層析柱的一些總結(jié)

1、.多數(shù)微生物堿性蛋白酶不耐熱，堿土金屬，特別是鈣對堿性蛋白酶有明顯的熱穩(wěn)定作用堿性蛋白酶是加酶洗滌劑的主要添加劑之一，在絲綢、制革工業(yè)中也有廣泛用途熱穩(wěn)定性將酶液分別置于不同的溫度條件下（30 ， 40 ， 50 ， 60 ， 70 ）保溫10min后，立即在 0冰浴中冷卻，然后在40 下測堿性蛋白酶活力，以剩余的酶活性作為評價酶的熱穩(wěn)定性的指標(biāo)。測量三個重復(fù)求平均值，將最高的酶活力定義為100% ，分別計算不同溫度條件下蛋白酶的剩余酶活性與最高酶活性的比值。以 ph7 的緩沖液為例 ,如果你的目標(biāo)蛋白等電點小于7,呢就帶負(fù)電荷 ,用陰離子交換的柱子,如果是大于7,那選擇陽離子交換的柱子,如果

2、等電點是7,那上樣的緩沖液pH 大于它的等電點用陰離子,小于 7 的用陽離子 ,如此類推就可以緩沖液的PH pI 值 1 ，上陰離子柱，pI 值 1，上陽離子柱，一般緩沖液ph 范圍在 6.5 8.5 之間，與 PI 值相差 1 個 PH 是比較理想的。如果不清楚PI 值，可以將蛋白溶到PH 梯度的緩沖液里，然后分別試陽離子和陰離子填料（50ul左右得體積就夠了），看那個PH 下掛得好。強(qiáng)離子交換劑 : 在寬 pH 范圍內(nèi)載量穩(wěn)定， 所以他的優(yōu)點是不同 pH 下載量恒定，可控性好，平衡過程快速、簡單。弱離子交換介質(zhì)的缺點：適用的pH 范圍比較小，隨著pH 不同載量發(fā)生變化。但是大部分蛋白等電點

3、在5.5 7.5。因此強(qiáng) / 弱離子交換介質(zhì)都可以使用弱離子交換介質(zhì)（ DEAE 、ANX 、CM) 優(yōu)點在于：和強(qiáng)離子交換介質(zhì)的選擇性不同，因此我們一般先使用強(qiáng)離子交換，如果優(yōu)化條件還是達(dá)不到理想的分離效果，可以嘗試弱離子交換，用選擇性不同的介質(zhì)嘗試一下。因此弱離子交換與強(qiáng)離子交換由于選擇性不同，可以說是對不同蛋白的結(jié)合力有差異。S技術(shù)規(guī)格離子交換劑類型Q Sepharose FF季氨基，強(qiáng)陰離子DEAE Sepharose FF二乙基氨基乙基，弱陰離子ANX Sepharose 4FF二乙基氨基丙基，弱陰離子SP Sepharose FF磺丙基，強(qiáng)陽離子CM Sepharose FF羥甲基

4、，弱陽離子離子容量Q Sepharose FF0.18-0.25mmol（ Cl- ） /mlDEAE Sepharose FF0.11-0.16mmol （Cl- ）/mlANX Sepharose 4 FF0.13-0.18mmol（Cl- ）/mlSP Sepharose FF0.18-0.25mmol（H+ ）/mlCM Sepharose FF0.09-0.13mmol（ H+ ） /ml動態(tài)載量Q Sepharose FF120mg HSA/ml填料DEAE Sepharose FF110mg HSA/ml填料ANX Sepharose 4 FF5mg 甲狀腺球蛋白 /ml 填料S

5、P Sepharose FF70mg RNAase/ml填料CM Sepharose FF50mg RNAase/ml填料.壓力/流速Q(mào) Sepharose FF400-700cm/h， 100kpa ，XK50/30層析柱，柱床高15cmDEAE Sepharose FF300-600cm/h，100kpa ，XK50/30層析柱，柱床高15cmANX Sepharose 4 FF至少 200cm/h，100kpa ，XK50/60層析柱，柱床高25cmSP Sepharose FF400-700cm/h， 100kpa ，XK50/30層析柱，柱床高15cmCM Sepharose FF3

6、00-600cm/h， 100kpa ，XK50/30層析柱，柱床高15cm平均顆粒大小90um （45-165um）基質(zhì)Sepharose FF高度交聯(lián)瓊脂糖，6%Sepharose 4 FF高度交聯(lián)瓊脂糖，4%PH 穩(wěn)定性Q Sepharose FF1-14（短期）， 2-12 （長期）DEAE Sepharose FF1-14（短期）， 2-13 （長期）ANX Sepharose 4 FF2-14 （短期）， 3-13 （長期）SP Sepharose FF3-14（短期）， 4-13 （長期）CM Sepharose FF2-14 （短期）， 4-13 （長期）化學(xué)穩(wěn)定性在所有常用的

7、水溶液緩沖液中穩(wěn)定： 8M 尿素、 6M 鹽酸胍、 70% 乙醇、 1M NaOH 和 1M 醋酸 20% 乙醇（Q , DEAE,ANX,CM ） ,含 0.2M 醋酸鈉的 20% 乙醇（ SP）保存保存溫度4-30 l 1M NaOH和醋酸僅在清洗時使用Phenyl-Sepharose HP產(chǎn)品名稱： 苯基 - 瓊脂糖凝膠6FF性狀：白色微球凝膠類型：疏水層析介質(zhì)粒徑： 45- 165 m工作 PH 值： 3-13應(yīng)用：疏水層析介質(zhì)，快流速，適合生物大分子和疫苗的分離純化等產(chǎn)品名稱： 苯基 - 瓊脂糖凝膠H.P.性狀：白色微球凝膠類型：疏水層析填料粒徑： 24- 44 m.工作 PH 值：

8、 3-13應(yīng)用：疏水層析介質(zhì)，高分辨率，適合生物大分子和疫苗的分離純化等產(chǎn)品名稱： 苯基 - 瓊脂糖凝膠CL-4B性狀：白色微球凝膠類型：疏水層析填料粒徑： 45- 165 m工作 PH 值： 3-13應(yīng)用：疏水層析介質(zhì)，適合生物大分子和疫苗的分離純化等。產(chǎn)品名稱： 丁基 - 瓊脂糖凝膠4FF性狀：白色微球凝膠類型：疏水層析介質(zhì)粒徑： 45- 165 m工作 PH 值： 3-13應(yīng)用：疏水層析介質(zhì)，快流速，適合生物大分子和疫苗的分離純化等產(chǎn)品名稱： 丁基 - 瓊脂糖凝膠H.P.性狀：白色微球凝膠類型：疏水層析介質(zhì)粒徑： 24- 44 m工作 PH 值： 3-13應(yīng)用：疏水層析介質(zhì)，高分辨率，適

9、合生物大分子和疫苗的分離純化等產(chǎn)品名稱： 丁基 - 瓊脂糖凝膠4B性狀：白色微球凝膠類型：疏水層析介質(zhì)粒徑： 45- 165 m工作 PH 值： 4-8應(yīng)用：疏水層析介質(zhì)，適合生物大分子和疫苗的分離純化等產(chǎn)品名稱： 辛基 - 瓊脂糖凝膠4FF性狀：白色微球凝膠類型：疏水層析介質(zhì)粒徑： 45- 165 m工作 PH 值： 3-13應(yīng)用：疏水層析介質(zhì)，快流速，適合生物大分子和疫苗的分離純化等產(chǎn)品名稱： 辛基 - 瓊脂糖凝膠H.P.性狀：白色微球凝膠類型：疏水層析介質(zhì)粒徑： 24- 44 m工作 PH 值： 3-13應(yīng)用：疏水層析介質(zhì)，高分辨率，適合生物大分子和疫苗的分離純化等.產(chǎn)品名稱： 辛基 -

10、 瓊脂糖凝膠CL-4B性狀：白色微球凝膠類型：疏水層析介質(zhì)粒徑： 45- 165 m工作 PH 值： 3-13應(yīng)用：疏水層析介質(zhì)，適合生物大分子和疫苗的分離純化等HPLC 內(nèi)容：1、反相柱子：一般適用范圍比較大。分離極性比較小的物質(zhì)。極性強(qiáng)的物質(zhì)先出柱。ODS 就是 C18 柱子。RP-8 和 RP-18 分別是 C18 柱子和 C8 柱子。C18 柱子和 C8 柱子是柱子的碳鏈的長度不一樣的。碳鏈增長了 ,也增加了鍵合相的非極性作用的面積 ,對保留值和選擇性都有影響 ,隨烷基碳鏈的增長對溶質(zhì)分離的選擇性也增強(qiáng)了 .但是對單一或簡單組分確實看不出太大區(qū)別。2、正相柱子：一般分離光學(xué)異構(gòu)體和反相

11、柱子不能分離的極性比較大的物質(zhì)。APS 為 NH2 柱子另外 diol代表的是球形硅膠鄰二羥基丙基醇基柱，正相柱，極性強(qiáng)的物質(zhì)后出。硅膠柱子的特點是可分離異構(gòu)體，柱子的載樣量大，用于制備分離，不污染收集的流分了，缺點是分析應(yīng)用不方便，如流動相的含水量應(yīng)該嚴(yán)格控制，再現(xiàn)性較差，需較長的平衡時間，不適用于梯度洗脫。堿性化合物在氨基和二醇柱上的保留強(qiáng)，而偶極化合物在腈基柱子上的保留強(qiáng)。建議您看看色譜分析等專業(yè)書籍有幫助的。ODS-AODS-A 液相色譜柱是國際上是銷售最好的一種傳統(tǒng)色譜柱，同時也是 HPLC 中應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用。 YMCODS-A 液相色譜采用高度封端的表面結(jié)構(gòu)和具有適當(dāng)?shù)氖杷?，廣

12、泛地應(yīng)用于多種化合物的分離。在嚴(yán)格質(zhì)量控制體系下，對50 個以上的參數(shù)進(jìn)行嚴(yán)格控制，保證了穩(wěn)定的質(zhì)量。其通常作為液相色譜標(biāo)準(zhǔn)柱。ODS-AMODS-AM液相色譜柱是一種高碳含量的C18 柱，具有和ODS-A 液相色譜柱相似的選擇性。二者的主要區(qū)別是 ODS-AM 液相色譜柱采用的是專利的封端技術(shù)，采用十分嚴(yán)格的生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范，可提供優(yōu)良的峰對稱性和更高分離效果的重現(xiàn)性，從而改善較難分離組分的峰形。ODS-AQODS-AQ液相色譜填料具有中等強(qiáng)度的疏水性和氫鍵鍵合相色譜填料，由于其具有相對高的疏水性，其與 ODS-A 相比有不同的保留行為，其主要用于碳水化合物的分離，如寡聚多糖類、葡萄糖苷類、藥物

13、和天然化合物的分離。ODS-ALODS-AL 液相色譜柱不僅具有疏水基團(tuán)的相互作用，而且還具備由硅醇基產(chǎn)生的第二級相互作用，這使其與傳統(tǒng)的ODS 不同的選擇性。當(dāng)離子間相互作用被優(yōu)化后，特別推薦用于流動相中含有緩沖液的色譜分離，可以獲得高重現(xiàn)性的色譜圖。YMC-Pack ODS-AL液相色譜柱采用的是沒有封端的高碳含量單層C18 相，其只能在殘存的硅醇基活性有利于色譜分離時使用，由于容易發(fā)生拖尾峰，不推薦在分析胺類或含堿性基團(tuán)的化合物中使用。ODS H80, M80, L80ODS 液相色譜填料是一種以硅膠為載體的三種配基覆蓋率不同的ODS 填料，不同配基覆蓋率將影響?zhàn)s出物中疏水組分的保留行為

14、，餾出物的官能基團(tuán)或三級結(jié)構(gòu)將決定分離行為的結(jié)果。Jsphere ODS液相色譜.填料幾乎不需要考慮疏水性和氫鍵鍵合相之間的相互作用，如離子或相互作用， 其多用于分離條件的測定。色譜柱考慮的問題首先是填料的問題， 大多數(shù)用于HPLC 分離的柱填料使用硅膠填料，基于多孔聚合物擔(dān)體與鍵和的有機(jī)表層（如 C18 C8 ），應(yīng)用范圍較廣， 顆粒的大小 （粒度）在 HPLC 中極為重要， 約 5um的微粒直徑兼顧了分析柱的柱效，反壓和壽命。更小的多孔微粒對快速分離很有用。小至1.5um的薄殼微粒對極快速地分離蛋白質(zhì)等大分子較有用。較窄地粒度分布能保證填充床地穩(wěn)定、高效和壓力降最小?？偟膩碚f， 3 或 5

15、um 全多孔微球填充HPLC 色譜柱，能滿足大多數(shù)分離地需要。色譜柱地性能指標(biāo)主要考慮：理論塔板數(shù)， 峰不對稱因子 （ AS ），兩種不同溶質(zhì)地選擇性，色譜柱地反壓，保留值地重現(xiàn)性，鍵和相濃度，色譜柱地穩(wěn)定性。有幾點看法 :1) 本人認(rèn)為 ,C18 是連接了 18 烷基碳鏈的反相固定相的總稱.ODS 是以硅膠為基質(zhì)鍵合的C18 填料 , 而 C18還包括其他基質(zhì)的填料,比如高聚物小球為基質(zhì),氧化鋁為基質(zhì) ,氧化鋯為基質(zhì)等鍵合C18 鏈形成的反相固定相,這些可以稱為 C18, 但是不是ODS.2)RP- 18也是 C18 中的一種 ,不同的公司對C18 填料有不同的商業(yè)名稱,本質(zhì)應(yīng)該都是一樣的.

16、Merck公司的填料喜歡叫RP-18.比如 Merck的 LiChrospher RP-18, Superspher RP-18,Purospher RP-18.因此 ,我認(rèn)為說 RP-18 是改進(jìn)型的不妥當(dāng) .Merck 的改進(jìn)表現(xiàn)在前邊的名字上 ,比如 LiCHrospher, Superspher, Purospher 表現(xiàn)的是不同的性能 .3) 普通 ODS 分析酸性、中性或弱堿性化合物時均可以獲得較佳的峰不對稱度。但當(dāng)分析藥物化合物中的強(qiáng)極性含氮的堿性樣品時，樣品峰形就極差，拖尾嚴(yán)重，定量分析精度下降, 這句話我認(rèn)為值得商榷. 普通的 ODS, 在分離中性化合物,極弱性的酸或鹼化合物

17、的時候可以得到較好的峰形,對于弱至中等極性的酸堿化合 物,多數(shù)情況下會出現(xiàn)不同程度的拖尾.對于強(qiáng)極性化合物,不單是藥物 ,其他化合物一樣,都會出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象再次修改，除掉了不太相關(guān)的BDS ，應(yīng)該說論述比較全面了。C18(C-18) 、RP18(RP-18) 、 ODS 有什么區(qū)別？答： C18(C-18) 、ODS 、 RP18(RP-18) 的寫法一般人從表面上理解沒多大的區(qū)別，三者之間常?；煊?，但在具體的不同場合，從嚴(yán)格意義上講，還是有一定的區(qū)別。一般認(rèn)為 C18 是連接了18 烷基碳鏈的反相固定相的總稱，除了硅膠基質(zhì)外， 還可以包括其他基質(zhì)的填料，比如高聚物小球為基質(zhì)，氧化鋁為基質(zhì)，氧化鋯為基質(zhì)等鍵合C18 鏈形成的反相固定相。而 ODS 是以硅膠為基質(zhì)鍵合的 C18 填料。因為大部分的 C18 柱是硅膠基質(zhì)， 因此，在很多場合內(nèi)二者混為一體。ODS 其后所標(biāo)的 1、2 、3 、4、5有的是指含碳的不同， 有的是不同代的替換產(chǎn)品， 如 Spherisorb 的 ODS-1是指未經(jīng)封尾處理的 ,含碳量為5.75% ，ODS-2是經(jīng)封尾處理的， 含碳量為 11.5% 。不同廠家的 ODS 柱性能差異很大。RP 在不同廠家中使用的含義也不太一