影響免疫檢測(cè)的因素有哪些

1、影響免疫檢測(cè)的因素有哪些影響免疫檢測(cè)的因素有哪些緩沖液最常用的兩種緩沖液是磷酸鹽緩沖液(PBS)和Tris緩沖液(TBS)。 調(diào)整配方中緩沖液組分的各種改良配方己見諸期刊。緩沖液的關(guān)鍵 要求是它應(yīng)有助于保持抗體的生物活性。因此，離子強(qiáng)度和pH值應(yīng) 相當(dāng)接近生理狀態(tài)。PBS的配方(磷酸鹽總濃度10mM)適用于廣泛的 抗體和檢測(cè)底物。在孵育過程中，裝有膜的容器應(yīng)輕輕搖動(dòng)。緩沖液的量應(yīng)足夠， 完全覆蓋膜，使其在緩沖液中自由漂浮。如果不止一張印跡放在容 器中，緩沖液容量不足會(huì)導(dǎo)致卬跡膜粘在一起。這將影響孵育溶液 的充分接觸，導(dǎo)致各種假象，如背景高、信號(hào)弱和靈敏度不均勻等。封閉要獲得有意義的結(jié)果，必須保

2、證抗體只與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合， 而不與膜結(jié)合。利用惰性蛋白、非離子去污劑，或無蛋白的封閉劑 來封閉膜上未被占據(jù)的位點(diǎn)，可減少抗體的非特異結(jié)合(NSB) o封閉劑與膜的親和力應(yīng)高于抗體。它應(yīng)填滿膜上未被占據(jù)的位點(diǎn), 但不會(huì)替換膜上的目標(biāo)蛋白。最常用的封閉劑是牛血清白蛋白(BSA, 0.2-5.0%)、脫脂牛奶、酪蛋白、明膠、吐溫20去污劑的稀釋液 (0. 05-0. 1%)以及Blok試劑。封閉劑通常溶解在PBS或TBS中。與封閉相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)包括：選擇不適當(dāng)?shù)姆忾]劑或過量封閉會(huì)替換 或掩蓋目標(biāo)蛋白質(zhì)。因此，封閉劑的正確選擇對(duì)成功的免疫檢測(cè)很 關(guān)鍵。例如，奶粉不能用于生物素化或刀豆蛋白標(biāo)記的抗體，因

3、為 牛奶中含有糖蛋口和生物素。在用磷酸化特異性抗體對(duì)磷酸化蛋口 進(jìn)行檢測(cè)分析時(shí)，如果采用粗蛋白制劑作為封閉劑，由于這些制劑 中可能含有磷酸酶，而卬跡上的磷酸化蛋白會(huì)被這些酶去磷酸化， 就有可能會(huì)影響分析結(jié)果。研究表明，在封閉液中添加磷酸酶抑制 劑可增強(qiáng)磷酸化特異性抗體的信號(hào)。此外，適用于一種抗原-抗體組 合的封閉劑可能不適用于其他組合。封閉液被點(diǎn)樣在空白的PVDF膜上，而膜己在甲醇中浸潤，并在 TBS中平衡。隨后在印跡上添加檢測(cè)試劑，孵育5分鐘，并曝光在X 射線膠片上。暗斑的出現(xiàn)則表明封閉劑與檢測(cè)試劑不兼容。如果在 標(biāo)準(zhǔn)的Western卬跡操作中用Immobilon-P轉(zhuǎn)卬膜來替代 Immob

4、ilonPSQ轉(zhuǎn)印膜，那么封閉液可能不足以飽和膜表而。可能 需要更多的清洗步驟來降低背景。抗體在封閉之后，卬跡與一個(gè)或多個(gè)抗體孵育。第一個(gè)抗體與目標(biāo)蛋 白結(jié)合，而第二個(gè)抗體與第一個(gè)結(jié)合。第二個(gè)抗體結(jié)合有酶或染料, 可用來指示蛋白的位置。盡管一抗能直接標(biāo)記，但使用二抗有明顯的優(yōu)勢(shì)。首先，不止一 個(gè)二抗分子能夠與單個(gè)一抗分子結(jié)合，形成信號(hào)擴(kuò)增。其次，標(biāo)記 的二抗(酶-抗體結(jié)合物)可用于大量不同特異性的一抗，從而不再需 要標(biāo)記多個(gè)一抗。多克隆或單克隆的一抗都可使用。多克隆抗體通常是以抗血清或 親和純化的抗體形式提供的。單克隆抗體是在腹水或組織培養(yǎng)液中 表達(dá)的，可直接使用或進(jìn)行親和純化。一定要記住，變

5、性蛋白可能 無法被天然抗原培育出的抗體所識(shí)別。在某些情況下，可能需要非 變性凝膠來進(jìn)行卬跡?？贵w以緩沖液和封閉液稀釋，以避免與膜的 非特異結(jié)合?？贵w稀釋液通常也包含痕量的吐溫20或另一種去污劑, 以防止抗體的非特異聚集。許多發(fā)表的化學(xué)發(fā)光操作需要在封閉液 和抗體稀釋液中添加0. l%(v/v)吐溫20。我們必須認(rèn)識(shí)到，高于 0. 05%(v/v)的濃度有可能從膜上洗掉一些卬跡的蛋白質(zhì)。提高吐溫20去污劑的濃度通常會(huì)降低背景。一種更簡單且更經(jīng) 濟(jì)的策略是降低抗體的濃度，特別是二抗(詳見圖1)?？贵w必須特 異針對(duì)目的蛋白，不能與封閉液中的組分交叉反應(yīng)，且應(yīng)該是相對(duì) 純凈的。其他蛋口質(zhì)或聚集物形式的

6、雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合和背 景增高。免疫檢測(cè)是一種極其靈敏的方法。為了實(shí)現(xiàn)高的信噪比和最高的 靈敏度，一抗和二抗的濃度應(yīng)針對(duì)每種情況來優(yōu)化。一般來說，高 倍稀釋一抗或降低凝膠上的蛋口上樣量可減少非特異信號(hào)。高倍稀 釋酶標(biāo)記的二抗可最大限度降低整體的高背景。一抗和二抗的最佳濃度也取決于檢測(cè)試劑的靈敏度。高靈敏度的 試劑（檢測(cè)到飛克級(jí)）與低靈敏度的試劑（檢測(cè)到皮克級(jí)）相比，抗體 用量可減少20倍?？贵w濃度的優(yōu)化取決于檢測(cè)底物的例子如圖13 所示。在使用最靈敏的檢測(cè)試劑時(shí)，過量的抗體導(dǎo)致高的非特異性 和整體背景增高（左上）。在這種情況下，將一抗稀釋度從1:1,000 提高到1:10, 000,改善了信噪比。在使用沒那么靈敏的檢測(cè)試劑 （中間和最下面一行）時(shí)，抗體需要更為濃縮，以產(chǎn)生相同的信號(hào)。清洗清洗卬跡，從膜上去除未結(jié)合的抗體，它們可能導(dǎo)致高背景和檢 測(cè)不佳。通常使用吐溫20的PBS或TBS稀釋液（0. 05%v/v）,特別是 當(dāng)抗體制劑是粗制的，或高濃度使用時(shí)。如前所述，濃縮的去污劑 溶液可能導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)從膜上洗脫。對(duì)于高度純化的抗體， 往往只使用緩沖液進(jìn)行清洗。所需的清洗次數(shù)最好根據(jù)實(shí)驗(yàn)來