酶的發(fā)酵工程PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1 酶的發(fā)酵工程酶的發(fā)酵工程 （一）（一）RNARNA的生物合成的生物合成-轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄(transcription)(transcription) 定義定義 以以DNADNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在為模板，以核苷三磷酸為底物，在 RNARNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成RNARNA分子分子 的過程。的過程。 . . 第1頁/共84頁 轉(zhuǎn)錄模轉(zhuǎn)錄模 板板 啟動子（啟動子（promotor) 終止子終止子(terminator) 模板鏈（模板鏈（template strand） 反意義鏈反意義鏈(antisense strand) 編碼鏈編碼鏈 (codi

2、ng strand) 有意義鏈有意義鏈(sense strand) 5 5 3 3 反意義鏈反意義鏈: :指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄作用的一條指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄作用的一條DNADNA鏈鏈 有意義鏈有意義鏈: :無轉(zhuǎn)錄功能的一條無轉(zhuǎn)錄功能的一條DNADNA鏈鏈. . 第2頁/共84頁 T C G A G T A C A G C T C A T G C G A G U A C G C A U RNA聚合聚合 酶酶 有意義鏈有意義鏈 反意義鏈反意義鏈 RNA PPi 55 55 33 GTP UTP CTP ATP UTP RNA在在DNA模板上的生物合成模板上的生物合成 33 33 55 第3頁/共84頁 RNA的轉(zhuǎn)錄過程的

3、轉(zhuǎn)錄過程( (三步三步 ) ) 1.1.起起 始始 2.2.延延 長長 3.3.終終 止止 第4頁/共84頁 原核生物的原核生物的RNA聚合酶聚合酶(DDRP) E. coliE. coli的的RNARNA聚合酶是由四種亞基組成的五聚體聚合酶是由四種亞基組成的五聚體 （ 2 2 ） 核心酶（core enzyme） 全酶（holoenzyme） 起始因子 第5頁/共84頁 起始起始 雙鏈雙鏈DNA 局部解開局部解開 磷酸二酯磷酸二酯 鍵形成鍵形成 終止階段終止階段 解鏈區(qū)到達解鏈區(qū)到達 基因終點基因終點 延長階段延長階段 5 3 RNA 啟動子（啟動子（ promotor) 終止子終止子 (t

4、erminator) 5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 離開離開 第6頁/共84頁 3 5 RNA-DNA雜交螺旋雜交螺旋 聚合酶的移動方向聚合酶的移動方向 新生新生RNA 復(fù)鏈復(fù)鏈 解鏈解鏈 有義鏈有義鏈 模板鏈（反義鏈）模板鏈（反義鏈） 延長部位延長部位 第7頁/共84頁 定義定義 以以mRNAmRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖為模板，以氨基酸為底物，在核糖 體上通過各種體上通過各種tRNAtRNA、酶和輔助因子的作用，合、酶和輔助因子的作用，合 成多肽鏈的過程。成多肽鏈的過程。 （二）蛋白質(zhì)的生物合成（二）蛋白質(zhì)的生物合成-翻譯翻譯 (translation)(tr

5、anslation) 第8頁/共84頁 酪酪 55 5533 AUG GUU UAC ACA 酪氨酰酪氨酰- tRNA 反密碼反密碼 mRNA 密碼與反密碼的堿基配對密碼與反密碼的堿基配對 第9頁/共84頁 AUG ACA 55 蛋蛋 蘇蘇 UGU GUU 33 受受 位位 (A位位) 給給 位位 (P位位) 大亞基大亞基 小亞基小亞基 第10頁/共84頁 v 氨基酸的活化氨基酸的活化 v 肽鏈合成的起始肽鏈合成的起始 v 肽鏈的延伸肽鏈的延伸 v 肽鏈合成的終止與釋放肽鏈合成的終止與釋放 第11頁/共84頁 氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運 反應(yīng)式：反應(yīng)式： AA + tRNA + AT

6、PAA + tRNA + ATP 氨酰氨酰-tRNA-tRNA合成酶合成酶 氨酰氨酰-tRNA-tRNA+AMP+PPi +AMP+PPi 對于對于E.coliE.coli而言，肽鏈合成時的第一而言，肽鏈合成時的第一 個氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（個氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMetfMet）。）。 第12頁/共84頁 在核糖體上合成多肽（三階段）在核糖體上合成多肽（三階段） 1 1、起始階段、起始階段 2 2、延伸階段、延伸階段 3 3、終止階段、終止階段 第13頁/共84頁 肽鏈合成的起始階肽鏈合成的起始階 段段 1.1.mRNAmRNA與小亞基結(jié)合：與小亞基結(jié)合：形成形成30S-mRNA-IF

7、30S-mRNA-IF3 3復(fù)合物復(fù)合物 2.2.AUGAUG與蛋氨酰與蛋氨酰- -tRNAtRNA結(jié)合：結(jié)合： 30S-mRNA-IF30S-mRNA-IF3 3 fMet-tRNA-IF fMet-tRNA-IF2 2-GTP-GTP fMet-tRNA fMet-tRNA正好位于正好位于mRNAmRNA的起始密碼子上（的起始密碼子上（AUGAUG） 。 3.3.大小亞基結(jié)合大小亞基結(jié)合 IF1 30S30S起始復(fù)合物起始復(fù)合物 第14頁/共84頁 AUG ACA 5533 AUG ACA 5533 UACUAC AUG ACA 5533 小亞基小亞基 mRNA 蛋氨酰蛋氨酰tRNA GT

8、P 大亞基大亞基 GDP+Pi 受位受位給位給位 蛋蛋蛋蛋 肽鏈合成的起始階段肽鏈合成的起始階段 第15頁/共84頁 肽鏈合成的延伸階段肽鏈合成的延伸階段 1.1.進位進位: :氨基酰氨基酰-tRNA-tRNA進入受位進入受位; ; 2.2.轉(zhuǎn)肽轉(zhuǎn)肽: :形成肽鍵形成肽鍵, ,在轉(zhuǎn)肽酶作用下在轉(zhuǎn)肽酶作用下, ,給位與給位與 受位結(jié)合受位結(jié)合; ; 3.3.移位移位: :核蛋白體向核蛋白體向33端移動一個密碼子的端移動一個密碼子的 位置位置, ,空出受位空出受位, ,不斷地進位、轉(zhuǎn)肽不斷地進位、轉(zhuǎn)肽 、 移位移位, ,使肽鏈延長。使肽鏈延長。 第16頁/共84頁 AUG ACA 5533 UAC

9、 蛋蛋 蘇蘇 UGU AUG ACA 55 UAC 蛋蛋蘇蘇 UGU GUU AUG ACA 55 UAC 蛋蛋 蘇蘇 UGU GUUAUG ACA 55 蛋蛋 蘇蘇 UGU GUU 33 33 33 GTP GDP+Pi GDP+PiGTP 起始復(fù)合體起始復(fù)合體進位進位 轉(zhuǎn)肽轉(zhuǎn)肽 移位移位 Mg+ K+ 第17頁/共84頁 肽鏈合成的終止階肽鏈合成的終止階 段段 1.1.出現(xiàn)終止密碼并與終止因子結(jié)合出現(xiàn)終止密碼并與終止因子結(jié)合; ; 2.2.肽鍵水解肽鍵水解, ,多肽釋放多肽釋放; ; 3.3.tRNA,mRNAtRNA,mRNA, ,大小亞基解離大小亞基解離. . 第18頁/共84頁 AU

10、G UAA 55 UAC AUG UAA 55 UAC 3 3 33 終終 終終 AUG UAA 55 UAC 33 終終 5533UAC 終終 肽鏈肽鏈 第19頁/共84頁 第20頁/共84頁 二、酶生物合成的調(diào)節(jié)二、酶生物合成的調(diào)節(jié) 定義：定義：通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物 代謝速度的調(diào)節(jié)機制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上代謝速度的調(diào)節(jié)機制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上 進行的。進行的。 意義：意義：通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物 合成的原料和能量。合成的原料和能量。 第21頁/共84頁 操縱子基因表達的協(xié)同單位 操縱子操縱子 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因（編

11、碼蛋白質(zhì)（編碼蛋白質(zhì), structural gene, S） 控制部位控制部位 操縱基因（操縱基因（operator gene, O） 啟動子（啟動子（promotor gene, P） 第22頁/共84頁 基因操縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖基因操縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖 調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因 啟動基因啟動基因 操縱基因操縱基因 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 DNA 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 （-） RNA聚合酶聚合酶 （+） 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 mRNA 翻譯翻譯 阻遏蛋白阻遏蛋白 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)劑 控制區(qū)控制區(qū) 信息區(qū)信息區(qū) 操縱子操縱子 第23頁/共84頁 第24頁/共84頁 RPOSD N A C RP-cA M P 復(fù)

12、 合 物 C RP+cA M P cAMP-CRP復(fù)合物的作用示意圖 啟動基因（啟動基因（promotor genepromotor gene）（啟動子）：）（啟動子）： 有兩個位點：有兩個位點： （1 1）RNARNA聚合酶的結(jié)合位點聚合酶的結(jié)合位點 （2 2）cAMP-CAPcAMP-CAP的結(jié)合位點。的結(jié)合位點。 CAPCAP：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（catabolite gene catabolite gene activator proteinactivator protein），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMP (cAMP rec

13、eptor proteinreceptor protein，CRPCRP）。）。 只有只有cAMP-CRPcAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合到啟動子的位點上，復(fù)合物結(jié)合到啟動子的位點上， RNARNA聚合酶才能結(jié)合到其在啟動子的位點上，酶的合聚合酶才能結(jié)合到其在啟動子的位點上，酶的合 成才能開始。成才能開始。 第25頁/共84頁 操縱基因（操縱基因（Operater geneOperater gene）: : 位于啟動基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿位于啟動基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿 基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu) 蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時機與速度。蛋白結(jié)合，操

14、縱酶合成的時機與速度。 結(jié)構(gòu)基因（結(jié)構(gòu)基因（Structural geneStructural gene）: : 決定某一多肽的決定某一多肽的DNADNA模板，與酶有各自的對模板，與酶有各自的對 應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為mRNAmRNA，再，再 翻譯為蛋白質(zhì)。翻譯為蛋白質(zhì)。 第26頁/共84頁 ( (二二) ) 酶合成調(diào)節(jié)的類型酶合成調(diào)節(jié)的類型 1.1.誘導(dǎo)誘導(dǎo) (induction)(induction) 組成酶：細胞固有的酶類。組成酶：細胞固有的酶類。 誘導(dǎo)酶：是細胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似誘導(dǎo)酶：是細胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似 物而臨時合成的一類酶

15、。物而臨時合成的一類酶。 2.2.阻遏阻遏 (repression) (repression) 分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏(catabolite repression)(catabolite repression) 反饋阻遏反饋阻遏(feedback repression)(feedback repression) 第27頁/共84頁 酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象：酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象： 已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶；半乳糖苷酶； -半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。 實驗：實驗：（1）大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細胞）大腸桿菌生

16、長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細胞 內(nèi)無上述三種酶合成；內(nèi)無上述三種酶合成； （2）大腸桿菌生長在乳糖培養(yǎng)基上時，細胞內(nèi)有）大腸桿菌生長在乳糖培養(yǎng)基上時，細胞內(nèi)有 上述三種酶合成；上述三種酶合成； （3）表明菌體生物合成的經(jīng)濟原則：）表明菌體生物合成的經(jīng)濟原則：需要時才合成需要時才合成 。 第28頁/共84頁 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié) 基因基因 操縱操縱 基因基因 乳糖結(jié)構(gòu)基因乳糖結(jié)構(gòu)基因 P LacZLacYLaca mRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白 （有活性（有活性 ） 基基 因因 關(guān)關(guān) 閉閉 啟啟 動動 子子 O R PLacZLacYLaca 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié) 基因基因 操縱操縱 基因基因 乳糖結(jié)構(gòu)基因乳糖結(jié)構(gòu)基因 啟啟

17、動動 子子 O R mRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白 （無活性（無活性 ） 基基 因因 表表 達達 mRNA A、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu) B、乳糖酶的誘導(dǎo)、乳糖酶的誘導(dǎo) 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白 （有活性）（有活性） 誘導(dǎo)誘導(dǎo) 第29頁/共84頁 第30頁/共84頁 調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因 操縱基因操縱基因 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 mRNAmRNA 酶蛋白酶蛋白 阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合， 結(jié)構(gòu)基因表達結(jié)構(gòu)基因表達 調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因 操縱基因操縱基因 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 輔阻遏物輔阻遏物 代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié) 合，使之構(gòu)象發(fā)生變

18、化合，使之構(gòu)象發(fā)生變化 與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu) 基基 因不能表達因不能表達 第31頁/共84頁 B.有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑 A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白 C.無活性阻遏蛋白無活性阻遏蛋白 D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑 操縱基因操縱基因啟動基因啟動基因 調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 阻遏蛋阻遏蛋 白白(有活有活 性性) 阻遏蛋白阻擋操縱基阻遏蛋白阻擋操縱基 因結(jié)構(gòu)基因不表達因結(jié)構(gòu)基因不表達 誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物 誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起 到阻擋操縱基因的作用到阻擋操縱基因的作用,結(jié)構(gòu)

19、基因可以表達結(jié)構(gòu)基因可以表達 酶蛋酶蛋 白白 mRN A 阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合, 結(jié)構(gòu)基因可以表達結(jié)構(gòu)基因可以表達 阻遏蛋白阻遏蛋白(無活性無活性) 酶蛋酶蛋 白白 mRN A 代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合,從而使阻遏從而使阻遏 蛋白能夠阻擋操縱基因蛋白能夠阻擋操縱基因,結(jié)構(gòu)基因不表結(jié)構(gòu)基因不表 達達 代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物 第32頁/共84頁 調(diào)控方式 阻遏蛋白 添加物 與操縱基 因結(jié)合 阻遏效應(yīng)舉例 酶的誘導(dǎo)有活性不轉(zhuǎn)錄， 繼而不翻譯 誘導(dǎo)物轉(zhuǎn)錄， 繼而翻譯 乳糖操 縱子 酶的阻遏無活性 阻遏物不轉(zhuǎn)錄， 繼而不翻譯 色氨酸 操縱子 酶合成的誘導(dǎo)與阻

20、遏操縱子模型調(diào)控作用對比酶合成的誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對比 第33頁/共84頁 中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起 的阻遏作用。的阻遏作用。 第34頁/共84頁 02468 0 20 40 60 80 細胞 濃 度(OD) 時 間(h) 這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng)這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng) ，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降 解物阻遏了分解乳糖酶系的合解物阻遏了分解乳糖酶系的合 成。成。此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺 苷酸受體蛋白（苷酸受體蛋白（CRPCRP）, ,亦稱亦稱降降 解物基因活化蛋白（解物基因活化蛋白（CAPCAP）。）。 第35頁/

21、共84頁 RLacZLacYLaca mRNA mRNAZmRNAYmRNAa 基基 因因 表表 達達 CA P基基 因因 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 T CAP O CAP結(jié)結(jié) 合部位合部位 RNA 聚合聚合 酶酶 T cAMP -CAP P 葡萄葡萄 糖糖 分解分解 代謝代謝 產(chǎn)物產(chǎn)物 腺苷酸腺苷酸 環(huán)化酶環(huán)化酶 磷酸二磷酸二 酯酶酯酶 ATP cAMP 5- AMP 抑抑 制制 激激 活活 葡萄糖降解物與葡萄糖降解物與cAMP的關(guān)系的關(guān)系 cAMP CAP：降解物基因活化蛋白（：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein） 降低降低cAMP濃度濃度 使使

22、CAP呈失活狀態(tài)呈失活狀態(tài) 第36頁/共84頁 三、提高酶產(chǎn)量的策略三、提高酶產(chǎn)量的策略 （一）菌種選育（一勞永逸）（一）菌種選育（一勞永逸） 1.1.誘變育種誘變育種 (1) 使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型選育組成型突變株選育組成型突變株 (2)(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜褪棺瓒粜妥優(yōu)槿プ瓒粜?選育營養(yǎng)缺陷型突變株選育營養(yǎng)缺陷型突變株 解除反饋阻遏解除反饋阻遏 選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株 解除分解代謝物阻遏解除分解代謝物阻遏選育抗分解代謝阻遏突變株選育抗分解代謝阻遏突變株 2. 基因工程育種基因工程育種 第37頁/共84頁 （二）條件控制（二）條件控制 1. 1.

23、添加誘導(dǎo)物添加誘導(dǎo)物 酶的底物類似物最有效。酶的底物類似物最有效。 2. 2. 降低阻遏物濃度降低阻遏物濃度 除去終產(chǎn)物除去終產(chǎn)物 產(chǎn)物阻遏產(chǎn)物阻遏 添加阻止產(chǎn)物形成的抑制劑添加阻止產(chǎn)物形成的抑制劑 避免使用葡萄糖避免使用葡萄糖 分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏 避免培養(yǎng)基過于豐富避免培養(yǎng)基過于豐富 添加一定量的添加一定量的cAMPcAMP 第38頁/共84頁 3.3.添加表面活性劑添加表面活性劑 離子型離子型 對細胞有毒害作用對細胞有毒害作用 表面活性劑表面活性劑 TweenTween8080 非離子型非離子型 增加細胞通透性增加細胞通透性 TritonXTritonX100100 4. 4.

24、添加產(chǎn)酶促進劑添加產(chǎn)酶促進劑 第39頁/共84頁 第40頁/共84頁 EDCBAO 細 胞濃度 (g/L) 培 養(yǎng) 時 間 (h ) 細胞生長曲線細胞生長曲線 O-A 延遲期延遲期 A-B指數(shù)生長期指數(shù)生長期 B-C減速期減速期 C-D 靜止期靜止期 D-E 衰亡期衰亡期 第41頁/共84頁 SK S Xdt dX s m 1 第42頁/共84頁 第43頁/共84頁 二、產(chǎn)酶動力學(xué)二、產(chǎn)酶動力學(xué) （一）（一） 酶生物合成的模式酶生物合成的模式 根據(jù)酶的合成與細胞生長之間的關(guān)系，可將酶根據(jù)酶的合成與細胞生長之間的關(guān)系，可將酶 的生物合成分為的生物合成分為3 3種模式，即：種模式，即： 同步合成型

25、同步合成型 生長偶聯(lián)型生長偶聯(lián)型 中期合成型中期合成型 部分生長偶聯(lián)型部分生長偶聯(lián)型延續(xù)合成型延續(xù)合成型 非生長偶聯(lián)型非生長偶聯(lián)型 滯后合成型滯后合成型 第44頁/共84頁 1. 1. 生長偶聯(lián)型（又稱同步合成型）生長偶聯(lián)型（又稱同步合成型） 酶的生物合成與細胞生長同步。酶的生物合成與細胞生長同步。 特點：特點：酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏 和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。 當去除誘導(dǎo)物、細胞進入平衡期后，酶的合成當去除誘導(dǎo)物、細胞進入平衡期后，酶的合成 立即停止，表明這類酶所對應(yīng)的立即停止，表明這類酶所對應(yīng)的mRNAmRNA很不穩(wěn)定。很不穩(wěn)定。

26、 a 酶 細 胞 細胞 或酶濃 度 時間 第45頁/共84頁 生長偶聯(lián)型中的特殊形式生長偶聯(lián)型中的特殊形式中期合成型中期合成型 酶的合成在細胞生長一段時間后才開始，而在細酶的合成在細胞生長一段時間后才開始，而在細 胞生長進入平衡期以后，酶的合成也隨著停止胞生長進入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。 特點：特點：酶的合成受產(chǎn)物的反饋阻遏或分解代謝物阻遏酶的合成受產(chǎn)物的反饋阻遏或分解代謝物阻遏 。 所對應(yīng)的所對應(yīng)的mRNAmRNA是不穩(wěn)定的。是不穩(wěn)定的。 0246810 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 細 胞濃度 酶 濃度 細胞 濃 度 (OD500) 酶濃 度(U/mL) 時間 (

27、h) 枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線 第46頁/共84頁 2.2.部分生長偶聯(lián)型（又稱延續(xù)合成型）部分生長偶聯(lián)型（又稱延續(xù)合成型） 酶的合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進酶的合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進 入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長一段時間。入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長一段時間。 特點：特點：可受誘導(dǎo)，一般不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏?？墒苷T導(dǎo)，一般不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏。 所對應(yīng)的所對應(yīng)的mRNAmRNA相當穩(wěn)定。相當穩(wěn)定。 b 酶 細胞 細胞 或酶濃 度 時 間 04080120 0 20 40 60 細 胞濃度 酶濃度 酶濃度 (單位/ml) 時

28、 間 (h) 0.0 12.5 25.0 37.5 50.0 細 胞濃度 (g/L) 黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線 第47頁/共84頁 3. 3. 非生長偶聯(lián)型（又稱滯后合成型）非生長偶聯(lián)型（又稱滯后合成型） 只有當細胞生長進入平衡期以后，酶才開始合成只有當細胞生長進入平衡期以后，酶才開始合成 并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型 。 特點特點：受分解代謝物的阻遏作用。：受分解代謝物的阻遏作用。 所對應(yīng)的所對應(yīng)的mRNAmRNA穩(wěn)定性高。穩(wěn)定性高。 c 酶 細胞 細胞 或酶濃 度 時 間 020406080 0

29、 10 20 30 40 50 酶濃 度 細胞 濃 度 細胞 濃 度 (g/L) 時 間 (h) 0 10 20 30 40 50 酶濃 度 (U) 黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線 第48頁/共84頁 總結(jié)：影響酶生物合成模式的主要因素 高：可在細胞停止生長后繼 1）mRNA的穩(wěn)定性 續(xù)合成酶 差：隨著細胞停止生長而終 止酶的合成 2）培養(yǎng)基中阻遏物的存在 不受阻遏：隨著細胞的生長而開始酶的合成。 受阻遏：細胞生長一段時間或平衡期后，酶才開始 合成。 第49頁/共84頁 酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：酶生產(chǎn)中最理想的合成模式： 延續(xù)合成型：延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期

30、的明發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期的明 顯差別。細胞開始生長就有酶的產(chǎn)生，直至細胞生顯差別。細胞開始生長就有酶的產(chǎn)生，直至細胞生 長進入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時間。長進入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時間。 對于：對于： 同步合成型：同步合成型：提高對應(yīng)的提高對應(yīng)的mRNAmRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)的穩(wěn)定性，如降低發(fā) 酵酵 溫度溫度 。 滯后合成型：滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏， 使使 酶的合成提早開始。酶的合成提早開始。 中期合成型：中期合成型：要在提高要在提高mRNAmRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩穩(wěn)定性以及解除阻遏兩 方方 面努力面努力。

31、第50頁/共84頁 ( (二二) ) 產(chǎn)酶動力學(xué)產(chǎn)酶動力學(xué) 一般產(chǎn)酶動力學(xué)方程可表達為：一般產(chǎn)酶動力學(xué)方程可表達為： X dt dE 式中式中 X X細胞濃度細胞濃度(g /L)(g /L) 細胞比生長速率細胞比生長速率(h(h-1 -1) ) 生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)(IU/g)(IU/g) 非生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率非生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率(IU/(g(IU/(g h)h) E E酶濃度酶濃度(IU/L)(IU/L) t t時間時間(h)(h) 第51頁/共84頁 生長偶聯(lián)型生長偶聯(lián)型X dt dE 部分生長偶聯(lián)型部分生長偶聯(lián)型 XX dt dE 非生長偶聯(lián)非生長偶聯(lián) 型型 X

32、dt dE 第52頁/共84頁 第三節(jié)第三節(jié) 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶微生物發(fā)酵產(chǎn)酶 一、產(chǎn)酶微生物的分離和選育一、產(chǎn)酶微生物的分離和選育 1.1.優(yōu)良產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備的條件優(yōu)良產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備的條件 （1 1）酶產(chǎn)量高）酶產(chǎn)量高 （2 2）易培養(yǎng)（生長速率高、營養(yǎng)要求低）易培養(yǎng)（生長速率高、營養(yǎng)要求低） （3 3）遺傳性能穩(wěn)定，不易退化）遺傳性能穩(wěn)定，不易退化 （4 4）易分離提純）易分離提純 （5 5）安全可靠（不是致病菌）安全可靠（不是致病菌） 第53頁/共84頁 2.2.常用的產(chǎn)酶微生物常用的產(chǎn)酶微生物 Escherichia coli Pseudomonas Bacillus subtilis M

33、icrococcus Streptococcus Streptomyces Aspergillus niger Aspergillus oryzae Monascus Penicillium Trichoderma Rhizopus Mucor Absidia Saccharomyces cerevisiae Candida 第54頁/共84頁 3. 3. 產(chǎn)酶微生物的分離和篩選產(chǎn)酶微生物的分離和篩選 1)1)樣品的采集樣品的采集: :從富含該酶作用底物的場所采集樣品從富含該酶作用底物的場所采集樣品 2)2)富集培養(yǎng)富集培養(yǎng): : 投其所好，取其所抗投其所好，取其所抗 3)3)分離獲得微生物的

34、純培養(yǎng)（分離獲得微生物的純培養(yǎng)（pure culturepure culture）。）。 4)4)初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。 5)5)復(fù)篩：選出產(chǎn)酶水平相對較高的菌株，以質(zhì)為主。復(fù)篩：選出產(chǎn)酶水平相對較高的菌株，以質(zhì)為主。 第55頁/共84頁 - -淀粉酶的篩選淀粉酶的篩選 第56頁/共84頁 蛋白酶產(chǎn)生菌的獲得方蛋白酶產(chǎn)生菌的獲得方 法法 應(yīng)用含酪蛋白的培養(yǎng)基應(yīng)用含酪蛋白的培養(yǎng)基 第57頁/共84頁 4.4.產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育 誘變育種誘變育種 原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體融合育種 基因工程育種基因工程育種 第58頁/共84頁 二二

35、. .微生物發(fā)酵產(chǎn)酶方法微生物發(fā)酵產(chǎn)酶方法 1.1.固體培養(yǎng)固體培養(yǎng): :特別適合于霉菌培養(yǎng)特別適合于霉菌培養(yǎng) 2.2.液體培養(yǎng)液體培養(yǎng): :目前酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式目前酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式 3.3.固定化細胞固定化細胞 : :需要特殊的固定化細胞反應(yīng)器需要特殊的固定化細胞反應(yīng)器 第59頁/共84頁 三三. .微生物酶的類型微生物酶的類型 1.1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纖維素酶、果膠酶），是微生物為了利用環(huán)境中的纖維素酶、果膠酶），是微生物為了利用環(huán)境中的 大分子而釋放到細胞外的，即使胞外濃度很高，胞大分子而釋放到細胞外的，即使胞外濃

36、度很高，胞 內(nèi)也能維持較低水平，受到的調(diào)節(jié)控制少。內(nèi)也能維持較低水平，受到的調(diào)節(jié)控制少。 2.2.胞內(nèi)酶：指合成后仍留在細胞內(nèi)發(fā)揮作用的酶胞內(nèi)酶：指合成后仍留在細胞內(nèi)發(fā)揮作用的酶 ，酶活性和濃度受到中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的調(diào)控。，酶活性和濃度受到中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的調(diào)控。 第60頁/共84頁 試管菌種培養(yǎng) 茄瓶菌種培養(yǎng) 搖瓶菌種培養(yǎng) 孢子（菌體）懸液制備 種子罐菌種培養(yǎng) 發(fā)酵罐發(fā)酵 發(fā)酵液預(yù)處理 酶的分離純化精制 酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程 第61頁/共84頁 第四節(jié)第四節(jié) 動、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)動、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn) 酶酶 與微生物細胞相比，動物細胞與微生物細胞相比，動物細胞 和植物細

37、胞具有各自不同的特性，和植物細胞具有各自不同的特性， 需采用各自不同的培養(yǎng)工藝。需采用各自不同的培養(yǎng)工藝。 第62頁/共84頁 動物細胞模式圖 第63頁/共84頁 植物細胞結(jié)構(gòu) 第64頁/共84頁 細胞種類細胞種類植物細胞植物細胞微生物細胞微生物細胞動物細胞動物細胞 細胞大小細胞大小/um20030011010100 倍增時間倍增時間/h120.3-615 營養(yǎng)要求營養(yǎng)要求簡單簡單簡單簡單復(fù)雜復(fù)雜 光照要求光照要求大多數(shù)要求大多數(shù)要求不要求不要求不要求不要求 對剪切力對剪切力敏感敏感大多數(shù)不敏感大多數(shù)不敏感非常敏感非常敏感 主要產(chǎn)物主要產(chǎn)物色素、藥物、色素、藥物、 香精、酶等香精、酶等 醇、有

38、機酸、氨醇、有機酸、氨 基酸、抗生素、基酸、抗生素、 核苷酸、酶等核苷酸、酶等 疫苗、激素、疫苗、激素、 單克隆抗體、單克隆抗體、 酶等酶等 第65頁/共84頁 三者之間的差異主要有：三者之間的差異主要有： 植物細胞植物細胞 動物細胞動物細胞 微生物細胞。微生物細胞。 動物細胞、植物細胞的生產(chǎn)周期比微生物長。動物細胞、植物細胞的生產(chǎn)周期比微生物長。 植物細胞和微生物細胞的營養(yǎng)要求較簡單。植物細胞和微生物細胞的營養(yǎng)要求較簡單。 植物細胞的生長以及次級代謝物的生產(chǎn)要求一定的植物細胞的生長以及次級代謝物的生產(chǎn)要求一定的 光照。光照。 植物細胞和動物細胞對剪切力敏感。植物細胞和動物細胞對剪切力敏感。

39、植物、微生物和動物細胞的主要目的產(chǎn)物各不相同植物、微生物和動物細胞的主要目的產(chǎn)物各不相同 。 第66頁/共84頁 一、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶一、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 1.1.植物細胞培養(yǎng)的特點植物細胞培養(yǎng)的特點 2.2.培養(yǎng)基特點培養(yǎng)基特點 應(yīng)用最廣的是應(yīng)用最廣的是MSMS培養(yǎng)基和培養(yǎng)基和LSLS培養(yǎng)基培養(yǎng)基 MSMS培養(yǎng)基是培養(yǎng)基是19621962年由年由MurashingeMurashinge和和SkoogSkoog 為煙草細胞培養(yǎng)而設(shè)計的培養(yǎng)基。為煙草細胞培養(yǎng)而設(shè)計的培養(yǎng)基。LSLS培養(yǎng)基培養(yǎng)基 是在其基礎(chǔ)上演變而來的。是在其基礎(chǔ)上演變而來的。 第67頁/共84頁 3.3.培養(yǎng)方法：培養(yǎng)方法：懸浮

40、細胞培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng) 細胞株的建立；外植體與愈傷組織細胞株的建立；外植體與愈傷組織 擴大培養(yǎng)；擴大培養(yǎng)； 大罐培養(yǎng)；大罐培養(yǎng)； 第68頁/共84頁 外植體：外植體： 從植株取出，經(jīng)過預(yù)處理后，用于植物組從植株取出，經(jīng)過預(yù)處理后，用于植物組 織培養(yǎng)的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花織培養(yǎng)的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花 、果實、種子等）的片段或小塊。、果實、種子等）的片段或小塊。 愈傷組織：愈傷組織： 將上述外植體植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于將上述外植體植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于2525 左右培養(yǎng)一段時間，從外植體的切口部位長出左右培養(yǎng)一段時間，從外植體的切口部位長出 小細胞團。小細胞團。 第69頁/共84

41、頁 水稻的外植體（水稻的外植體（ 幼胚）和愈傷組幼胚）和愈傷組 織織 外植體外植體 愈傷組織愈傷組織 第70頁/共84頁 4. 4. 培養(yǎng)條件的影響與控制培養(yǎng)條件的影響與控制 （1 1）溫度）溫度 （2 2）pHpH （3 3）通氣與攪拌）通氣與攪拌 （4 4）光照的控制）光照的控制 （5 5）前體的添加（飼喂）前體的添加（飼喂） （6 6）誘導(dǎo)子（）誘導(dǎo)子（elicitorselicitors）的應(yīng)用）的應(yīng)用 第71頁/共84頁 5.5.植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶實例植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶實例 以大蒜細胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物歧化酶（以大蒜細胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物歧化酶（SODSOD）為例）為例 (1)(1)大蒜愈傷

42、組織的誘導(dǎo)大蒜愈傷組織的誘導(dǎo) 選取結(jié)實、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，選取結(jié)實、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣， 去除外皮，先用去除外皮，先用70%70%乙醇消毒乙醇消毒20s20s，再用，再用0.1%0.1%升升 汞消毒汞消毒10min10min，然后無菌水漂洗，然后無菌水漂洗3 3次。次。 在無菌條件下，切成在無菌條件下，切成0.5cm0.5cm3 3的小塊，植入的小塊，植入 含有含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA 的半固體的半固體MSMS 培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中，在2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照條件光照

43、條件 下培養(yǎng)下培養(yǎng)18d18d，誘導(dǎo)得到愈傷組織，每，誘導(dǎo)得到愈傷組織，每1818天繼代天繼代 一次。一次。 第72頁/共84頁 (2)(2)大蒜懸浮細胞培養(yǎng)大蒜懸浮細胞培養(yǎng) 將上述在半固體將上述在半固體MSMS培養(yǎng)基上培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)18d18d的愈的愈 傷組織，在無菌條件下轉(zhuǎn)入含有傷組織，在無菌條件下轉(zhuǎn)入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D 和和 1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA （芐基腺嘌呤）（芐基腺嘌呤） 的液體的液體MSMS 培養(yǎng)基中，加入滅菌的玻璃珠，培養(yǎng)基中，加入滅菌的玻璃珠，2525， 600lux600lux，12h/d12h/d光照條件下震蕩培養(yǎng)光照條件下震蕩培養(yǎng)18d18d，使，使 愈傷組織分散成為小細胞團或單細胞。愈傷組織分散成為小細胞團或單細胞。 然后在無菌條件下，經(jīng)過篩網(wǎng)將小細胞然后在無菌條件下，經(jīng)過篩網(wǎng)將小細胞 團或單細胞轉(zhuǎn)入含有團或單細胞轉(zhuǎn)入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 1.2mg/L 6-BA 6-BA 的液體的液體MSMS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，25,600lux25,600lux， 12h/d12h/d光照條件下震蕩培養(yǎng)光照條件下震蕩培養(yǎng)18d18d。 第73頁/共84頁 (3)(3)酶的分離純化酶的分離純化 細胞培養(yǎng)完成后，收集細胞