NH-陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿的流式細(xì)胞術(shù)檢測

1、 PNH (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria) 是一種罕見的獲得性克隆造血干細(xì)胞疾是一種罕見的獲得性克隆造血干細(xì)胞疾 病。但近年來有增多趨勢。我國北方多于病。但近年來有增多趨勢。我國北方多于 南方。半數(shù)以上發(fā)生在南方。半數(shù)以上發(fā)生在20-4020-40歲青壯年。男歲青壯年。男 性多于女性，與遺傳及種族無關(guān)。本病起性多于女性，與遺傳及種族無關(guān)。本病起 病隱襲緩慢，呈慢性過程，以貧血、出血病隱襲緩慢，呈慢性過程，以貧血、出血 為首發(fā)癥狀者較多，以血紅蛋白尿起病者為首發(fā)癥狀者較多，以血紅蛋白尿起病者 較少。較少。 血紅蛋白尿 睡眠有關(guān)，早晨較重，下午較輕 尿液外

2、觀為醬油或紅葡萄酒樣; 伴乏力、胸骨后及腰腹疼痛、發(fā)熱等 原因 因?yàn)檠a(bǔ)體作用最適宜的pH是，而睡眠 時(shí)呼吸中樞敏感性降低，酸性代謝產(chǎn)物積 聚 研究歷史 Strubing第一次報(bào)道PNH Ham 和Dingle 證明了PNH 患者的紅細(xì) 胞在血清酸化條件下，易發(fā)生溶血，這就 是現(xiàn)在普遍使用的Ham 實(shí)驗(yàn) 1983年證實(shí)PNH患者GPI合成異常 1993年pig-a基因突變 流式細(xì)胞術(shù) 原理： X染色體上PIG-A（造血干細(xì)胞經(jīng)獲得性 體細(xì)胞基因）突變 導(dǎo)致糖化肌醇磷脂(GPI)錨合成障礙 導(dǎo)致由GPI錨接在細(xì)胞膜上的一組膜蛋白 丟失，包括CD16、CD55、CD59等 GPI錨連接蛋白 補(bǔ)體調(diào)接

3、蛋白 衰變加速因子(DAF或CD55)、膜攻擊復(fù)合物抑 制因子(MACIF或MIRL或CD59)、補(bǔ)體C8結(jié)合 蛋白(HRF或C8bp)、膜輔助蛋白(MCP)。 粘附分子 淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-3(LFA-3或CD58)、 Blast-1/ CD48、CD67、CD66。 GPI錨連接蛋白 酶類 紅細(xì)胞乙酰膽堿脂酶 ( AchE )、中性粒細(xì)胞堿性磷 酶酸酶 ( NAP )、5外核酸酶 ( CD 73 )。 受體類 中性粒細(xì)胞III型Fc受體 ( FcRIIIb 或CD16 )、單核細(xì) 胞分化抗原 ( CD14 )、尿激酶型纖溶酶原激活物受 體 ( u-PAR )。 血型抗原 CD55 攜帶的

4、Comer抗原、AchE攜帶的 Yt抗原。 1型細(xì)胞 CD59完全陽性 補(bǔ)體激活途徑 C1 C1 C2,C4 C4b2b (C3轉(zhuǎn)化酶） C3 C3b P （備解素） PC3bBb C3bB (C5轉(zhuǎn)化酶） C4b2b3b或PC3bBb C8 C9 C6C7 C5 C5b C5b678 C5b-9 (MAC) CD59 替代途徑 經(jīng)典途徑 CD55 Ag-Ab 分析 1.紅系及粒系FSC/SSC設(shè)門 報(bào)告標(biāo)本中CD55、CD59陰性比例 做2030份正常人血樣劃定陽性區(qū)（區(qū)）范 圍 同型陰性對照界定區(qū)范圍， 中間的區(qū)域即為區(qū)。 根據(jù)CD59可以將PNH細(xì)胞分為3型 1型細(xì)胞 CD59完全陽性

5、正常細(xì)胞 2型細(xì)胞 CD59部分陽性 補(bǔ)體中度敏感 細(xì)胞 3型細(xì)胞 CD59完全陰性 補(bǔ)體敏感細(xì)胞 CD55和CD59同時(shí)部分或完全缺失是 PNH的典型表現(xiàn)，單GPI缺失不能確診。 CD59重要性大于CD55 單CD55缺乏時(shí)并不因此改變紅細(xì)胞對補(bǔ) 體的敏感性而造成溶血 CD59的缺失會增加補(bǔ)體的敏感性 臨床上以CD59缺失作為診斷標(biāo)準(zhǔn)是一個 趨勢。 解決了一切以補(bǔ)體溶血為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)診斷 方法在診斷PNH的不確定性 意義意義 其它細(xì)胞的PNH檢測 PNH患者的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞 及淋巴細(xì)胞上GPI錨連膜蛋白部分或全部 喪失。 粒細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞 骨髓PNH克隆出現(xiàn)比外周血早，網(wǎng)

6、織紅 細(xì)胞略早于紅細(xì)胞 其它細(xì)胞的PNH檢測 應(yīng)用FSC/SSC設(shè)門分析時(shí)會有許多脫顆粒 的中性粒細(xì)胞，這時(shí)只使用物理特征無法 準(zhǔn)確設(shè)定粒細(xì)胞門了，這時(shí)必須使用系列 標(biāo)志/SSC設(shè)門:CD15，CD33 。 CD64設(shè)門，分析單核CD14,CD55,CD59， PNH病人檢測GPI缺乏的血小板不容易分 辨 不能只根據(jù)淋巴細(xì)胞上GPI相關(guān)蛋白的表 達(dá)來診斷。 與其他實(shí)驗(yàn)比較 1.酸溶血試驗(yàn)(Ham試驗(yàn)) 患者紅細(xì)胞與含5%鹽 酸的正常同型血清混合，37孵育2小時(shí)， 溶血明顯。本試驗(yàn)特異性高，敏感性差。 2.蛇毒因子溶血試驗(yàn)蛇毒因子能通過補(bǔ)體交替 途徑，使補(bǔ)體敏感的紅細(xì)胞發(fā)生溶血。本試 驗(yàn)特異性強(qiáng)

7、，敏感性優(yōu)于酸溶血試驗(yàn)。 3.熱溶血試驗(yàn)和蔗糖溶血試驗(yàn) 因特異性差，常 作為篩選方法。 具有PNH克隆的血液病 檢測粒細(xì)胞GPI 錨連蛋白表達(dá) 病種 檢測例數(shù) 缺失例數(shù)( % ) AA 115 25 ( 22 % ) MDS 39 9 ( 23% ) 并發(fā)現(xiàn) MDS有 PNH表達(dá)者 ATG（人胸腺細(xì)胞免人胸腺細(xì)胞免 疫球蛋白）疫球蛋白）治療有效 ( An Intern Med 1999，131: 401 ) PNH和AA關(guān)系 相當(dāng)密切，可以相互轉(zhuǎn)化且并存 AAPNH較多(15%)，PNHAA少 20%30% PNH可伴骨髓再障 AA(ATG治療后)PNH 1031% AA-PNH綜合征 16.

8、5%(我國) 50%AA外周血或骨髓可檢出PNH克隆 AAPNH 生存率要高于PNHAA MDS-RA 如撿出PNH克隆者預(yù)后好，且ATG(人胸人胸 腺細(xì)胞免疫球蛋白腺細(xì)胞免疫球蛋白) )治療有效。 PNH對AA和MDS的“自然治療”，而“AA救了 PNH” 。 PNH 克隆見于淋巴增殖性疾病 檢測病種 例數(shù) NHL 87 HD 55 紅細(xì)胞 CD55/CD59 CLL 49 缺失檢出率 9.2% ALL 22 HCL 4 (Hematol J 2001，2: 33) PNH克隆見于漿細(xì)胞病 檢測紅細(xì)胞 CD55/CD59 缺失 病種 檢測例數(shù) 缺失例數(shù) (%) MM 62 6 WM 7 2

9、MGUS 6 1 HCD 2 1 合計(jì) 77 10 (12.9%) (Int J Hematol 2002, 75 :40) FLAER 嗜水氣單胞菌溶素變異體(FLAER)。 1998年Diep等報(bào)道嗜水氣單胞菌(HEC)毒 素能特異地與細(xì)胞膜上GPI錨連蛋白結(jié)合， 隨后立即聚合成多具體，插入細(xì)胞膜脂質(zhì) 雙層，在膜上形成孔洞致溶破。 PNH細(xì)胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持細(xì) 胞完好。 FLAER FLAER在所有具有GPI錨連蛋白的白細(xì)胞 上都有特異性表達(dá)，所以正常人及非 PNH貧血FLAER成100%陽性。 是目前診斷PNH最敏感、特異的方法。 FLAER對PNH克隆檢出的敏感性為0.1%， 其它靶向標(biāo)記檢出率的敏感性為1%； 結(jié)果分析 1.設(shè)門 CD45/SSC 2.標(biāo)記CD15，CD14，CD45，F(xiàn)LAER 檢測PNH粒、單核及淋巴細(xì)胞，報(bào)告 標(biāo)本中各系細(xì)胞FLAER陰性比例 FLAER 目前FLAER一般用于有核細(xì)胞的檢測，不 能評價(jià)紅細(xì)胞的PNH克隆。 由于紅細(xì)胞表面沒有氣單胞菌溶素前體產(chǎn) 生所需要的蛋白水解酶類，盡管表達(dá)在紅 細(xì)胞表面的血型糖蛋白不是錨連蛋白，但 是由于血型糖蛋白與氣單胞菌溶素前體結(jié) 合力較弱，因此限制了FLAER在紅細(xì)胞中 的應(yīng)用。 與與CD55CD55、CD59C