試驗(yàn)步驟詳細(xì)總結(jié)

1、蛋白提?。ㄋ胁僮髟诒线M(jìn)行）1. 裂解1）配裂解液：PMSF=100 : 1 ,（裂解液和PMSF在-20 C保存，提前一天 4 C解凍）取2ml裂解液，加20訕PMSF混勻2）稱取30mg組織，切碎放入標(biāo)記好的AP管中，加入600 d上述1中液體（加入液體與組織比例為 20 : 1），冰上靜置10min2. 勻漿先用超純水潤洗一下勻漿機(jī)的鋼頭，（同時進(jìn)行幾組勻漿時，組間也要潤洗鋼頭）在勻漿機(jī)（在生化室）上每次勻漿10s，兩次（間隔5s），冰上靜置30min3. 離心（在基礎(chǔ)4樓416室）1）自帶1ml槍以及藍(lán)槍頭和黃槍頭，三個的離心管（，兩個標(biāo)記，加少量超 純水，號是為了離心平衡，對稱放置

2、）2）將離心機(jī)預(yù)冷至 4 C為止，以1200 X10r/min 離心15min3）用移液槍將上層清液取出放入號管中4. 變性（上樣緩沖液：樣品=4 : 1）將樣品轉(zhuǎn)移至23個管中加上樣緩沖液，100 C變性10min儀器屏幕：5.保存變性結(jié)束 管蓋放一S5S5溫度（C）時間（時）：分鐘）00 : 10后，打開AP下氣，然后4C保存，點(diǎn)樣是取出即可用WB實(shí)驗(yàn)步驟1. 清洗玻璃板：清洗玻璃板后風(fēng)干， 將玻璃板對齊后放入夾中卡緊，操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。2. 配制分離膠1） 準(zhǔn)備：1ml槍（藍(lán)色槍頭），200訕槍（黃色槍頭）10 d （白色槍頭）2） 10%分離膠的配置：（用 50ml燒杯。

3、板配塊膠，板配 2塊板）超純水丙烯酰胺（30% ）避光保存極易失效HCL150 d10%SDS150 dAP （催化劑促凝作用）9訕TEMED混合搖勻（用移液槍抽吸混勻液體，不要將液體完全打出防止氣泡）3. 灌膠沿玻璃板右上角緩慢勻速加入分離膠（用1ml移液槍，不要將移液管內(nèi)液體完全打出防止氣泡）保持液面平穩(wěn)上升至上方綠色線為止4. 水封立即用1ml超純水進(jìn)行水封（利用重力把膠壓平），如有氣泡則用針頭吸出防止影響電泳效果，等待20-30mi n5. 濃縮膠的配制（5%）超純水1ml丙烯酰胺（30% ）避光保存極易失效750 dTrisHCL60 d10%SDS60訕AP （催化劑促凝作用）6

4、dTEMED攪拌混勻立即灌膠至溢出，插入梳子（10孔或15孑L）凝膠30min或20min6. 電泳（電泳液最多使用兩次）1）安裝電泳裝置低板對內(nèi)，上方夾住，往兩板中加入電泳液至黑線并觀察是否漏液，緩慢拔掉梳子（注意兩手平衡拔岀防止拔歪）2）點(diǎn)樣（不易時間過長，防止樣品條帶擴(kuò)散）Mark4 d（Protern ladder ）推薦9卩，實(shí)際4卩已經(jīng)足夠樣品8 M7-10 d均可內(nèi)參挑齊即可組數(shù)少時盡量靠中間點(diǎn)樣，邊緣易跑歪3）連接電泳儀電泳池與電泳蓋連接：黑對黑，紅對紅電永池的兩個電極插入電極蓋孔內(nèi)，打開開關(guān)恒壓電泳先調(diào)電壓至70mV，跑約20min。（ Mark跑開，分出彩帶即可）再調(diào)電壓至

5、120mV，跑約60min。（不能跑過下面的玻璃板）注：Mark的條帶從紅色條帶往下依次為：70 - 55 -40 - 35 -20，待測蛋白的分子量再哪一區(qū)域就在哪一段剪。用綠色的切板切割待測區(qū)域，邊緣留點(diǎn)空余，以防止切到條帶。放入裝有轉(zhuǎn)移液的皿中 浸泡7. 轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)移液可用3-4次）1）剪四層濾紙（大小與膜相，近可大不可?。┙朕D(zhuǎn)移液皿中。然后再講其剪成與膠一致大?。z始終 保持濕潤）2）剪PVDF膜（用上述濾紙，勿用手直接接觸PVDF膜），然后用甲醇活化 10s以上3）“夾三明治”再大塑料盆中加入少量轉(zhuǎn)移液，將夾板、海綿、濾紙、膜均放入浸泡，夾板黑板在下、兩層濾紙-膠-膜-兩層濾紙（膠的

6、大分子量條帶在上方，即在右上方）4）安裝轉(zhuǎn)膜裝置：黑板對黑板，電極黑對黑，紅對紅。加入轉(zhuǎn)膜液至滿（否則儀器無法啟動）5）打開開關(guān)，調(diào)節(jié)電流至 100mA，轉(zhuǎn)膜2h （恒流）盆中加滿冰轉(zhuǎn)膜成功標(biāo)志：膠上的條帶均轉(zhuǎn)移的膜上，膠呈無色8. 圭寸閉1）配制5%脫脂奶粉：脫脂奶粉小燒杯中混勻加入皿中50mlTBST2）將膜取出放入上述加入了 5%脫脂奶粉中的皿中常溫慢搖 60min （轉(zhuǎn)移液回收其余清理掉，轉(zhuǎn)移 液可以重復(fù)利用2次）9. 一抗1）用TBST配，每一格加5ml TBST，再分別加入抗體抗體的量:2l (Psmad2l )免抗1:10005 g : 5ml58 （分子量）2l (Psmad2

7、l )免抗1:50010 g : 5ml58Jnk免抗1:10005 g : 5ml雙帶內(nèi)參（小鼠抗GAPH ）單抗，中杉金橋1:50001 g : 5ml362）膜上用圓珠筆標(biāo)記，分別放入小格中（正面朝上）3）4C冰箱中，慢搖過夜（正面朝上，搖床416室）10. 洗脫用TBST在皿中洗脫，搖床 10min每次，洗三次。11. 二抗1）用3%的脫脂奶粉的脫脂奶粉50mlTBST,小燒杯中混勻加入皿中2）每格吸入5ml 3%脫脂奶粉，抗體與奶粉比例均為1:5000，即加入1 gl注意：吸入微升時，一定要檢查是否吸到液體，一抗用鼠抗則二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用 免抗3）膜分別加入小格，慢搖 1-2h （常溫）12. 洗脫用TBST在皿中洗脫，搖床 10min每次，洗三次。13. 顯影：廠U盤A液，B液（顯影液。4C保存）所需物品 200 g槍+槍頭（黃）I膜（置于皿中）1）開機(jī)后自動預(yù)冷，溫度降到 1-20 C才可2）顯影液現(xiàn)配現(xiàn)用（A液：B液=1 : 1 ）3）膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液槍吧顯影液均勻涂在膜上4) 先點(diǎn)擊自動曝光，看下效果，顯示不清晰再手動該曝光時間，內(nèi)參一般顯影15s (影