細(xì)胞復(fù)蘇及冷凍.doc

1、細(xì)胞復(fù)蘇及冷凍細(xì)胞培養(yǎng)基及凍存液的配制細(xì)胞培養(yǎng)基的配制 ,注意事項(xiàng) , 為了避免不小心污染造成的浪費(fèi)，一般用50ml 管分裝配制。配置比例 ,45ml培養(yǎng)基 ,90%的總體積比例 ,+ 5ml FBS, 血清 ,10%的總體積比例 ,+ 500 L雙抗 ,1:100 的比例 ,雙抗 , 鏈霉素 +青霉素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。細(xì)胞凍存液的配制 ,配置比例 ,5mlDMSO(100%純度，以 10%總體積的比例 )+ 45ml 已配好的培養(yǎng)基 ,90%的總體積比例 ,注意事項(xiàng) , 剛配好的細(xì)胞凍存液會(huì)發(fā)熱，需用封口膜封住瓶蓋后, 防止細(xì)菌污染 ,放入冰箱冷凍后再使用。過(guò)熱的凍存液會(huì)使得細(xì)胞死亡,凍存液一般

2、提前一天配好即可，放置太久會(huì)DMSO二甲基亞砜 (Dimethyl sulfoxide):是一種滲透性保護(hù)劑，能夠降低細(xì)胞冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，減輕自由基對(duì)細(xì)胞損害，因其抗凍作用，可用于細(xì)胞的凍存 ;細(xì)胞凍存操作步驟 ,1、打開(kāi)水浴鍋，將培養(yǎng)基和凍存液用封口膠封好加熱至37?。 2 、用酒精噴壺消毒 , 手及潔凈工作臺(tái)表面 , 進(jìn)入工作臺(tái)為防止污染均需酒精噴壺消毒,; 從培養(yǎng)箱中取出要凍存細(xì)胞的培養(yǎng)皿。3、用移液管吸出培養(yǎng)基，棄至廢液缸 , 注意移液管勿碰到廢液缸壁或其他物品 , 避免污染 , 移液管用完后倒插放置待用 , 。4、在培養(yǎng)皿中加入約10ml 的 PBS緩沖液沖洗，用移液管吸除,

3、移液管此時(shí)可以扔掉 , ，若有剩余的少量液體，用移液槍吸除。5、加入 1ml 的 TE，使得細(xì)胞消化 , 解除貼壁狀態(tài) , ，搖勻液體后放入培養(yǎng)箱中5min。6、鏡下觀(guān)察細(xì)胞是否消化, 即由扁平的伸展?fàn)顟B(tài)變回圓潤(rùn)的收縮狀態(tài), 此步驟不可省略 , 。7、在每個(gè)培養(yǎng)皿中均加入4ml 培養(yǎng)基，打勻后吸入50ml 離心管 , 因?yàn)榕囵B(yǎng)皿多 ,15ml 離心管顯然不夠用 , 離心 5min,8000rpm, 。8、等待離心的同時(shí)，準(zhǔn)備凍存盒。8.1 、若凍存盒是從冰箱中拿出，一定要升至室溫之后再使用。, 水浴鍋加熱 ,8.2 、檢查凍存盒中是否有異丙醇。, 異丙醇的作用是均勻緩慢降溫, 9 、標(biāo)記好凍存

4、管，細(xì)胞系名稱(chēng)、凍存人、凍存時(shí)間。10、取出離心后的離心管棄上清，盡量吸取干凈，但不要把細(xì)胞吸入。加入凍存液，原則上每盤(pán)培養(yǎng)皿分3 管，每?jī)龃婀芗?ml 凍存液。11、打勻后加入凍存管。12、記得檢查凍存管蓋子是否擰緊。13、先放入 ,80? 冰箱保存，接著放入液氮保存。大量細(xì)胞東村是，最好3 盤(pán)一次操作，防止最后分裝凍存管時(shí)，demo對(duì)細(xì)胞的損害細(xì)胞復(fù)蘇操作步驟 ,1、從液氮中取出細(xì)胞凍存管，放入37?水浴鍋中迅速融化成液態(tài)。, 速融慢凍 ,2、將溶解的細(xì)胞倒入 15ml 離心管，加入 3ml 培養(yǎng)基，離心 5min。 3 、取 10cm培養(yǎng)皿一只，在其內(nèi)加入 10ml 培養(yǎng)基，并做好標(biāo)記。 4 、離心管棄上清。5、從培養(yǎng)皿中吸取1ml 培養(yǎng)基至離心管中打勻后，均勻加入培養(yǎng)皿。6 、行十字法晃動(dòng)，使得細(xì)胞均勻散布，在鏡下觀(guān)察確認(rèn)。7、放入培養(yǎng)箱，箱內(nèi)再行一次十字法晃動(dòng)。細(xì)胞復(fù)蘇凍存的原則快速融化, 緩慢冷凍必