分子生物學(xué)基本操作

1、 量程量程:使用合適量程的槍使用合適量程的槍(移液器移液器) 校對(duì)校對(duì):定期定期 使用使用: 一定在合適量程范圍內(nèi)使用一定在合適量程范圍內(nèi)使用; 槍頭必須插緊槍頭必須插緊, 防止脫落以及吸防止脫落以及吸 樣體積不夠樣體積不夠; 用第一檔吸樣用第一檔吸樣,打出樣品到第二檔打出樣品到第二檔; 吸樣時(shí)防止倒吸吸樣時(shí)防止倒吸; 不要水平放置帶有槍頭的槍不要水平放置帶有槍頭的槍; 使用后掛在槍架上使用后掛在槍架上,不可以亂放不可以亂放 帶手套帶手套 裝槍頭 滅菌 外包報(bào)紙 滅菌后50-70度烘干后使用 帶手套帶手套 0.1to 10 ul clear Tips 0.5 to 10 ul Clear Ti

2、ps 1-200 ul clear Tips 1-200 ul Yellow Tips (Universal Fit) 1-200 ul Clear, graduated (Universal Fit), 1-200 ul Clear, Non-Beveled 1-200 ul Yellow, Non-Beveled 1-200 ul Clear, Extra-Long 100-1300 ul Blue Graduated Tips 100-1000 ul Tips, fit Gilson LTS Pipetor 0.1-10 ul Sterilized Micro-filter Tips 二

3、、旋渦混勻器 0.5-1.5ml管 15%- 40%體積時(shí);試管30% 體積以下， 一、槍混勻 0.2ml管,0.5ml管15% 體積以下 三、手動(dòng)混勻: 顛倒混勻: 0.5-1.5ml管 30%-70%體積時(shí),試管 30%-70%體積; 擦邊混勻: 0.2-0.5ml管 30%體積以下 環(huán)狀雙鏈DNA、不與組蛋白結(jié)合（古菌具 有組蛋白類(lèi)蛋白）、基因總數(shù)水平一般為 103-104，一般情況下，一個(gè)細(xì)胞中只有一 條染色體或一套基因組。 The E. coli genome is a circular double-stranded molecule of DNA; this DNA molecu

4、le is 4,639,675 base pairs in length and encodes 4267 genes. 凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用的技術(shù)。 根據(jù)制備凝膠的材料: 瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳 凝膠 電泳 聚丙烯酰胺電泳 一、瓊脂糖凝膠電泳一、瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖的孔徑大，可以分離長(zhǎng)度為瓊脂糖的孔徑大，可以分離長(zhǎng)度為100bp至至60kb的核酸片斷；的核酸片斷； 聚丙烯酰胺凝膠的孔徑小，可分離小片斷（聚丙烯酰胺凝膠的孔徑小，可分離小片斷（5-50bp）的核酸。）的核酸。 DNADNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，把DNA樣品 加入到一塊包含電解質(zhì)的多

5、孔支持介質(zhì)（瓊脂糖 凝膠）的樣品孔中，并置于靜電場(chǎng)上。由于DNA 分子的雙螺旋骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根殘 基，因此在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。在外加電場(chǎng)作用 下向正極泳動(dòng)。 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與電荷效應(yīng)與 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同， 電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。 1 1、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)原理 瓊脂糖瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成 具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂 糖的濃度。 瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效 應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。因 而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過(guò)程可以 通

6、過(guò)把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而 得到檢測(cè)。凝膠電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的 DNA， 也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，而構(gòu)型不 同的DNA分子。 溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下 發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其 熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣 品DNA濃度。 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： EBEB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作要保持安靜，注意樣品不能混樣。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作要保持安靜，注意樣品不能混樣。 2 2、實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)步驟 1g 瓊脂糖加入100ml 1TAE電泳緩沖液中

7、，搖勻， 在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。 將內(nèi)槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。 將冷卻到65左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地 倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開(kāi)，直到整 個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至 凝膠完全凝固。 充分凝固后小心垂直向上拔出梳子。將凝膠置 入電泳槽中，加1TAE電泳緩沖液至液面覆 蓋凝膠1-2mm。 用移液器吸取總DNA或質(zhì)粒樣品xl于一次性 手套上，再加入一定量的6X/10X loading buffer，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。每加完一 個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣 時(shí)勿碰壞樣品孔周?chē)哪z面。（注意：加樣 前要先記下加樣的順序）。 打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)

8、，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見(jiàn)到 溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，電泳約30min- 60min：當(dāng)指示劑跑過(guò)膠板的2/3，可終止電泳。 將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微 漂洗。 將染色后的凝膠置于紫外透射檢測(cè)儀上，蓋上 防護(hù)觀察罩，打開(kāi)紫外燈，可見(jiàn)到發(fā)出熒光的 DNA條帶。 植物總（核）DNA樣品 應(yīng)呈現(xiàn)一條遷移率很小 的整齊條帶。 質(zhì)粒DNA的存在形式有3種： 共價(jià)閉環(huán)DNA（cccDNA）， 常以超螺旋形式存在； 開(kāi)環(huán)DNA（ocDNA），此種 質(zhì)粒DNA的兩條鏈中有一條 發(fā)生一處或多處斷裂，因此 可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力， 形成松弛的環(huán)狀分子； 線狀DNA，因質(zhì)粒DNA的兩 條鏈在同一處斷裂而造成。 因此質(zhì)粒DNA電泳的結(jié)果中 有可能出現(xiàn)三條泳帶，它們 的泳動(dòng)速度為：cccDNA 線 狀DNA ocDNA。 原質(zhì)粒酶切后質(zhì)粒 ocDNA 線狀DNA cccDNA （1）瓊脂糖含液體量大，可達(dá)98-99%，近似自由 電泳，但是樣品的擴(kuò)散度比自由電泳小。 （2）電泳速度快。 （3）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測(cè) 儀作定量測(cè)定。 （4）樣品易回收，常用于制備。 3、瓊脂糖電泳的優(yōu)點(diǎn) v 配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的 DNA分子大小來(lái)確定。一般瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 適用于大小在0.1kb60kb范圍內(nèi)的DNA片段 瓊脂糖凝膠濃度與線性