蛋白質(zhì)的定量測定試驗(yàn)報(bào)告

1、實(shí)驗(yàn)名稱(Title ofExperimetn)蛋白質(zhì)的定量測定(Folin -酚試劑法)實(shí)驗(yàn)日期(Date ofExperiment)XXXX實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)(Lab No.)XXXX合作者(Partner)XXXX指導(dǎo)老師(Instructor)XXXX總分仃 otal Score)教師簽名(Signature)批改日期(Date)、實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)1.0實(shí)驗(yàn)?zāi)康某醪搅私飧鞣N蛋白質(zhì)含量測定的常用方法。掌握Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理及熟悉和掌握實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。掌握用excel制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)管方法求樣品溶液中待測定物 質(zhì)含量。1.1實(shí)驗(yàn)原理1.1.1總體概述Folin-酚試劑法是

2、經(jīng)過科學(xué)家改進(jìn)的測定蛋白質(zhì)含量的方法，F(xiàn)olin首創(chuàng)這種方法：利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基(酚基)還原酚試劑(磷鎢酸-磷鉬酸)起藍(lán)色反應(yīng)。而后，Lowry對此法進(jìn)行了改進(jìn)，先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑 反應(yīng)，提高了靈敏度，靈敏度的范圍為：20: 250 g,故使得實(shí)驗(yàn)的精確度大大提高，但同時(shí)也存在著干擾物質(zhì)多、費(fèi)時(shí)、操作嚴(yán)格計(jì)時(shí)等問題。1.1.2雙縮脲反應(yīng)2在堿性溶液中，雙縮脲(H2NOC NH CONH 2)能和Cu作用，發(fā)生配位 反應(yīng)，形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物，即為雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，故在堿性溶液中，蛋白質(zhì)的分子中2 2肽鍵能和堿性銅試劑中的Cu作

3、用，生成紫紅色的蛋白質(zhì)-Cu復(fù)合物。對于蛋白質(zhì)的 測定來說，這一步是基礎(chǔ)，這也是 Folin-酚法的基礎(chǔ)原理。1.1.3 Foli n- 酚顯色反應(yīng)Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易背酚類化合物_ 2還原而呈現(xiàn)藍(lán)色。酪氨酸（Tyr）含有酚羥基，故蛋白質(zhì)- Cu復(fù)合物含有的酪氨酸或色 氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。在一定的濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系。故可以利用上 述兩種反應(yīng)通過分光光度法測定待測樣品的蛋白質(zhì)含量。1.1.4分光光度法測定樣品的蛋白質(zhì)的含量本實(shí)驗(yàn)以上述兩個反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，再通過設(shè)置空白對照組，標(biāo)準(zhǔn)管中設(shè)置蛋白

4、標(biāo)準(zhǔn)液的一系列濃度梯度（0.2mL, 0.4mL，0.6mL，0.8mL）通過分光光度計(jì)測定 吸光度，從而獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品管通過測定的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到較為準(zhǔn)確 對應(yīng)的含量。1.2實(shí)驗(yàn)材料1.2.1實(shí)驗(yàn)樣品 血清稀釋液（正常人血清稀釋300倍）1.2.2實(shí)驗(yàn)試劑 200 g/ml牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（BSA）； 堿性硫酸銅溶液（組成：堿溶液與硫酸銅溶液按50:1混合而成，使用時(shí)該溶液必須新鮮配制，當(dāng)日有效）；Folin-酚試劑（配制過程較為復(fù)雜）注：此次實(shí)驗(yàn)所用的試劑全部已由老師制備好，所以無配制過程，但需知道配制流程，可查閱實(shí)驗(yàn)書P105q123實(shí)驗(yàn)儀器及器材 V-1100可見光分光

5、光度計(jì); 恒溫水浴箱； 試管6支、試管架； 加樣槍、加樣槍架。1.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.1實(shí)驗(yàn)流程1.3.2實(shí)驗(yàn)步驟步驟操作（1）反應(yīng)體系設(shè)置取6只潔凈的試管，利用加樣槍按要求量取相應(yīng)量的溶液，混合均勻（各試管的需加入的試劑和量見下表）：試劑空白管標(biāo)準(zhǔn)管樣品管123456牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液00.20.40.60.80樣品液000000.5蒸餾水1.00.80.60.40.20.5每隔一分鐘，依次往1號試管到6號試管中加入2mL的堿性（2）雙縮脲反應(yīng) 硫酸銅溶液，搖勻并記錄每支試管的加入硫酸銅時(shí)間， 室溫靜置10min(3) Folin-酚反應(yīng) 將靜置時(shí)間達(dá)到10min中的試管中，加入0.20mL的

6、Folin-酚試劑，快速搖勻(一般在2s以內(nèi))。 在40 C下水浴加熱10min鐘同樣需計(jì)時(shí)。 10min鐘后取出冷卻至室溫。(4)比色測定 轉(zhuǎn)動波長旋鈕，調(diào)制500.0nm,按“ mode鍵切換到T檔， 分別將1-6號試管中混合液放入比色杯中利用1號試管為空 白，校置100； 調(diào)至A檔，依次測定2-6試管的吸光度，并讀取數(shù)據(jù)。 重復(fù)操作，再讀取數(shù)據(jù)2次，并記錄。數(shù)據(jù)表格見表1(5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線利用測得的數(shù)據(jù)，繪制以A500值為縱坐標(biāo)，牛血清清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)的準(zhǔn)備曲線，具體繪制利用excel制作，結(jié)果可見圖2(6)測樣品蛋白質(zhì)含量根據(jù)樣品管(6管)的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到對 應(yīng)的蛋

7、白質(zhì)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)(300)，得出每毫升未稀 釋血清含蛋白質(zhì)的微克數(shù)，即每毫升血清中蛋白質(zhì)的微克數(shù) (mg/ml)。血清蛋白濃度(g/ml)=樣品蛋白質(zhì)濃度& 300參考：正常人血清蛋白濃度范圍為 6080 g/L。1.3.3注意事項(xiàng) 試劑要求：實(shí)驗(yàn)所需的試劑必須是新鮮配制，不然會存在被空氣及其他物質(zhì) 氧化還原的情況，干擾實(shí)驗(yàn)的測定。 控制時(shí)間：Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間。嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟的操作，規(guī)定的時(shí)間是多少就多少。水浴時(shí)間也不宜過長。同時(shí), 在最后從水浴加熱后取出冷卻后，需及時(shí)的進(jìn)行比色測定。防止混合液中物質(zhì)發(fā)生系列 變化和反應(yīng)。 加入Foli

8、n-酚試劑后，需要馬上混合搖勻，防止磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞。 干擾物質(zhì)的影響：凡干擾雙縮脲反應(yīng)的基團(tuán)，均可干擾Folin-酚反應(yīng)。這些物質(zhì)在所測樣品中含量較高時(shí)，則需做校正曲線。若所測的樣品中含硫酸銨，則需增加碳酸鈉一氫氧化鈉濃度即可顯色測定。若樣品酸度較高，也需提高碳酸鈉一氫氧化鈉濃 度1 2倍，這樣即可糾正顯色后色淺的弊病。 繪制曲線要求：作過原點(diǎn)的直線或光滑連續(xù)的曲線，該線表示實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的平均 變動情況，因此該線不需全部通過各點(diǎn)，但應(yīng)盡量使未經(jīng)過線上的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均勻分布在曲 線或直線兩側(cè)。（電腦Excel繪圖，可以不考慮） 操作要按照實(shí)驗(yàn)步驟，一步一步來，防止操作問題導(dǎo)致的操作誤差的出現(xiàn)等。二

9、、實(shí)驗(yàn)記錄2.1實(shí)驗(yàn)條件材料及試劑：本次實(shí)驗(yàn)的試劑和材料均是實(shí)驗(yàn)室配制好的，比例和濃度同實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)， 故不再贅述。實(shí)驗(yàn)時(shí)間表：總表實(shí)驗(yàn)步驟消耗時(shí)間混合溶液未計(jì)時(shí)滴加溶液靜置10mi n加Folin-酚試劑、水浴10mi n室溫冷卻27min等待20min比色測定6min附表項(xiàng)目時(shí)刻表試管1試管2試管3試管4試管5試管6加硫酸銅8 42” 098 43” 208 44” 298 45” 458 46” 558 47” 55水浴8 52” 098 53” 208 54” 298 55” 458 56” 558 57” 55冷卻等待9 02” 099 03” 229 04” 299 05” 459 0

10、6” 559 08” 00操作技巧： 在這一次的實(shí)驗(yàn)中，關(guān)鍵的要點(diǎn)在于滴加 Folin-酚試劑的搖勻，必須快速搖勻， 保證反應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行。振蕩試管時(shí)，振蕩的正確方法是用手腕的力左右擺動，使試管中液 體混合均勻且不漏出。最后放入到水浴中加熱。 在分光比色的時(shí)候，測量一次后重新凋零，不能繼續(xù)測量等。操作失誤：全部實(shí)驗(yàn)過程中，就出現(xiàn)了一次失誤，即在試管 4加入Folin-酚試劑，充分搖勻，在放 入水浴加熱之間，部分液體由于磕碰而濺出。其余操作嚴(yán)格按照要求一步步完成，理論 不存在著失誤。分析：Folin-酚與液體已經(jīng)混合均勻并反應(yīng)，在后面的水浴加熱后，只是影響到了 整體的試管4的反應(yīng)后得到的溶液量，而不

11、影響顏色的變化及最后的比色測定，故該失 誤不會對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生測定的偏差。2.2實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象 在滴加硫酸銅溶液后，搖勻，產(chǎn)生較多的黏性氣泡且附著在液體表面。液體顏色 變化不深。 在滴加Folin-酚試劑水浴加熱后，除試管1為淡黃色外，其余試管均成不同的藍(lán) 色。具體看下圖：圖一水浴后各試管的情況圖分析：標(biāo)準(zhǔn)液的試管中（2-5）藍(lán)色不斷加深，同實(shí)際的標(biāo)準(zhǔn)液的含量多少正相關(guān)， 而試管6的顏色不深，在1-2試管之間，根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理初步可以判定的是：該樣品液的 蛋白質(zhì)含量將不會在60-80g/L之間，而是在0-40g/L。即實(shí)驗(yàn)存在一定的問題，詳見結(jié) 果的分析與討論。2.3實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)本次實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)是在500nm

12、的波長下，各試管混合液的吸光度值，結(jié)果見下表1表1 500nm波長吸光度值記錄測定次數(shù)各管吸光度值A(chǔ)5002345610.3530.5610.7440.9380.1722 0.3500.5620.7440.9380.1723 0.3510.5620.7430.9380.172各管平均值A(chǔ) 500三、結(jié)果與討論3.1數(shù)據(jù)處理3.1.1利用原始數(shù)據(jù)，可得到各管的平均值：2 管：A 500=( 0.353+0.350+0.351)/3=0.3513 ；3 管：A 500=( 0.561+0.562+0.562)/3=0.5617 ；依次得到4-6管的吸光度值如下所示:測定次數(shù)各管吸光度值A(chǔ)50023

13、456各管平均值A(chǔ) 5000.35130.56170.74370.93800.17203.1.2 Excel繪制蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線PPt所示步驟，最終得到如下結(jié)果:牛血清清蛋白濃度吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2從圖中我們可以看到線性方程：y 0.0062?x , R 0.9659將樣品溶液的吸光度（即y值）代入方程，可得出樣品濃度（即x值）；由相關(guān)指數(shù)值R2 可看出誤差大小。y 0.1720 x 0.1720 0.0062 27.74 g/mL血清蛋白濃度（g/ml）= 樣品蛋白質(zhì)濃度x 2X 300故得血清蛋白濃度為16.65g/L。3.2結(jié)果由上數(shù)據(jù)處理可知，最后

14、的待測樣品的蛋白質(zhì)含量為16.65g/L。而真正的正常人血 清蛋白濃度范圍為6080 g/L。因此，存在一定問題，具體分析見 3.3分析與討論。3.3分析與討論首先，我們回顧了整個操作過程，在整個過程中，我們基本都是按照要求操作，并不存在著明顯的操作問題。通過上面水浴加熱后的圖可以明顯看到，結(jié)果的確應(yīng)該在 0-20g/L之間。同時(shí)我們與和我們一樣使用試劑的組討論后發(fā)現(xiàn)，他們的結(jié)果也是在10幾左右；同時(shí)，很多組測出的結(jié)果都偏低，故可以初步判定結(jié)果的測量方式上不存在明 顯冋題。其次，回顧全部過程的原理，我們猜測可能存在的造成結(jié)果低的情況為： 在室溫冷卻后，實(shí)驗(yàn)室沒有空余的分光光度計(jì)，排隊(duì)時(shí)間應(yīng)該是

15、全部小組中最長 的，基本花去30多分鐘。而這也導(dǎo)致了最后的顯色增強(qiáng)（其具體的顯色原因可能為物 質(zhì)間的復(fù)雜反應(yīng)導(dǎo)致）從而使得最后的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率增大，導(dǎo)致測定的標(biāo)準(zhǔn)的樣品液 蛋白質(zhì)含量的下降。即AB，如圖所示： 分光光度計(jì)的比色杯清晰不干凈，存在蒸餾水的稀釋，且稀釋的總體效果是使樣 品液的含量測定下降。 開始實(shí)驗(yàn)的試管清洗的不充分，可能存在部分的雜質(zhì)，導(dǎo)致顯色反應(yīng)的增強(qiáng)。 分光光度計(jì)的幾個比色杯透明面被碰到， 影響到了液體的吸光度，吸光度的下降, 使得樣品液的測定值偏低。最后，有可能在以后的時(shí)間里，可以重新做該實(shí)驗(yàn)，從多方面來驗(yàn)證自己的分析。 多和老師同學(xué)交流，得到較好的結(jié)果3.4復(fù)習(xí)思考題參考資料來源：，主編1、試述Folin-酚試劑法的優(yōu)點(diǎn)？ 答:根據(jù)所學(xué)及所查知識，優(yōu)點(diǎn)總結(jié)如下:測定蛋白質(zhì)靈敏度高，較為準(zhǔn)確，可檢測最低蛋白質(zhì)量達(dá)5 g ,通常范圍為：20: 250 g在生物化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。 操作雖受時(shí)間限定，但是只需加入兩種試劑，即可起作用，總體上說，操作簡單， 原理清晰易懂。 適用性廣，除測定蛋白質(zhì)的含量，還可特定的適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。2、應(yīng)用本方法有哪些干擾作用？為什么？應(yīng)如何注意？答:對雙縮脲反應(yīng)有干擾的離子，同樣干擾 Lowry反應(yīng)，且影響還要大得多。酚類、 檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。原因是：Lowry