn)動(dòng)器官，可以分為中段、主段和末是精子的運(yùn)動(dòng)器官，可以分為中段、主段和末 端。端。 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 5 重點(diǎn)輔導(dǎo) 1. 1. 設(shè)備與器材：設(shè)備與器材：實(shí)體顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、實(shí)體顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、 恒溫水浴鍋、注射器、注射針頭、吸管、恒溫水浴鍋、注射器、注射針頭、吸管、 試管試管架、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、剪刀、解剖刀、架、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、剪刀、解剖刀、 解剖鑷、載玻片、蓋玻片等。解剖鑷、載玻片、蓋玻片等。 實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)用品 2. 2. 藥

5、品、試劑：藥品、試劑： 精子操作液（精子操作液（CZB液或液或KSOM液）、液）、0.5%龍龍 膽紫酒精液、膽紫酒精液、36%甲醛溶液、磷酸緩沖液甲醛溶液、磷酸緩沖液 （PH6.8）、精子固定液（福爾馬林磷酸鹽）、精子固定液（福爾馬林磷酸鹽 緩沖液）、吉姆薩工作液。緩沖液）、吉姆薩工作液。 6 重點(diǎn)輔導(dǎo) 實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)用品 3. 3. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 選擇選擇60日齡以上，體重達(dá)到日齡以上，體重達(dá)到32-35g的昆明種的昆明種 公鼠。公鼠。 7 重點(diǎn)輔導(dǎo) 1. 1. 精子采集：精子采集： 左手捏小鼠尾部，右手持鑷子，或以圖左手捏小鼠尾部，右手持鑷子，或以圖3-13-1所所 示方法，以頸部脫

6、臼法處死小鼠。使處死的小鼠示方法，以頸部脫臼法處死小鼠。使處死的小鼠 仰臥，用仰臥，用75%75%的酒精棉球消毒腹部開(kāi)口部位被毛的酒精棉球消毒腹部開(kāi)口部位被毛 及皮膚。剪開(kāi)腹壁，暴露生殖系統(tǒng)。無(wú)菌分離睪及皮膚。剪開(kāi)腹壁，暴露生殖系統(tǒng)。無(wú)菌分離睪 丸、附睪及輸精管。在含培養(yǎng)液的表面皿中，用丸、附睪及輸精管。在含培養(yǎng)液的表面皿中，用 眼科剪除去睪丸、附睪及輸精管周圍的系膜及脂眼科剪除去睪丸、附睪及輸精管周圍的系膜及脂 肪，并沖洗干凈，以免血液或脂肪球混入液體妨肪，并沖洗干凈，以免血液或脂肪球混入液體妨 礙精子觀察。礙精子觀察。 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法 8 重點(diǎn)輔導(dǎo) 將分離并清洗干凈的睪丸、附睪及輸精管，

7、用眼將分離并清洗干凈的睪丸、附睪及輸精管，用眼 科剪再分離為睪丸、附睪尾及附帶的小段輸精管、科剪再分離為睪丸、附睪尾及附帶的小段輸精管、 其余部分的輸精管其余部分的輸精管3 3部分，棄去附睪頭。采集睪丸部分，棄去附睪頭。采集睪丸 精子時(shí)，將睪丸橫切為如干段或組織塊，放在表精子時(shí)，將睪丸橫切為如干段或組織塊，放在表 面皿中，加面皿中，加1ml1ml培養(yǎng)液，用眼科剪輕輕擠壓睪丸組培養(yǎng)液，用眼科剪輕輕擠壓睪丸組 織塊，把精子擠入培養(yǎng)液中，去掉組織塊。置織塊，把精子擠入培養(yǎng)液中，去掉組織塊。置 3737、5%CO5%CO2 2、飽和濕度培養(yǎng)箱孵育、飽和濕度培養(yǎng)箱孵育20min20min，使，使 精子自

8、行散開(kāi)。精子自行散開(kāi)。 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法 9 重點(diǎn)輔導(dǎo) 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法 采集附睪尾精子時(shí)，將其剪成幾段。采集輸精管采集附睪尾精子時(shí)，將其剪成幾段。采集輸精管 精子時(shí)，由于小鼠輸精管非常細(xì)，不能直接沖洗精子時(shí)，由于小鼠輸精管非常細(xì)，不能直接沖洗 管腔，將輸精管放入含有管腔，將輸精管放入含有1ml1ml培培養(yǎng)液的表面皿內(nèi)，養(yǎng)液的表面皿內(nèi)， 在實(shí)體顯微鏡下，用一只眼科異物針固定輸精管，在實(shí)體顯微鏡下，用一只眼科異物針固定輸精管， 用另一支異物針向相反方向縱向撕開(kāi)輸精管，精用另一支異物針向相反方向縱向撕開(kāi)輸精管，精 子會(huì)浮游到培養(yǎng)液中。將大塊輸精管組織撥開(kāi)，子會(huì)浮游到培養(yǎng)液中。將大塊輸精管組織撥開(kāi)，

9、 用吸管連同精子吸出液體部分，裝于用吸管連同精子吸出液體部分，裝于2ml具塞試具塞試 管中暫存。管中暫存。 10 重點(diǎn)輔導(dǎo) 2. 2. 精子運(yùn)動(dòng)能力檢查：精子運(yùn)動(dòng)能力檢查： 用滴管吸取精液，放于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)用滴管吸取精液，放于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù) 室與蓋玻片接觸處，使精液自然流入計(jì)數(shù)室中。室與蓋玻片接觸處，使精液自然流入計(jì)數(shù)室中。 計(jì)數(shù)中間計(jì)數(shù)中間5 5個(gè)中方格（對(duì)角個(gè)中方格（對(duì)角5 5個(gè)或四角及中間）內(nèi)個(gè)或四角及中間）內(nèi) 8080個(gè)小方格的精子數(shù)，計(jì)數(shù)值為個(gè)小方格的精子數(shù)，計(jì)數(shù)值為X X0 0計(jì)算時(shí)，先計(jì)計(jì)算時(shí)，先計(jì) 數(shù)死精子的數(shù)死精子的X X1 1值，然后計(jì)數(shù)板置于值，然后計(jì)數(shù)板置于5

10、050水浴鍋中水浴鍋中 的搪瓷盤中，在的搪瓷盤中，在50 50 條件下條件下5 510min10min殺死精子，殺死精子， 計(jì)數(shù)總精子數(shù)計(jì)數(shù)總精子數(shù)X X2 2值，（值，（ X X2 2 X X1 1 ）/ X/ X2 2為表示精子為表示精子 運(yùn)動(dòng)能力的精子活力值。計(jì)數(shù)時(shí)每份精子用運(yùn)動(dòng)能力的精子活力值。計(jì)數(shù)時(shí)每份精子用3 3個(gè)計(jì)個(gè)計(jì) 數(shù)板重復(fù)計(jì)數(shù)數(shù)板重復(fù)計(jì)數(shù)3 3次，取平均值。次，取平均值。 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法 11 重點(diǎn)輔導(dǎo) 3. 3. 精子整體結(jié)構(gòu)觀察：精子整體結(jié)構(gòu)觀察： 取取1 1小滴保存精液在載玻片上，將樣品滴以拉小滴保存精液在載玻片上，將樣品滴以拉 的形式制成抹片。用的形式制成抹片。用

11、0.5%0.5%龍膽紫酒精液染色龍膽紫酒精液染色3min3min， 自然干燥，水洗后鏡檢。鏡下可觀察到大多數(shù)為自然干燥，水洗后鏡檢。鏡下可觀察到大多數(shù)為 結(jié)構(gòu)正常的精子，部分為結(jié)構(gòu)正常的精子，部分為畸形精子畸形精子，如，如頭部畸形頭部畸形 （如頭部巨大、瘦小、細(xì)長(zhǎng)、圓形、輪廓不明顯、（如頭部巨大、瘦小、細(xì)長(zhǎng)、圓形、輪廓不明顯、 皺縮、缺損、雙頭等）、頸部畸形皺縮、缺損、雙頭等）、頸部畸形 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法 12 重點(diǎn)輔導(dǎo) 3. 3. 精子整體結(jié)構(gòu)觀察：精子整體結(jié)構(gòu)觀察： （頸部膨大、纖細(xì)、屈折、不全、雙體等）、尾（頸部膨大、纖細(xì)、屈折、不全、雙體等）、尾 部中段畸形（膨大、纖細(xì)、彎曲、屈折、不

12、全、部中段畸形（膨大、纖細(xì)、彎曲、屈折、不全、 雙體等）、尾部主段畸形，然后分類計(jì)數(shù)。有的雙體等）、尾部主段畸形，然后分類計(jì)數(shù)。有的 精子尾部發(fā)育未完成，為未成熟精子，可計(jì)為畸精子尾部發(fā)育未完成，為未成熟精子，可計(jì)為畸 形精子。形精子。 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法 13 重點(diǎn)輔導(dǎo) 4. 4. 精子頂體結(jié)構(gòu)觀察：精子頂體結(jié)構(gòu)觀察： 精液抹片自然干燥精液抹片自然干燥101020min20min，以，以1 1 2ml2ml的福的福 爾馬林磷酸緩沖液固定爾馬林磷酸緩沖液固定15min,15min,水洗后自然干燥。水洗后自然干燥。 用姬姆薩工作液染色用姬姆薩工作液染色90min90min，水洗，風(fēng)干。置于，水洗，

13、風(fēng)干。置于 10001000倍顯微鏡下用油鏡觀察，計(jì)數(shù)頂體異常精子。倍顯微鏡下用油鏡觀察，計(jì)數(shù)頂體異常精子。 鏡下可觀察到大多數(shù)精子鏡下可觀察到大多數(shù)精子頂體結(jié)構(gòu)正常頂體結(jié)構(gòu)正常，部分精，部分精 子子頂體異常頂體異常，精子頂體異常主要表現(xiàn)為腫脹、缺，精子頂體異常主要表現(xiàn)為腫脹、缺 損、部分或完全脫落。損、部分或完全脫落。 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法 14 重點(diǎn)輔導(dǎo) 剖開(kāi)小鼠腹腔時(shí)，剪刀頭要向上，以避剖開(kāi)小鼠腹腔時(shí)，剪刀頭要向上，以避 免剪破腹腔血管和內(nèi)臟，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的免剪破腹腔血管和內(nèi)臟，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的 觀察。觀察。 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 15 重點(diǎn)輔導(dǎo) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 1. 1.雄性小鼠的生殖器官主要由哪幾個(gè)部分組成？雄性小鼠的生殖器官主要由哪幾個(gè)部分組成？ 2.2.繪制小鼠精子結(jié)構(gòu)圖？繪制小鼠精子結(jié)構(gòu)圖？ 3.3